Методическая статья

Визуализация и количественная оценка интактных нейрональных дендритов с помощью очистки тканей CLARITY

DOI:

10.3791/62532

⸱

20 апреля 2021 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics and Genomics, Baylor College of Medicine, 2Medical Scientist Training Program, Baylor College of Medicine, 3Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дендритная морфология нейронов часто лежит в основе функции. Действительно, многие болезненные процессы, влияющие на развитие нейронов, проявляются с морфологическим фенотипом. Этот протокол описывает простой и мощный метод анализа интактных дендритных беседок и связанных с ними шипов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Активность мозга, электрохимические сигналы, передаваемые между нейронами, определяется паттернами связности нейронных сетей, а также морфологией процессов и подструктур внутри этих нейронов. Таким образом, многое из того, что известно о функции мозга, возникло наряду с разработками в технологиях визуализации, которые позволяют глубже понять, как нейроны организованы и связаны в мозге. Улучшения в очистке тканей позволили получить визуализацию толстых срезов мозга с высоким разрешением, облегчая морфологическую реконструкцию и анализ нейронных субструктур, таких как дендритные беседки и шипы. В тандеме достижения в области программного обеспечения для обработки изображений предоставляют методы быстрого анализа больших наборов данных изображений. Эта работа представляет собой относительно быстрый метод обработки, визуализации и анализа толстых срезов меченой нервной ткани с высоким разрешением с использованием очистки тканей CLARITY, конфокальной микроскопии и анализа изображений. Этот протокол облегчит усилия по пониманию паттернов связности и морфологии нейронов, которые характеризуют здоровый мозг, и изменений в этих характеристиках, которые возникают в больных состояниях мозга.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Понимание пространственной организации, паттернов связности и морфологии сложных трехмерных биологических структур имеет важное значение для разграничения функций конкретных клеток и тканей. Это особенно верно в нейробиологии, в которой огромные усилия были посвящены построению нейроанатомических карт центральной нервной системы высокого разрешения1,2. Тщательное изучение нейронов, составляющих эти карты, дает различные морфологии, со связями и местоположениями, которые отражают функцию этих разнообразных наборов нейронов3,4. Более того, исследование субклеточных структур, особенно дендритных шипов, может информировать о зрелости синапсов, тем самым отражая процессы развития и неврологические болезненные состояния5,6,7. Таким образом, подходы, которые улучшают разрешение и пропускную способность изображения, необходимы для лучшего понимания функции мозга во всех масштабах.

Последние достижения расширили молекулярно-генетический инструментарий для маркировки и манипулирования популяциями нейронов. Разработка новых флуоресцентных маркеров в сочетании с новыми методами введения этих маркеров в нейроны позволяет дифференциально маркировать популяции взаимодействующих нейронов в пределах одного и того же образца животного или мозга8,9,10,11. Поскольку свет рассеивается непрозрачными липидами и, учитывая высокое содержание липидов в мозговой ткани, визуализация нейронных популяций в основном была ограничена тонкими участками или опиралась на передовые методы микроскропии (например, конфокальную, многофотонную и светоливую микроскопию) для изображения глубоких структур. Тем не менее, эти усилия были значительно подкреплены достижениями в методах очистки тканей. Прозрачный липидообменный акриламид-гибридизированный Rigid Imaging/immunostaining/insitu гибридизация-совместимый Tissue-hYdrogel (CLARITY) является одним из таких методов, в котором ткани, представляющие интерес, вводят гидрогелевые мономеры (акриламид и бис-акриламид), а затем промывают моющими средствами12. Мономеры гидрогеля гибридизируются для создания стабильного 3D-гидрогелевого каркаса, который оптически прозрачен и проницаем для этикеток макромолекул. Нуклеиновые кислоты и белки поддерживаются в гибридизированной матрице, тогда как липиды удаляются моющими средствами(рисунок 1). Это приводит к стабильной ткани, которая достаточно жесткая, чтобы поддерживать первоначальную форму и ориентацию клеток и нелипидных молекул, в то время как оптически достаточно прозрачна, чтобы легко визуать глубокие структуры с высоким разрешением. Это поддержание структуры и ориентации ткани позволяет визуализировать толстые срезы, тем самым сохраняя межклеточные связи и пространственные отношения. Более того, поскольку местоположение и доступность белков и нуклеиновых кислот сохраняется в процессе очистки, очищенные ткани способны удерживать маркеры на основе экспрессии, а также экзогенные метки. Таким образом, CLARITY позиционируется как мощный метод визуализации большого количества глубоких структур мозга и связей между этими структурами с высоким разрешением.

Использование CLARITY значительно улучшает подходы к визуализации нейронных популяций. Этот метод особенно искусен в создании больших объемов данных визуализации. CLARITY хорошо работает с несколькими формами флуоресценции на основе белка. Этот протокол использует лентивирусный подход к разреженной маркировке клеток с помощью EGFP и tdTomato; однако обычно используются трансгенные репортерные аллели, экспрессирующие tdTomato или EGFP для маркировки клеток для реконструкции. Важно выбрать флуорофор, который является как фотостабийным, так и ярким (например, EGFP или tdTomato). Кроме того, использование сильного промотора для экспрессии флуорофора обеспечивает превосходную контрастность и качество изображения. Недостатки этой методики возникают, так как правильный анализ такого большого объема данных может быть как трудоемким, так и трудоемким. Специализированные микроскопы могут помочь повысить пропускную способность и уменьшить рабочую нагрузку. Тем не менее, создание, владение и / или эксплуатация передовых микроскопов часто являются непомерно дорогими для многих лабораторий. Эта работа представляет собой высокопроизводительный, относительно быстрый и простой метод визуализации больших объемов нервной ткани с высоким разрешением с использованием очистки тканей CLARITY от больших участков в сочетании со стандартной конфокальной микроскопией. Этот протокол описывает этот подход посредством следующих этапов: 1) рассечение и подготовка нервной ткани, 2) очистка ткани, 3) монтаж ткани, 4) визуализация подготовленных срезов и 5) обработка полных изображений с использованием программного обеспечения визуализации микроскопии реконструкции и анализа(рисунок 2). Эти усилия приводят к изображениям с высоким разрешением, которые могут быть использованы для анализа популяций нейронов, паттернов нейронных связей, морфологии 3D-дендриты, изобилия и морфологии дендритного позвоночника, а также молекулярных паттернов экспрессии в неповрежденной ткани мозга.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Следующий протокол следует всем рекомендациям по уходу за животными для Медицинского колледжа Бейлора.

1. Рассечение и подготовка тканей

  1. Усыпить мышь при передозировке изофлурана, поместив мышь в закрытый контейнер с полотенцем, пропитанным изофлураном (или другими одобренными IUCAC средствами).
  2. Перфьюзировать животное транскардиально, используя иглу 25 г с 10 мл ледяного холодного PBS, а затем 10 мл 4% PFA.
  3. Рассектать интересуящеую область (или ткань) мозга.
  4. Поместите рассеченную ткань в 4% PFA на ночь при 4 °C. Правильная фиксация является ключевым фактором для этого протокола. Не пропускайте и не сокращайте этот шаг.
  5. После фиксации в 4% PFA в течение не менее 12 ч переносят ткань на 4% акриламидную гидрогелевую смесь в течение 24 ч при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При размораживании гидрогеля убедитесь, что он не полимеризовался, это может произойти, если гидрогель станет слишком теплым. Оттаивание на льду для предотвращения преждевременной полимеризации.

2. Очистка тканей

  1. Поместите ткани мозга (все еще погруженные в гидрогель) в вакуумный инкубатор на 3 ч при 37 °C с вакуумом -90 кПа. Оставьте верхнюю часть трубки откручиваться, чтобы вакуум сформировался должным образом.
  2. Промыть салфетку PBS в течение 10 мин при комнатной температуре (25 °C) с легким встряхиванием.
  3. Поместите образец полимеризованной ткани в камеру электрофореза, сохраняя за этим ориентацию ткани в камере.
  4. Заполните камеру и резервуар прилагаемым электрофорезным буфером SDS.
  5. Запустите образец при 70 В, 1 А и 35 С с постоянным током около 2 ч/мм ткани.
    1. Периодически проверяйте образец; для правильной очистки может потребоваться больше времени в камере. Хорошей отправной точкой для очищения является 1-2 ч на мм мозговой ткани. Всему мозгу мыши требуется 8-10 ч для достаточного очищения. Запомните ориентацию образца перед извлечением его из камеры и обязательно замените его обратно в камеру в той же ориентации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рисунок 3А показывает, как будет выглядеть полностью очищенный мозг. Мозг будет выглядеть непрозрачным и неочищенным на этом этапе из-за наличия растворенного SDS, но после извлечения липидов практически не должно быть желтого оттенка.

3. Подготовка и монтаж очищенной ткани

  1. После того, как образец закончит очистку и выглядит достаточно прозрачным, вымойте в PBS на ночь при комнатной температуре. Заменяйте PBS свежим PBS как можно чаще. Этот шаг имеет решающее значение для удаления остаточных SDS, которые могут образовывать осадок на последующих этапах.
  2. После окончательной стирки в PBS промыть ткань в течение 5 мин в деионизированной воде комнатной температуры три раза. Ткань станет непрозрачной на этом этапе и может расширяться.
  3. Инкубируют ткань в растворе, соответствующем рефракционному индексу (см. таблицу 1),в течение не менее 4 ч при комнатной температуре. На рисунке 3В показан кусок очищенной ткани после инкубации в растворе, соответствующем показателю преломления.
  4. Во время инкубации ткани в растворе, соответствующем рефракционному индексу, сконструйте подходящую камеру корпуса для получения изображения образца, если это необходимо.
  5. Создание камеры визуализации для небольших образцов/срезов тканей
    1. Используя стеклянную горку в качестве основы для монтажа, уложите резиновые или пластиковые распорки и закрепите суперклеем. Если готовые прокладки недоступны, используйте пластиковые кольца, изготовленные из конических поперечных сечений труб.
    2. Убедитесь, что эти части закреплены на стеклянной горке без каких-либо отверстий(рисунок 3C).
    3. Поместите очищенную ткань в монтажную камеру, предварительно заполненную раствором для согласования показателей преломления.
    4. Надежно скрепите ткань, поместив сверху стеклянную крышку и запечатав ее лаком для ногтей.
    5. Изобразите эту ткань, добавив каплю соответствующего показателя преломления монтажного раствора непосредственно поверх стекла.
  6. Большая камера визуализации тканей
    1. Постройте эту камеру, если толщина ткани превышает 5 мм (подходит для всего мозга или полушарий).
    2. Используя стеклянную тарелку размером 10 см с высокой стенкой, поместите коническую трубку объемом 50 мл в центр, убедившись, что диаметр конической линзы достаточно велик, чтобы принять ствол используемой объектива.
    3. Внесите 3% агарозы в воду и вылейте ее в пространство между стеклянной посудой и конической трубкой, дайте остыть в течение 1 ч(рисунок 3D). Это сформирует кольцо твердой агарозы(рисунок 3Е).
    4. Надежно приклейте ткань к нижней части камеры с помощью суперклея и заполните камеру раствором для согласования показателей преломления. Нанесите клей, чтобы приклеить ткань на область, которая не будет изображена, чтобы позволить рекультивацию ткани из тарелки без повреждения интересующих областей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот препарат чувствителен ко времени, так как среда с показателем преломления может начать полимеризоваться, если ее не сохранить из воздуха и не хранить при 4°C.

4. Визуализация очищенных образцов тканей

  1. Получите изображение с помощью конфокального микроскопа, оснащенного объективом 25x/0.95 NA с рабочим расстоянием 4 мм.
  2. Включите все соответствующее оборудование для обработки изображений. Поместите образец на сцену и поместите каплю раствора для согласования показателей преломления на верхнюю часть монтажной камеры.
  3. Тщательно подойдите к погружным средам с целью и сформируйте непрерывную колонку медиа.
  4. Используя эпифлуоресценцию, найдите подходящее поле визуализации.
  5. Начните процедуру получения изображения, проверив соответствующие параметры.
    1. Начните с установки разрешения и настроек скорости сканирования, используя рисунок 4A в качестве руководства. При визуализации с использованием конфокального микроскопа полностью закройте точечное отверстие, чтобы получить наименьшее оптическое сечение и, следовательно, наилучшее z-разрешение.
    2. Постепенно увеличивайте мощность лазера/усиление датчика до тех пор, пока не будет получено подходящее изображение с высоким отношением сигнал/шум.
    3. При использовании стандартной двухцветной визуализации EGFP/tdTomato задайте настройки сбора света, используя рисунок 4B в качестве руководства.
    4. Установите параметры z-стека на основе наблюдаемых начальной и конечной точек ткани. Установите размер шага на основе желаемого z-разрешения, используя рисунок 4C в качестве руководства.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Меньшие размеры ступеней приведут к большему z-разрешению, но также приведут к большему времени выдержки лазера, что потенциально приведет к отбеливанию образца.
    5. Когда вы удовлетворены настройками получения изображения, получите изображение.
    6. Убедитесь, что изображение имеет высокое отношение сигнал/шум и показывает четкие границы структур(рисунок 4D).

5. Обработка изображений и 3D-количественная оценка с использованием программного обеспечения для микроскопического анализа

ПРИМЕЧАНИЕ: Программные пакеты для анализа микроскопических изображений являются мощными инструментами для трехмерной визуализации и обработки изображений. Многие из этих программ идеально подходят для обработки больших наборов данных, которые генерируются из изображений очищенных образцов тканей. Следующие шаги и связанные с ними рисунки соответствуют рабочему процессу программного обеспечения Imaris.

  1. Откройте стек изображений и импортируйте его в выбранное аналитическое программное обеспечение.
  2. Просматривайте изображение в трехмерном пространстве и вносите необходимые изменения в таблицы подстановки с помощью регулятора дисплея для лучшей визуализации изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рисунок 5А демонстрирует возможную экстремальную глубину изображения, доступную с помощью 2-фотоонной микроскопии в сочетании с очисткой тканей CLARITY. На рисунке 5B показаны различные дендрритные процессы, а также хорошо видимые морфологии позвоночника из z-стека, представленного на рисунке 5A.
  3. Чтобы отфильтровать любой последовательный фон, нажмите кнопку «Обработка изображений» и выберите фильтр вычитания фона.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 5C показано изображение с последовательным туманным фоновым сигналом перед обработкой. На рисунке 5D показано изображение после применения фильтра вычитания фона.
  4. Наблюдайте за 3D-изображением и знакомься с ним, глядя на него с разных ракурсов и уровней масштабирования.
  5. Запустите трассировку дендритов, сначала выбрав инструмент Трассировки нити.
  6. Нажмите Редактировать нить вручную, пропустить автоматическое создание.
  7. Установите режим автоматического контура и проверьте автоцентр и автоматическую коррекцию диаметра.
  8. Shift + щелкните правой кнопкой мыши на теле ячейки, чтобы установить начальную точку.
  9. Проследите нейрон по всей длине дендрита; щелкните левой кнопкой мыши на конце дендрита, чтобы установить конечную точку, чтобы программное обеспечение автоматически вычислял путь между начальной и конечной точками.
  10. Повторите этот шаг для всех дендритов и полностью проследите клеточную структуру.
  11. Визуализируйте прорисованную ячейку и подтвердите ее точность. При необходимости внесите изменения вручную.
  12. Выберите вкладку Создание.
  13. Выберите параметр Перевычисленный диаметр дендрита.
  14. Следуйте указаниям мастера до конца для получения более точного дендрита.
  15. Выберите вкладку Рисование.
  16. Нажмите на переключатель Spine, чтобы начать рисовать колючки.
  17. Установите приблизительный диаметр позвоночника по мере необходимости и используйте инструмент измерения, чтобы получить точное представление о диаметрах позвоночника.
  18. Нажмите на центр головки позвоночника, чтобы добавить новый позвоночник.
  19. Повторите это для всех шипов на дендрите.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно соблюдать дендрит со всех возможных углов при ручном добавлении шипов.
  20. Проверьте только что добавленные шипы на точность и внесите необходимые изменения.
  21. Выберите вкладку Создание.
  22. Выберите параметр «Перекомпьют диаметр позвоночника», чтобы программное обеспечение можно было определить правильные диаметры головы и шеи, которые имеют решающее значение для последующего анализа данных.
  23. Следуйте указаниям мастера создания диаметра позвоночника до конца.
  24. Наблюдайте за результатом вычислений и вносите любые ручные корректировки по мере необходимости. На рисунке 5E показан полностью прорисованный нейрон с шипами.
  25. Чтобы создать классифицированный список колючки, перейдите на вкладку Сервис.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого необходимо установить расширение MATLAB.
    1. Чтобы установить расширение MATLAB, откройте окно настроек.
    2. Выберите параметр Пользовательские инструменты.
    3. Добавьте соответствующий MCR среды выполнения MATLAB.
  26. Нажмите на Классифицировать шипы.
  27. Отредактируйте нужные параметры для классификации позвоночника.
  28. Нажмите на Классифицировать шипы на расширении MATLAB. На рисунке 5F показан дендрит, наложенный на колючки с цветовой кодировкой.
  29. Выберите вкладку Статистика.
  30. Настройте нужную статистику для количественной оценки данных, нажав на кнопку Настроить в левом нижнем углу этой вкладки.
  31. После выбора метода представления статистики экспортируйте данные с помощью кнопки Экспортировать статистику на вкладке Отображение в файл, расположенной в правом нижнем углу этого окна.
  32. График статистики с использованием предпочтительного метода построения графиков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После получения изображения репрезентативную морфологию клеток анализировали с использованием встроенной статистики и скриптов классификации в программном обеспечении для анализа. Собранные данные(рисунок 6А)отражают, что нейрон 2 имеет большую дендритную структуру с более высокой плотностью шипов. В целом данные свидетельствуют о том, что нейрон 2 имеет более сложную дендритную структуру по сравнению с нейроном 1. Для обоснования этого результата был проведен стандартный анализ Шолля, котор...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

До появления современных методов очистки тканей изучение морфологии нейронов состояло из трудоемкого сечения, визуализации и реконструкции соседних очень тонких участков. Использование электрофоретического очищения тканей в сочетании с конфокальной визуализацией обеспечивает беспрепятственное представление о полной морфологии нейронов. От неповрежденных дендритных деревьев до мельчайших синаптических бутонов визуализация и количественная оценка морфологии нейронов никогда не были более осуществимыми.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам пока нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить вирусное ядро NRDDC в Неврологическом институте Яна и Дэна Дункана за производство AAV и лентивирусов, используемых в этих экспериментах. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить Медицинский колледж Бейлора Центр сравнительной медицины за разведение мышей и общее содержание используемых мышей. Мы хотели бы поблагодарить Американскую кардиологической ассоциацию за их поддержку под номером 20PRE35040011 и BRASS: Baylor Research Advocates for Student Scientists за их поддержку (PJH). Наконец, мы хотели бы поблагодарить Logos за предоставление нашей лаборатории электрофоретической системы очистки тканей Logos X-Clarity.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Коническая трубка 15 млThermo Scientific339650
25 г x 1" иглаBD305127
30% акриламида (No-Bis)National DiagnosticsEC-810
50 мл коническая трубкаThermo Scientific339653
раствор для очистки электрофоретической тканиLogosC13001
HistodenzSigmaD2158-100G
Набор гидрогелевых растворовЛоготипыC1310X
ImarisOxford InstrumentsN/A
Параформальдегид 16%EMS15710
PBS, 1x, 500 мл, 6 флаконов/ящикFisherMT21040CV
VA-044Wako925-41020
X-CLARITY Система полимеризацииLogosC20001
X-CLARITY Система очистки тканей IILogosC30001

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abbott, L. F., et al. The Mind of a mouse. Cell. 182 (6), 1372-1376 (2020).
  2. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 314 (1165), 1(1986).
  3. Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), (2015).
  4. Winnubst, J., et al. Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain. Cell. 179 (1), 268-281 (2019).
  5. Araya, R., Vogels, T. P., Yuste, R. Activity-dependent dendritic spine neck changes are correlated with synaptic strength. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (28), (2014).
  6. Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity of dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).
  7. Martínez-Cerdeño, V. Dendrite and spine modifications in autism and related neurodevelopmental disorders in patients and animal models. Developmental Neurobiology. 77 (4), 393-404 (2017).
  8. Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. Molecular genetics and imaging technologies for circuit-based neuroanatomy. Nature. 461 (7266), 900-907 (2009).
  9. Kim, E. H., Chin, G., Rong, G., Poskanzer, K. E., Clark, H. A. Optical probes for neurobiological sensing and imaging. Accounts of Chemical Research. 51 (5), 1023-1032 (2018).
  10. Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2014).
  11. Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-associated viral vectors in neuroscience research. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
  12. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  13. Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
  14. Ledda, F., Paratcha, G. Mechanisms regulating dendritic arbor patterning. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (24), 4511-4537 (2017).
  15. Falougy, H. E., Filova, B., Ostatnikova, D., Bacova, Z., Bakos, J. Neuronal morphology alterations in autism and possible role of oxytocin. Endocrine Regulations. 53 (1), 46-54 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи