Методическая статья

Оценка глобальной двухцепочечной конечной резекции ДНК с использованием маркировки BrdU-ДНК в сочетании с визуализацией дискриминации клеточного цикла

DOI:

10.3791/62553

⸱

28 апреля 2021 г.

 ,  ,  , 
1Oncology Division, Genome Stability Laboratory, CHU de Québec Research Center, HDQ Pavilion, 2Department of Molecular Biology, Medical Biochemistry, and Pathology, Laval University Cancer Research Center, 3Oncology Division, CHU de Québec Research Center, CHUL Pavilion

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящем протоколе мы демонстрируем, как визуализировать двухцепочечную концевую резекцию ДНК во время фазы S/G2 клеточного цикла с использованием метода, основанного на иммунофлуоресценции.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изучение реакции на повреждение ДНК (DDR) является сложной и важной областью, которая стала только более важной из-за использования препаратов, нацеленных на DDR, для лечения рака. Этими мишенями являются поли(АДФ-рибоза) полимеразы (PARPs), которые инициируют различные формы репарации ДНК. Ингибирование этих ферментов с использованием ингибиторов PARP (PARPi) достигает синтетической летальности, придавая терапевтическую уязвимость гомологичным рекомбинационным (HR)-дефицитным клеткам из-за мутаций в раке молочной железы типа 1 (BRCA1), BRCA2 или партнере и локализаторе BRCA2 (PALB2).

Клетки, обработанные PARPi, накапливают двухцепочечные разрывы ДНК (DSB). Эти разрывы обрабатываются механизмом резекции конца ДНК, что приводит к образованию одноцепочечной (ss) ДНК и последующему восстановлению ДНК. В контексте дефицита BRCA1 оживление резекции ДНК посредством мутаций в ингибиторах резекции ДНК, таких как 53BP1 и DYNLL1, вызывает резистентность к PARPi. Поэтому возможность мониторинга резекции ДНК в целлюлозе имеет решающее значение для более четкого понимания путей репарации ДНК и разработки новых стратегий преодоления резистентности к PARPi. Методы, основанные на иммунофлуоресценции (IF), позволяют контролировать глобальную резекцию ДНК после повреждения ДНК. Эта стратегия требует длинноимпульсной геномной маркировки ДНК 5-бром-2'-дезоксиуридином (BrdU). После повреждения ДНК и резекции конца ДНК полученная одноцепочечная ДНК специфически обнаруживается анти-BrdU антителом в нативных условиях. Кроме того, резекция ДНК также может быть изучена с использованием маркеров клеточного цикла для дифференциации между различными фазами клеточного цикла. Клетки в фазе S/G2 позволяют изучать конечную резекцию в HR, тогда как клетки G1 могут быть использованы для изучения негомологичного конечного соединения (NHEJ). Подробный протокол для этого метода ПЧ в сочетании с дискриминацией клеточного цикла описан в этой статье.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Модуляция факторов репарации ДНК является постоянно развивающимся методом терапии рака, особенно в опухолевых средах с дефицитом репарации ДНК DSB. Ингибирование специфических факторов репарации является одной из гениальных стратегий, используемых для сенсибилизации раковых клеток к агентам, повреждающим ДНК. Десятилетия исследований привели к выявлению различных мутаций генов репарации ДНК в качестве биомаркеров для выбора терапевтической стратегии1. Следовательно, область репарации ДНК стала центром разработки лекарств для обеспечения широкого спектра методов лечения, расширяя возможности концепции персонализированной медицины.

DSB ремонтируются двумя основными путями: NHEJ и HR2. Путь NHEJ подвержен ошибкам, быстро перевязывая два конца ДНК практически без конечной обработки ДНК и включая протеинкиназу (ДНК-PKcs), комплекс Ku70/80, белки 53BP1 и RIF13. Напротив, HR является верным механизмом, инициированным BRCA14. Важным шагом в восстановлении HR является процесс резекции конца ДНК, который представляет собой деградацию сломанных концов, приводящую к одноцепочечной (ss) ДНК с концами 3'-OH. BRCA1 облегчает набор нисходящих белков, которые образуют резектосому MRN / RPA / BLM / DNA2 / EXO1, которые участвуют в резекции ДНК от 5' до 3'5.

Начальная конечная резекция осуществляется через эндонуклеазную активность MRE11, что позволяет проводить дальнейшую обработку нуклеазами DNA2 и EXO1. Генерируемые свесы ssDNA быстро покрываются репликационным белком A (RPA), чтобы защитить их от дальнейшей обработки. Впоследствии BRCA2, PALB2 и BRCA1 участвуют в опосредовании смещения RPA и сборки нуклеофиламента RAD51, необходимого для механизма репарации, направленного на гомологию. Тонкий баланс между использованием NHEJ и HR необходим для оптимального поддержания геномной целостности. Выбор пути зависит от фазы клеточного цикла. HR предпочтительно используется во время фаз от S до G2, где резекция ДНК находится на самом высоком уровне, а сестринские хроматиды доступны для обеспечения надлежащего восстановления.

Поли (АДФ-рибоза) полимераза 1 (PARP-1) является одним из самых ранних белков, рекрутированных в DSB. Он регулирует как резекционную активность, так и сборку последующих эффекторов, участвующих в NHEJ5,6. PARP-1 также необходим для восстановления одноцепочечного разрыва ДНК во время репликации7,8. Благодаря своей важной роли в восстановлении ДНК, ингибиторы PARP (PARPi) используются в качестве терапии рака. При нескольких раковых заболеваниях с дефицитом HR лечение PARPi приводит к синтетическому летальному ответу из-за неспособности клеток с дефицитом HR восстанавливать накопленный ущерб с помощью альтернативного пути9,10. В настоящее время существует четыре одобренных FDA PARPi: Olaparib, Rucaparib, Niriparib и Talazoparib (также называемый BMN 673), которые используются для различных методов лечения рака молочной железы и яичников11. Тем не менее, устойчивость к PARPi распространена, и одна потенциальная причина возникает в результате повторного приобретения навыков HR12. Потеря или ингибирование PARP-1 в присутствии облучения дисрегулирует механизм резектосомы, что приводит к накоплению более длинных трактов сдНК13. Поэтому углубленное изучение резекции ДНК in vivo имеет решающее значение для более четкого понимания путей репарации ДНК и последующей разработки новых стратегий лечения рака и преодоления резистентности к PARPi.

Существует несколько методов, используемых для обнаружения событий резекции ДНК5. Одним из таких методов является классический метод на основе ПЧ, позволяющий косвенно окрашивать и визуализировать резецированную ДНК после вызванного стрессом DSB с использованием антитела против RPA. Маркировка геномной ДНК 5-бром-2'-дезоксиуридином (BrdU) и обнаружение только ssDNA является прямым измерением событий резекции ДНК. Он обходит мониторинг RPA, который участвует в нескольких клеточных процессах, таких как репликация ДНК. В способе, описанном здесь, клетки, инкубированные с BrdU в течение одного клеточного цикла, позволяют BrdU быть включенным в одну цепь реплицирующейся клеточной ДНК. После резекции окрашивание ПЧ проводят в условиях, допускающих обнаружение BrdU только в форме ssDNA, с использованием антитела против BrdU. Это антитело может получить доступ только к воздействию нуклеотидов BrdU и не будет обнаруживать те, которые интегрированы в двухцепочечную ДНК. С помощью флуоресцентной микроскопии резецированную ДНК можно визуализировать в виде пунктатных очагов BrdU/ssDNA. Ядерная интенсивность этих очагов может быть использована в качестве считывания для количественной оценки резекции после повреждения ДНК. В данной работе описаны пошаговые процессы данного метода, которые могут быть применены к большинству клеточных линий млекопитающих. Этот метод должен иметь широкую полезность как простой способ мониторинга резекции конца ДНК в целлюле, как доказательство концепции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Клеточная культура, обработка и подготовка покровов

ПРИМЕЧАНИЕ: Все клеточные покрытия, трансфекции и обработки, кроме облучения, должны проходить под стерильным капюшоном клеточной культуры.

  1. День 1
    1. В 6-луночной пластине поместите один крышку в каждую скважину для любого количества условий, сколько необходимо. Пластина ~ 150 000 клеток HeLa для трансфекции или медикаментозного лечения, по желанию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При трансфекции рекомендуется делать обратную трансфекцию во время покрытия, или можно сделать прямую трансфекцию через несколько часов после покрытия, чтобы обеспечить соблюдение. Обратная трансфекция выполняется путем добавления трансфекционной смеси в крышку перед добавлением ячеек; таким образом, трансфекция начинается до того, как клетки начнут прилипать. Прямая трансфекция, напротив, представляет собой добавление трансфекционной смеси после сцепления с поверхностью обычно на следующий день. Однако это можно сделать в тот же день, при условии, что клеткам будет отведено достаточно времени, чтобы прилипнуть.
    2. Для этого метода используют 4 скважины: Скважина 1: контроль siRNA (называемый siCTRL); Хорошо 2: siRNA против PARP-1 (siPARP-1); Колодец 3: необработанный; Скважина 4: Клетки, подлежащие обработке 5 мкМ BMN673 за 1 ч до облучения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе все испытания проводились в облученных условиях (см. раздел 1.3).
    3. Инкубируйте клетки при 37 °C в 5% увлажненном инкубаторе CO2 в течение ночи, хотя протокол трансфекции допускает до 3 дней инкубации. Время инкубации до обработки BrdU будет зависеть от эффективности трансфекции siRNA. Если трансфекции нет, инкубации в течение 16 ч достаточно, чтобы обеспечить прилипание к покровному листу и некоторый рост клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Условия инкубатора могут быть изменены в зависимости от используемой клеточной линии.
  2. День 2
    1. Добавляют BrdU в конечной концентрации 10 мкМ в соответствующих культивирующих средах и инкубируют в течение 16 ч (один клеточный цикл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор BrdU готовят в диметилсульфоксиде; используемый исходный раствор составляет 10 мМ и хранится в аликвотах при -20 °C.
  3. День 3
    1. Облучают пластины общей дозой рентгеновского облучения 5 Гр (варьируют дозу облучения в зависимости от типа облучателя, например, облучатели мелких животных против настольных облучателей). Смотрите Таблицу материалов для марки и модели используемого облучателя.
    2. Верните пластины в инкубатор, и отпустите клетки в течение 3 ч.
    3. В течение 3-часового инкубационного периода подготовьте два буфера, A и B, и 4% параформальдегида (PFA) в 1x фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буферы А и В и сахароза должны быть приготовлены свежими в день фиксации, используя свежий раствор сахарозы для предотвращения загрязнения.
      1. Подготовьте буфер А (Pre-Extract Buffer), согласно порядку (30 мл), описанному в таблице 1.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Сахароза 1M должна быть приготовлена в день использования, чтобы предотвратить загрязнение.
      2. Подготовьте буфер B (Cytoskeleton Stripping Buffer) в соответствии с порядком, описанным в таблице 1 (30 мл).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер В должен быть подготовлен в указанном порядке для предотвращения осаждения Tween-20 и раствора дезоксихолата натрия.
      3. Приготовьте 4% PFA, по 2 мл на условие (10 мл), под химическим капотом (таблица 1).

2. Предварительная экстракция и фиксация

ПРИМЕЧАНИЕ: Все предварительное извлечение и фиксацию выполняются с обшивками, оставшимися в тканевой культуральной пластине на льду или при 4 °C; крышка снимается только на последнем этапе монтажа (см. обсуждение).

  1. Предварительная экстракция
    1. Аспирируйте среду, тщательно промойте клетки дважды с 1x PBS и удалите PBS. Добавьте 2 мл предварительно экстракционного буфера А и немедленно инкубируйте при 4 °C в течение 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы время инкубации в буфере А не увеличивалось. Расширенная инкубация в буферах предварительной экстракции приведет к увеличению количества отделенных клеток от крышки. В качестве альтернативы, вместо инкубации при 4°C, инкубация может быть выполнена на льду.
    2. Удалите буфер A через аспирацию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не мойте крышки после удаления буфера A. Перейдите к следующему шагу.
    3. Добавьте 2 мл цитоскелета Stripping Buffer B и немедленно инкубируйте при 4 °C в течение 10 мин. Осторожно аспирируйте буфер B и тщательно промывайте клетки один раз с 1x PBS. Осторожно аспирируйте 1x PBS.
  2. Фиксация
    1. Зафиксируйте клетки, добавив 2 мл 4% PFA под химический капот.
      ПРИМЕЧАНИЕ: PFA токсичен и должен манипулироваться под химическим капотом.
    2. Инкубировать клетки при комнатной температуре в течение 20 мин. Дважды вымойте крышки с 1x PBS и аспирируйте избыток.
    3. Накройте крышки 100% холодным метанолом и инкубируйте крышки при -20 °C в течение 5 мин. Дважды мойте с 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить. Крышки могут храниться при 4 °C в 1x PBS и пластина, обернутая в алюминиевую фольгу, если это необходимо. Клетки не должны храниться более 5 дней до продолжения протокола IF.

3. Пермеабилизация

  1. Инкубируют клетки с 2 мл 1x PBS, содержащими 0,5% Triton X-100 при комнатной температуре в течение 15 мин. Трижды вымойте крышки 2 мл 1x PBS.

4. Иммуноокрашивание

  1. Шаг блокировки
    1. Подготовьте достаточно свежего блокирующего буфера (3% BSA в 1x PBS), чтобы использовать 2 мл на крышку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте дополнительные 5 мл блокирующего буфера для приготовления растворов антител.
    2. Добавьте в каждую лунку 2 мл блокирующего буфера и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 ч.
  2. Первичная инкубация антител
    1. Готовят раствор первичного антитела в свежем блокирующем буфере: BrdU RPN202 1:1000 и пролиферирующий клеточный ядерный антиген (PCNA) 1:500, 100 мкл на крышку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для сохранения антитела можно использовать меньший объем, 75-100 мкл для крышки 22 x 22 мм, 50-75 мкл для крышки 18 x 18 мм.
    2. На каждый лист крышки добавляют 100 мкл раствора первичного антитела. Накройте крышки квадратом парапленки с помощью пинцета и аккуратно расположите парапленку, чтобы не создавать пузырьков.
    3. Накройте пластину алюминиевой фольгой и инкубируйте первичное антитело в течение ночи при 4 °C в увлажненной камере.
    4. Снимите квадраты парапленки и трижды вымойте крышки 2 мл стерильного 1x PBS.
  3. Инкубация вторичных антител
    1. Готовят достаточное количество раствора вторичных антител в свежем блокирующем буфере: антимышечное 488 флуоресцентное вторичное А11011 (для BrdU) разведение 1:800 и анти-кролик 568 флуоресцентное вторичное А11011 (для PCNA) разведение 1:800.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые цвета могут быть изменены в соответствии с экспериментальными потребностями. Конкретную используемую марку можно найти в Таблице материалов.
    2. Добавьте на каждую крышку 100 мкл раствора вторичных антител, накройте крышки квадратом парапленки с помощью пинцета и аккуратно расположите парапленку без пузырьков.
    3. Инкубируют вторичное антитело при комнатной температуре в течение 1 ч с пластиной, покрытой алюминиевой фольгой.
    4. Трижды вымойте крышки 2 мл 1x PBS.
  4. Ядерное окрашивание
    1. Приготовьте объем 2 мл на крышку 1x PBS, содержащую 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) в конечной концентрации 1 мкг/мл (1:1000).
    2. Добавьте на каждую крышку 2 мл раствора DAPI. Инкубируйте крышки при комнатной температуре в течение 10 мин с пластиной, покрытой алюминиевой фольгой. Дважды вымойте крышки с 1x PBS.
    3. Накройте крышки 1x PBS и используйте либо иглу, либо тонкий пинцет, чтобы поднять крышку со дна колодца. Осторожно смойте лишнюю жидкость, осторожно постучав одним краем по бумажному полотенцу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не уронить слайд или не позволить плоской поверхности с адгезионными ячейками коснуться бумаги.
    4. Установите крышки на слайды, используя 10-20 мкл монтажных носителей, специфичных для ПЧ.

5. Получение и анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Получение изображений может быть выполнено на нескольких типах флуоресцентных микроскопов. Использовался эпифлуоресцентный микроскоп с масляным объективом 63x; смотрите Таблицу материалов для марки и модели. Z-стеки не требуются, хотя они могут быть полезны в зависимости от клеточной линии и уровня митохондриального окрашивания.

  1. Анализ изображений
    1. Для каждого изображения создайте несколько файлов tiff; объединить все плоскости, но сохранить цветовые каналы отдельно. Импортируйте эти файлы в Cell Profiler (The Broad Institute https://cellprofiler.org/home) и анализируйте с помощью конвейера Speckle Counting (Дополнительное видео 1).
    2. Загрузите изображения (дополнительный рисунок S1A).
      1. Чтобы начать создание проекта, загрузите в программу конвейер подсчета пятен и изображения для анализа в предоставленной области.
      2. Используйте модуль NamesAndTypes, чтобы присвоить осмысленное имя каждому изображению, по которому другие модули будут ссылаться на него-C01: Представляя канал BrdU; C02: Представляет канал PCNA; C03: Представление канала DAPI.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Эти идентификаторы будут зависеть от микроскопа; в имени файла должен быть идентификатор для различения каналов.
    3. Определите, какой файл будет использоваться для идентификации ядер и назовите его (измените это имя по мере необходимости) (см. Дополнительный рисунок S1B и Дополнительный рисунок S1C).
      1. Выберите диаметр объекта от 50 до 300 пикселей, что является приемлемым диапазоном размеров для ядер, но измените значение в соответствии с ядрами на изображении.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Может оказаться, что 50 является слишком большим значением и препятствует идентификации меньших ядер; аналогичным образом, 300 может позволить считать большие группы ядер 1.
      2. Отбрасывайте объекты за пределами диапазона диаметров, чтобы обеспечить подсчет только тех, которые соответствуют критериям.
      3. Отбрасывайте объекты, касающиеся границ, чтобы удалить ячейки, которые могут находиться в поле только частично.
      4. Примените пороговое значение в соответствии с конкретными изображениями. Обратите внимание на следующие параметры в качестве примера. Измените поправочный коэффициент порога в зависимости от того, насколько строгой будет стратегия пороговых значений. Другие параметры включают пороговую стратегию: Глобальная; пороговый метод: Otsu; два класса или три класса пороговое значение: два класса; шкала сглаживания порога: 1; пороговый коэффициент сглаживания: 1; нижняя и верхняя границы порога: 0,0 и 1,0; метод различения слипшихся объектов: Форма; и метод рисования разделительных линий между сгруппированными объектами: Propagate.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого параметра профилировщик ячеек предоставляет дополнительные определения и доступную возможность настройки переменной.
    4. Определите первичный объект для идентификации очагов (дополнительный рисунок S2A).
      1. Используйте следующие настройки: выберите входное изображение: Maskedgreen; назван основной объект, подлежащий идентификации: BrdUFoci; типичный диаметр объекта: 1-15; выбросить объект за пределы диапазона диаметров: Да; отбросить объект, коснущийся границы изображения : Нет; пороговая стратегия: адаптационная; пороговый метод: Otsu; два класса или три класса пороговое значение: три класса; шкала сглаживания порога: 1; пороговый коэффициент сглаживания: 3; и размер фильтра сглаживания: 4.
    5. Измерение интенсивности (дополнительный рисунок S2B).
      1. Выберите измеряемое изображение: OrigGreen.
      2. Нажмите Добавить другое изображение. Выберите измеряемое изображение: PCNA. Выберите объекты для измерения: Ядра.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет использоваться для измерения интенсивности BrdU и PCNA - окончательных данных, которые будут отображены на графике.