Методическая статья

Улавливание активно производимых микробных летучих органических соединений из образцов, связанных с человеком, с помощью вакуумной экстракции сорбента

3.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62547

⸱

1 июня 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California Irvine, 2Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California Irvine, 3Entech Instruments Inc.

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает извлечение летучих органических соединений из биологического образца методом вакуумной экстракции сорбента, газовую хроматографию в сочетании с масс-спектрометрией с использованием Entech Sample Preparation Rail и анализ данных. Он также описывает культуру биологических образцов и зондирование стабильных изотопов.

Аннотация

Летучие органические соединения (ЛОС) из биологических образцов имеют неизвестное происхождение. ЛОС могут происходить от хозяина или различных организмов из микробного сообщества хозяина. Чтобы распутать происхождение микробных ЛОС, был проведен анализ летучих головных пространств бактериальных моно- и кокультур золотистого стафилококка, Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii, а также исследование стабильных изотопов в биологических образцах кала, слюны, сточных вод и мокроты. Моно- и кокультуры использовались для идентификации летучего производства из отдельных видов бактерий или в сочетании со стабильным изотопным зондированием для идентификации активного метаболизма микробов из биологических образцов.

Для извлечения ЛОС использовалась вакуумная экстракция сорбента (VASE). VASE - это простой в использовании, коммерциализированный, не содержащий растворителей метод экстракции из пространства над головой для полулетучих и летучих соединений. Отсутствие растворителей и почти вакуумные условия, используемые во время экстракции, делают разработку метода относительно легкой и быстрой по сравнению с другими вариантами экстракции, такими как трет-бутилирование и твердофазная микроэкстракция. Описанный здесь рабочий процесс использовался для идентификации конкретных изменчивых сигнатур из моно- и сокультур. Кроме того, анализ зондирования стабильных изотопов связанных с человеком биологических образцов выявил ЛОС, которые либо обычно, либо уникально производились. В данной статье представлен общий рабочий процесс и экспериментальные соображения VASE в сочетании со стабильным изотопным зондированием живых микробных культур.

Введение

Летучие органические соединения (ЛОС) имеют большие перспективы для обнаружения и идентификации бактерий, поскольку они выделяются всеми организмами, а различные микробы имеют уникальные сигнатуры ЛОС. Летучие молекулы использовались в качестве неинвазивного измерения для выявления различных респираторных инфекций, включая хроническую обструктивную болезнь легких1, туберкулез2 в моче3 и пневмонию, связанную с ИВЛ4, в дополнение к различению субъектов с муковисцидозом (МВ) от здоровых контрольных субъектов 5,6. Летуч....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Соображения по анализу сорбента Headspace Sorbent Pen (HSP) и анализа образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: HSP, содержащий сорбент Tenax TA, был выбран для улавливания широкого спектра летучих веществ. Tenax имеет более низкое сродство к воде по сравнению с другими сорбентами, что позволяет ему улавливать больше ЛОС из образцов с более высокой влажностью. Tenax также имеет низкий уровень примесей и может быть кондиционирован для повторного использования. Выбор сорбента также производился с учетом колонны, установленной в ГК-МС (см. Таблицу материалов).

  1. Создание отрицательных элементов управления путем извлечения заготовок из с....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Моно- и кокультуры S. aureus, P. aeruginosa и A. baumannii
Моно- и кокультуры состояли из бактериальных видов S. aureus, P. aeruginosa и A. baumannii. Это распространенные условно-патогенные микроорганизмы, обнаруженные в ранах человека и хронических инфекциях. Для идентификации летучих молекул, присутствующих в моно- и кокультурах, проводили короткую 1-ч экстракцию при 70 .......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для выявления летучего производства в культурах in vitro и связанных с человеком образцах был проведен летучий анализ моно- и кокультур P. aeruginosa, S. aureus и A. baumanii и стабильное изотопное зондирование различных биологических образцов. В анализе для моно- и ко-культур летучие вещества были обнаружены путем выполнения короткой экстракции в течение 1 ч при 70 °C. Летучий анализ моно- и кокультур позволил исследовать соединения, образующиеся как отдельными видами, так и во время их взаим.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

V. L. V и S. J.B. D. были бывшими сотрудниками Entech Instruments Inc., а K. W. является членом университетской программы Entech. J.P., J.K. и C.I.R. не имеют конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Мы благодарим Хизер Моэн и Линду М. Каликин за тщательное редактирование этой рукописи. Эта работа была поддержана NIH NHLBI (грант 5R01HL136647-04).

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
13C глюкозаSigma-Aldrich389374-1G
2-Stg Мембранный насосEntech Instruments01-10-20030
20 мл флаконы VOAFisher Scientific5719110
24 мм Черные колпачки с отверстием, без перегородкиEntech Instruments01-39-76044Bудерживает вкладыш крышки на месте на флаконе
24 мм вкладыш для ручек сорбентаEntech InstrumentsSP-L024Sпозволяет шприц-ручкам делать вакуумное уплотнение в верхней части флакона
5600 Устройство для экстракции сорбента (SPEU)Entech Instruments5600-SPES5600 Устройство для экстракции сорбента -120 В переменного тока
96-луночные планшеты для анализаGenesee25-224
Brain Heart Infusion (BHI) средаSigma-Aldrich53286-500G
ChemStation StofwareКолонка Agilent
DB-624Agilent122-1364E60 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 1,40 мкм, в оксиде
дейтерияGC-MS Sigma-Aldrich151882-1L
Dexsi sofwareDexsi (открытый исходный код)
GC-MS (7890A GC и 5975C inert XL MSD с трехосевым детектором)Agilent7890A GC и 5975C inert XL MSD с тремя осями детектор
Headspace Bundle HS-B01, 120VAEntech InstrumentsSP-HS-B01Элементы для беговой экстракции Headspace
Sorbent pen (HSP) - заготовкаEntech InstrumentsSP-HS-0
Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 меш)Entech InstrumentsSP-HS-T3560
Микроцентрифужные трубки (2 мл)VWR53550-792
Уплотнительные кольцаEntech InstrumentsSP-OR-L024
Планка для подготовки образцовEntech Instruments
Сорбент ручка термокондиционерEntech Instruments3801-SPTC
Тодд Хьюитт (TH) медиаSigmaT1438-500G

Ссылки

  1. Van Berkel, J. J. B. N., et al. A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls. Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).
  2. Nakhleh, M. K., et al.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи