Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Окрашивание цитоплазматического Ca2+ с fluo-4/AM в яблочной мякоти

4.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62526

⸱

6 ноября 2021 г.

 ,  ,  , 
1College of Horticulture, Qingdao Agricultural University

В этой статье

Краткое содержание

Изолированные протопласты клеток яблочной мякоти нагружали флуоресцентным реагентом кальция для обнаружения цитоплазматической концентрации Ca2+.

Аннотация

Цитозольный Ca2+ играет ключевую роль в развитии растений. Кальциевая визуализация является наиболее универсальным методом обнаружения динамических изменений Ca2+ в цитоплазме. В этом исследовании мы получили жизнеспособные протопласты клеток пульпы путем ферментативного гидролиза. Изолированные протопласты инкубировали с маломолекулярным флуоресцентным реагентом (Fluo-4/AM) в течение 30 мин при 37 °C. Флуоресцентные зонды успешно окрашивали цитозольный Ca2+, но не накапливались в вакуолях. La3+,блокатор каналов Ca2+, снижение интенсивности цитоплазматической флуоресценции. Эти результаты свидетельствуют о том, что Fluo-4/AM может быть использован для обнаружения изменений цитозольного Ca2+ в мякоти плода. Таким образом, мы представляем метод эффективного выделения протопластов из клеток мякоти плода и обнаружения Ca2+ путем загрузки маломолекулярного флуоресцентного реагента кальция в цитоплазму клеток пульпы.

Введение

Ca2+ играет важную роль в трансдукции сигналов растений иметаболизме 1,2. Кроме того, он регулирует признаки качества плодов3,4,включая твердость, содержание сахара и восприимчивость к физиологическим нарушениям при хранении5,6. Цитоплазматический Ca2+ играет важную роль в сигнальной трансдукции и регулирует рост и развитие растений7. Нарушение клеточного гомеостаза кальция может вызвать горькую косточку в яблоках8,заболевание коричневых пятн у груш9и пуповинную гниль у томатов10,влияющих на качество плодов и вызывающих серьезные экономические потери3,11. Кальциевая визуализация имеет достаточное пространственное и временное разрешение и является важным методом наблюдения динамики Ca2+ в живых клетках12,13.

В настоящее время существует два основных метода внутриклеточной визуализации кальция в живых клетках: один использует химические маломолекулярные флуоресцентные зонды14,а другой - датчик кодирования генов (GECI)15,16. Учитывая сложность создания стабильной трансгенной системы у фруктовых деревьев и более длительное развитие плодов, GECIS не подходит для флуоресцентной визуализации фруктов Ca2+.

Маломолекулярные флуоресцентные зонды, такие как Fluo-4/ AM, имеют особое преимущество: их форма эфира AM (проницаемое в клетки производное ацетоксиметилового эфира) может быть легко загружена массой в живые клетки без необходимости трансфекции, что делает его гибким, быстрым и нецитотоксичным17. Fluo-4/AM может быть успешно загружен в пыльцевую трубку Pyrus pyrifolia18 и Petunia,19, а также в защитные клетки20 и корневые волосы Arabidopsis21.

В настоящее время имеется мало сообщений о окрашивание кальциевой флуоресценцией клетокпульпы 22. Как важный минеральный элемент, кальций играет ключевую роль в росте и контроле качества плодов деревьев, таких как яблоки. Яблони признаны во всем мире важным экономическим видом, а яблоки считаются здоровой пищей23. В этом исследовании мы получили жизнеспособные протопласты из мякоти плодов яблок путем ферментативного гидролиза, а затем загрузили маломолекулярные флуоресцентные реагенты в цитоплазму для обнаружения Ca2+.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Экстракция протопластов

  1. Готовят основной раствор: 20 мМ CaCl2,5 мМ2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты и 0,4 М D-сорбита.
    ПРИМЕЧАНИЕ: РН основного раствора доводили до 5,8 с буфером 0,1 М Триса, фильтроввали через водорастворимые фильтры 0,22 мкм и хранили при 4°С.
  2. Приготовить ферментативный раствор: смешать 0,3% (мас./об.) мацероцима R-10 и 0,5% (мас./об.) целлюлазы R-10 с основным раствором.
  3. Добавьте 0,5 мл ферментативного раствора в пробирку центрифуги 1,5 мл. Соберите здоровое и спелое яблоко. Затем нарежьте мякоть на размер 10 х 5х 1 мм 3(рисунок 1А-1С).
  4. Поместите кусочки мякоти плодов яблока в центрифужную трубку размером 1,5 мл, содержащую ферментативный раствор, а затем закройте трубку(рисунок 1D).
  5. Инкубируют трубку при 28 °C в течение 1 ч, встряхивая со скоростью 70 об/мин в шейкере в темноте.
  6. Кусочки мякоти вымойте. Аспирировать весь ферментативный раствор и затем добавить 0,5 мл основного раствора.
  7. Центрифуга при 300 х г в течение 2 мин при комнатной температуре.
  8. Для получения суспензии протопласта аспирируют раствор со дна трубки центрифуги(рисунок 1Е).

2. Флуоресцентное окрашивание ионами кальция маломолекулярных

  1. Приготовьте загрузочный раствор Fluo-4/AM с 2 мМ Fluo-4/AM, 20% F-127 и 10x фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS: 80 мМ Na2HPO4,1,36 М NaCI, 20 мМ KH2PO4и 26 мМ KCI) в соотношении 1:1:2.
  2. Добавьте 1 мкл загрузочного раствора Fluo-4/AM к 99 мкл суспензии протопласта, присутствующей в трубках центрифуги объемом 1,5 мл. Убедитесь, что конечная концентрация флуоресцентного красителя составляет 5 мкМ. Смешайте раствор и закройте трубку.
  3. Обработка La3+: Приготовьте 100 мкМ раствора La3+ с 98 мкл суспензии протопласта, 1 мкл 10 мМ La3+и 1 мкл раствора Fluo-4/AM с нагрузкой. Перемешайте раствор и закройте трубку.
  4. Инкубировать в течение 30 мин при 37 °C в темноте.
  5. Промыть протопласты центрифугированием при 300 х г в течение 2 мин при комнатной температуре. Аспират 70 мкл раствора и добавляют 70 мкл основного раствора.
  6. Инкубируют суспензию протопласта при 37 °C в течение 30 мин до полной деэтерификации.
  7. Аспирировать 15 мкл суспензии протопласта и капать на горку.
  8. Наблюдение под флуоресцентным микроскопом(Дополнительный рисунок S1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте цветную камеру с высокой чувствительностью, т.е. CMOS-сенсор 3,2 Мп (2048 x 1536) с разрешением 3,45 мкм пикселей.
  9. Выберите канал GFP для создания изображений (20x). Установите яркость на 0,5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Освещение - это светодиодные кубы с регулируемой интенсивностью и встроенным набором фильтров с твердым покрытием. Длина волны возбуждения Fluo-4/AM составляет 490 нм.

3. Анализ жизнеспособности протопласта

  1. Приготовьте раствор флуоресцеина диацетата (FDA): растворите FDA в ацетоне до тех пор, пока конечная концентрация не сойдёт 1 мг/мл.
  2. Готовят в FDA рабочий раствор с 1 мкл запасного раствора и 99 мкл ацетона.
  3. Добавьте 1 мкл рабочего раствора FDA к 99 мкл суспензии протопласта. Перемешайте раствор, пипетируя вверх и вниз, а затем закройте трубку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация FDA составляет 100 мкг/л.
  4. Окрашивать при комнатной температуре в течение 5 мин в темноте.
  5. Подготовьте слайды и наблюдайте под флуоресцентным микроскопом.
  6. Выберите канал GFP для визуализации(рисунок 1F).

4. Анализ изображений

  1. Анализируйте полученные изображения с помощью программного обеспечения для анализа изображений и электронных таблиц (например, Image-Pro Plus и Excel 2010).
  2. Выберите два вертикальных диаметра из протопластов для расчета интенсивности флуоресценции(дополнительный рисунок S2). Измеряли интенсивность флуоресценции всех протопластов при различных методах лечения. Для окончательной обработки используйте программное обеспечение для редактирования фотографий.

5. Статистический анализ

  1. Выполнение статистического анализа с помощью статистического программного обеспечения(дополнительный рисунок S3). Данные представлены в средней ± УР. Тест студента t-testиспользовался для анализа различий между экспериментальными группами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Следуя описанному выше протоколу, мы использовали ферментативный метод для получения жизнеспособных протопластов из пульпы(рисунок 1). Некоторые протопласты имели вакуоли, в то время как другие этого не делали. В то время как протопласты не проявляли флуоресценции, когда флуоресцентный индикатор Ca2+ не был загружен в них. Когда Fluo-4/AM был загружен в протопласты, цитоплазма, но не вакуоль, стала флуоресцентной(рисунок 2). Этот результат показал, чт...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании жизнеспособные протопласты были получены ферментативным гидролизом. Отметим, что для этого способа требуются свежие яблоки. Настоящий протокол позволяет быстро изолировать большое количество протопластов из мякоти плодов для использования в научных исследованиях. Применимость этого метода не ограничивается «Fuji»; протопласты яблочной мякоти 'Dounan' и 'Honey Crisp' также могут быть извлечены по тому же протоколу(Дополнительный рисунок S4). Раствор протопласта после ферментализа содер...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов с содержанием данной статьи.

Благодарности

Эта работа была поддержана Проектом по улучшению сельскохозяйственных сортов провинции Шаньдун (2019LZGC007) и инновационной командой по выращиванию фруктовых деревьев современной технологической системы сельскохозяйственной промышленности Шаньдуна (SDAIT-06-05).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10× фосфатно-солевой буферныйSolarbioP1022PBS (фосфатно-буферный раствор) представляет собой фосфатный буферный раствор, который может обеспечить относительно стабильную ионную среду и буферную способность pH. Это буферный раствор соли, часто используемый в биологии для молекулярного клонирования и культивирования клеток. pH составляет 7,4.
2-(N-морфолино)этансульфоновая кислотаSolarbioM8010Биологический буфер
CaCl2· 2H2OSolarbioC8370Дигидрат хлорида кальция представляет собой белое или серое химическое вещество, в основном в гранулированной форме.
Целлюлаза R-10Yakult HonshaMX7352Разрушает клеточные стенки растений.
D-сорбитSolarbioS8090обладает хорошими увлажняющими свойствами, предотвращает высыхание, препятствует кристаллизации сахара, соли и т.д.
F-127Thermo Fisher ScientificP6867Pluronic F-127 представляет собой неионогенное поверхностно-активное вещество полиол (молекулярная масса около 12500 дальтон), который, как было установлено, способствует растворению нерастворимых в воде красителей и других материалов в физиологических средах.
FDAThermo Fisher ScientificF1303FDA представляет собой проникающий в клетки субстрат эстеразы, который может служить зондом жизнеспособности, измеряющим как ферментативную активность, необходимую для активации его флуоресценции, так и целостность клеточной мембраны, которая требуется для внутриклеточного удержания их флуоресцентного продукта.
Fluo-4/AMThermo Fisher ScientificF14201Зеленый флуоресцентный индикатор кальция Fluo-4/AM является улучшенной версией индикатора кальция Fluo-3/AM. Fluo-4/AM загружается быстрее и ярче при той же концентрации. Его можно хорошо возбудить с помощью аргонового ионного лазера с длиной волны 488 нм.
Флуоресцентный микроскопThermo FisherEVOS Auto 2Наблюдайте за флуоресцентным изображением.
Мацерозим R-10Yakult HonshaMX7351Разрушает растительную ткань до разделения отдельных клеток.
TrisSolarbioT8060Он широко используется для приготовления буферов в экспериментах по биохимии и молекулярной биологии.

Ссылки

  1. Hocking, B., Tyerman, S. D., Burton, R. A., Gilliham, M. Fruit calcium: Transport and physiology. Frontiers in Plant Science. 7, 569(2016).
  2. Li, J., Yang, H. -q, Yan, T. -l, Shu, H. -r Effect of indole butyric acid on the transportation of stored calcium in Malus hupehensis rhed. Seedling. Agricultural Sciences in China. 5 (11), 834-838 (2006).
  3. Gao, Q., Xiong, T., Li, X., Chen, W., Zhu, X. Calcium and calcium sensors in fruit development and ripening. Scientia Horticulturae. 253, 412-421 (2019).
  4. Barrett, D. M., Beaulieu, J. C., Shewfelt, R. L. Color, flavor, texture, and nutritional quality of fresh-cut fruits and vegetables: desirable levels, instrumental and sensory measurement, and the effects of processing. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 50 (5), 369-389 (2010).
  5. Deell, J. R., Khanizadeh, S., Saad, F., Ferree, D. C. Factors affecting apple fruit firmness--a review. Journal- American Pomological Society. 55 (1), 8-27 (2001).
  6. Johnston, J., Hewett, E., Hertog, M. A. T. M. Postharvest softening of apple (Malus domestica) fruit: A review. New Zealand Journal of Experimental Agriculture. 30 (3), 145-160 (2002).
  7. Demidchik, V., Shabala, S., Isayenkov, S., Cuin, T. A., Pottosin, I. Calcium transport across plant membranes: mechanisms and functions. New Phytologist. 220 (1), 49-69 (2018).
  8. Miqueloto, A., et al. Mechanisms regulating fruit calcium content and susceptibility to bitter pit in cultivars of apple. Acta horticulturae. 1194 (1194), 469-474 (2018).
  9. Kou, X., et al. Effects of CaCl2 dipping and pullulan coating on the development of brown spot on 'Huangguan' pears during cold storage. Postharvest Biology and Technology. 99, 63-72 (2015).
  10. Vinh, T. D., et al. Comparative analysis on blossom-end rot incidence in two tomato cultivars in relation to calcium nutrition and fruit growth. The Horticulture Journal. 87 (1), 97-105 (2018).
  11. Yamane, T. Foliar calcium applications for controlling fruit disorders and storage life in deciduous fruit trees. Japan Agricultural Research Quarterly. 48 (1), 29-33 (2014).
  12. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  13. Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T. J., Walker, S., Sanderson, M. J. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. CSH Protocols. 2013 (2), 83(2013).
  14. Hirabayashi, K., et al. Development of practical red fluorescent probe for cytoplasmic calcium ions with greatly improved cell-membrane permeability. Cell Calcium. 60 (4), 256-265 (2016).
  15. Krebs, M., et al. FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca(2)(+) dynamics. Plant Journal. 69 (1), 181-192 (2012).
  16. Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca(2)(+) indicators. Science. 333 (2), 1888-1891 (2011).
  17. Gee, K. R., et al. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca2+-indicator dyes. Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).
  18. Qu, H., Xing, W., Wu, F., Wang, Y. Rapid and inexpensive method of loading fluorescent dye into pollen tubes and root hairs. PLoS One. 11, 0152320(2016).
  19. Suwińska, A., Wasąg, P., Zakrzewski, P., Lenartowska, M., Lenartowski, R. Calreticulin is required for calcium homeostasis and proper pollen tube tip growth in Petunia. Planta. 245 (5), 909-926 (2017).
  20. Sun, L., et al. NADK2 positively modulates abscisic acid-induced stomatal closure by affecting accumulation of H2O2, Ca2+ and nitric oxide in Arabidopsis guard cells. Plant Science. 262, 81-90 (2017).
  21. Niu, Y. F., et al. Magnesium availability regulates the development of root hairs in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Plant Cell and Environment. 37 (12), 2795-2813 (2014).
  22. Qiu, L., Wang, Y., Qu, H. Loading calcium fluorescent probes into protoplasts to detect calcium in the flesh tissue cells of Malus domestica. Horticulture Research. 7, 91(2020).
  23. Boyer, J., Liu, R. H. Apple phytochemicals and their health benefits. Nutrition Journal. 3 (1), 5(2004).
  24. Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. Measurement of intracellular calcium. Physiological Reviews. 79 (4), 1089-1125 (1999).
  25. Qu, H., Shang, Z., Zhang, S., Liu, L., Wu, J. Identification of hyperpolarization-activated calcium channels in apical pollen tubes of Pyrus pyrifolia. New Phytologist. 174 (3), 524-536 (2007).
  26. Hadjantonakis, A. K., Pisano, E., Papaioannou, V. E. Tbx6 regulates left/right patterning in mouse embryos through effects on nodal cilia and perinodal signaling. PLoS One. 3 (6), 2511(2008).
  27. DeSimone, J. A., et al. Changes in taste receptor cell [Ca2+]i modulate chorda tympani responses to salty and sour taste stimuli. Journal of Neurophysiology. 108 (12), 3206-3220 (2012).
  28. Kao, J. P., Harootunian, A. T., Tsien, R. Y. Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by fluo-3. Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 8179-8184 (1989).
  29. Merritt, J. E., Mccarthy, S. A., Davies, M., Moores, K. E. Use of fluo-3 to measure cytosolic Ca2+ in platelets and neutrophils. Loading cells with the dye, calibration of traces, measurements in the presence of plasma, and buffering of cytosolic Ca2. Biochemical Journal. 269 (2), 513-519 (1990).
  30. Li, W., et al. A comparative study on Ca content and distribution in two Gesneriaceae species reveals distinctive mechanisms to cope with high rhizospheric soluble calcium. Frontiers in Plant Science. 5 (5), 647(2014).
  31. Zhang, W., Rengel, Z., Kuo, J. Determination of intracellular Ca2+ in cells of intact wheat roots: loading of acetoxymethyl ester of Fluo-3 under low temperature. Plant Journal. 15 (1), 147-151 (1998).
  32. Qu, H., Jiang, X., Shi, Z., Liu, L., Zhang, S. Fast loading ester fluorescent Ca2+ and pH indicators into pollen of Pyrus pyrifolia. Journal of Plant Research. 125 (1), 185-195 (2012).
  33. Wang, Y., et al. Disruption of actin filaments induces mitochondrial Ca2+ release to the cytoplasm and [Ca2+]c changes in Arabidopsis. root hairs. BMC Plant Biology. 10, 53(2010).
  34. Fujimori, T., Jencks, W. P. Lanthanum inhibits steady-state turnover of the sarcoplasmic reticulum calcium ATPase by replacing magnesium as the catalytic ion. Journal of Biological Chemistry. 265 (27), 16262-16270 (1990).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Fluo 4 AM
Окрашивание цитоплазматического Ca2+ с fluo-4/AM в яблочной мякоти
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.