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе анализ на основе бромодезоксиуридина (BrdU) использовался для количественного измерения резекционной реакции клеток HeLa на повреждение, вызванное облучением. Генерируемые следы ssDNA визуализируются как отдельные очаги после иммунофлуоресцентного окрашивания (рисунок 1A). Затем идентифицированные очаги количественно оценивали и выражали как общую интегральную интенсивность окрашивания BrdU в ядрах (рисунок 1B, дополнительный рисунок S1,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье описывается метод, который использует окрашивание ПЧ для измерения вариаций резекции ДНК в целлюлозе. В настоящее время стандартом для наблюдения за влиянием на резекцию ДНК является окрашивание RPA; однако это косвенный метод, на который может влиять репликация ДНК. Ранее был описан другой метод резекции ДНК на основе brdU для классификации резекции ДНК в Резекции BRdU-положительных и BrdU-отрицательных клеток. Этот метод позволил считать клетки, которые не подвергаются ЧСС, положительными из-за ф...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Мари-Кристин Карон за выдающиеся технические консультации. Эта работа поддерживается финансированием Канадского института исследований в области здравоохранения J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. занимает исследовательскую кафедру Tier 1 Canada в области репарации ДНК и терапии рака. J.O'S является аспирантом FRQS, а S.Y.M является постдокторантом FRQS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Alexa 568 козий анти-кроличийМолекулярные зондыA110111:800
Alexa Fluor 488 козий анти-мышиныйМолекулярные зондыA110011:800
Анти PARP1 (F1-23)Самодельный1:2500
Анти-PCNA (SY12-07)NovusNBP2-673901:500
Анти-Альфа тубулин (DM1A)AbcamAb72911:100000
anti-BrdUGE HealthcareRPN2021:1000
Настольный рентгеновский облучательCell Rad
BMN673MedChem ExpressHY-16106
Бромодоксиуридин (BrdU)SigmaB5002
BSASigmaA7906
Клеточный профилографBroad InstituteV 3.19https://cellprofiler.org/
Curwood Parafilm M Лабораторная упаковочная пленка 4 дюйма / 250 футовFisher scientific13-374-12
DAPI (4',6-Diamidino-2-фенилиндол, дигидрохлоридInvitrogen Life TechnologyD1306
DMEM high glucoseFisher scientific10063542
EGTASigma-AldrichE3889
Fetal Бычья сывороткаGibco12483-020
Fisherbrand Защитные очки: квадраты 22 x 22Fisher scientific12 541B
Флуоресцентный микроскопLeicaDMI6000B63-кратный иммерсионный объектив
HeLaATCCCCL-2
HERACELL 160I CO2 ИНКУБАТОР CU 1-21 TC 120VVWR5103040837% CO2
MgCl2BioShop CanadaMAG520.500
NaClBioShop CanadaSOD002.10
Игла
PBS 1xWisent Bio Products311-010-CS
PFA 16%Cedarlane Labs15710-S(EM)
PIPESSigma-AldrichP6757-100G
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogen Life TechnologyP-36930
RNAiMAXInvitrogen13778-075
siPARPiDharmaconAAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT
siRNA controlDharmaconUUCGAACGUGUCACGUCAA
Sodium DeoxycholcateSigma-AldrichD6750-100G
SucroseBioShop CanadaSUC507.5
Tris-baseBioShop CanadaTRS001.5
Trition X-100Millipore SigmaT8787-250ML
Tween20Fisher научныйBP337500
пинцет
)

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response. Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).
  2. Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).
  3. Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
  4. Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
  5. Ronato, D. A., et al. Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection. Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).
  6. Hu, Y., et al. PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair. Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).
  7. Satoh, M. S., Lindahl, T. Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair. Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).
  8. Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).
  9. Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).
  10. Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).
  11. Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy. Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).
  12. Noordermeer, S. M., van Attikum, H. PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells. Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).
  13. Caron, M. C., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks. Nature Communications. 10 (1), 2954(2019).
  14. Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells. Nucleic Acids Research. 42 (3), 19(2014).
  15. Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).
  16. Sartori, A. A., et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).
  17. Huertas, P., Cruz-García, A. Single molecule analysis of resection tracks. Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).
  18. Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. RPA phosphorylation inhibits DNA resection. Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

BrdUPARPPCNA

Похожие статьи