В этом анализе используются эмбриональные стволовые клетки мыши, дифференцированные в эмбриоидные тела, культивируемые в геле 3D-коллагена, для анализа биологических процессов, которые контролируют прорастающий ангиогенез in vitro. Методика может быть применена для тестирования лекарств, моделирования заболеваний, а также для изучения конкретных генов в контексте делеций, которые являются эмбрионально летальными.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В пробирке Трехмерный анализ ангиогенеза с использованием эмбриональных стволовых клеток мыши для моделирования сосудистых заболеваний и тестирования лекарств
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Последние достижения в области индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) и технологий редактирования генов позволяют разрабатывать новые модели заболеваний на основе клеток человека для программ открытия фенотипических лекарств (PDD). Хотя эти новые устройства могут более точно предсказывать безопасность и эффективность исследуемых препаратов на людях, их разработка в клинике по-прежнему в значительной степени зависит от данных о млекопитающих, в частности, от использования моделей болезней мышей. Таким образом, параллельно с моделями заболеваний органоидов человека или «орган-на-чипе» разработка соответствующих моделей мышей in vitro является неудовлетворенной потребностью для оценки прямых сравнений эффективности и безопасности лекарств между видами и в условиях in vivo и in vitro . Здесь описан анализ прорастания сосудов, в котором используются эмбриональные стволовые клетки мыши, дифференцированные в эмбриоидные тела (БЭ). Васкуляризированные БЭ, культивируемые на 3D-коллагеновом геле, развивают новые кровеносные сосуды, которые расширяются, процесс, называемый прорастающим ангиогенезом. Эта модель резюмирует ключевые особенности прорастающего ангиогенеза in vivo - образования кровеносных сосудов из ранее существовавшей сосудистой сети, включая отбор клеток кончика эндотелия, миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток, управление клетками, формирование трубок и рекрутирование клеток фремиссии. Он поддается скринингу на лекарства и гены, модулирующие ангиогенез, и показывает сходство с недавно описанными трехмерными (3D) сосудистыми анализами, основанными на технологиях iPSC человека.
Введение
За последние три десятилетия открытие лекарств на основе мишеней (TDD) широко использовалось фармацевтической промышленностью при открытии лекарств. TDD включает в себя определенную молекулярную мишень, играющую важную роль в заболевании, и опирается на разработку относительно простых систем клеточных культур и считывания для скрининга лекарств1. Наиболее типичные модели заболеваний, используемые в программах TDD, включают традиционные методы культивирования клеток, такие как раковые клетки или иммортализированные клеточные линии, выращенные в искусственных средах и нефизиологических субстратах. Несмотря на то, что многие из этих моделей предос....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Медиаподготовка и культура mESC
- Приготовьте кондиционированную среду +/- (CM+/-), используя добавку 1x среда Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) с 10% (об./об.) инактивированной теплом фетальной бычьей сыворотки (FBS), 0,05 мМ β-меркаптоэтанола, 1x заменимых аминокислот (NEAA 1x), 2 мМ L-глутамина и 1 мМ пирувата натрия.
- Приготовьте кондиционированную среду +/+ (CM+/+) с использованием добавки CM+/- среды с фактором ингибирования лейкемии (LIF) (1,500 ЕД/мл) и 0.1 мМ β-меркаптоэтанола.
- Приготовьте кондиционированную среду +/+ в присутствии двух ингибиторов (CM+/+ 2i) с использованием добавки CM+/+ среды с 1 мкМ PD0325901 и 3 мкМ CHIR99021. ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Обзор протокола анализа прорастания кровеносных сосудов показан на рисунке 1. Девятидневные БЭ, полученные из трех независимых линий 129 / Ola mESC (Z / Red, R1 и E14), были ферментативно диссоциированы на отдельные клетки с использованием коллагеназы A. Клетки окрашивали для PECAM-1 и анализировали с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS), как описано. Все клеточные линии демонстрировали надежную эндотелиальную дифференцировку, и никаких различий в их способности дифф.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол описывает объективный, надежный и воспроизводимый 3D-анализ прорастания сосудов на основе EB, который поддается скринингу лекарств и генов, модулирующих ангиогенез. Этот метод имеет преимущества по сравнению со многими широко используемыми двумерными (2D) анализами с использованием культур эндотелиальных клеток, таких как эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC), для мониторинга миграции (анализ боковых царапин или анализ камеры Бойдена)22,23 или пролиферации (подсчет количества клеток, обнаруже.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам раскрывать нечего.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), ведущей программы стипендиатов Марии Склодовской-Кюри COFUND и Ассоциации Maladie de Rendu-Osler (AMRO).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 2-меркаптоэтанол | Milipore, Merck | 805740 | Biohazard: следует соблюдать надлежащие инструкции по технике безопасности при обращении |
| Agar Noble | Difco, BD Pharmigen | 214220 | |
| Alexa Fluo 555 козий анти-крысиный IgG | Life technologies | A21434 | |
| APC конъюгированный крысиный анти-мышиный PECAM-1 антитело (клон MEC13.3) | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Контроль изотипа (Клон R35-95) | BD Biosciences | 553932 | |
| Axiovert 25 микроскоп для инвертированной фазоконтрастной культуры тканей | ZEISS | ||
| Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
| , Allegra X-15R | Beckman Coulter | 392932 | |
| шкаф биобезопасности BioVanguard (Green Line) | Telstar | 133H401001 | |
| Бычий сывороточный альбумин (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Камера для подсчета клеток, Buerker, 0,100 мм | Marienfeld | 640211 | |
| Чашки для клеточных культур 60 x 15 мм | Corning | 353802 | |
| Чашки для клеточных культур, 35 x 10 мм | Corning | 353801 | |
| Тарелки для клеточных культур 12-луночные Corning | 3512 | ||
| CFX96 Touch Система обнаружения ПЦР в реальном времени | Biorad | 1855196 | |
| Сыворотка курицы | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| CHIR-99021 (CT99021) HCl | Selleckchem | S2924 | |
| Collagen I, высокая концентрация, крысиный хвост, 100 мг | Corning | 354249 | |
| коллагеназой A | Roche | 10103586001 | |
| Конфокальное лазерное сканирование Микроскоп, TCS SP5 | Leica | ||
| Cover glasses, 24 &x 50 mm | Vwr | 631-0146 | |
| DAPT γ? ингибитор секретазы | Sigma Aldrich | D5942 | |
| DC101 антимышиный VEGFR-2 клон | BioXcell | BP0060 | |
| DC101 изотип крысы IgG1 | BioXcell | BP0290 | |
| диметилсульфоксид (ДМСО) | Sigma-Aldrich | D2438-5X | Biohazard: следует соблюдать соответствующие инструкции по технике безопасности при работе с |
| DPBS (10x), без кальция, без магния | Gibco, Thermofisher scientific | 14200067 | |
| EDTA 40 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 15575-038 | |
| Эмбриональные стволовые клетки Фетальная бычья сыворотка | Gibco, Thermofisher scientific | 16141-079 | Должны быть протестированы на максимальную жизнеспособность и рост ES-клеток. Тепловая инактивация при 60°С; C и хранить при &минус; 20 ° C на срок до 1 года |
| Eppendorf Microcentrifuge 5415R | Eppendorf AG | ||
| Эритропоэтин, человеческий (hEPO), 250 Ед (2,5 &; g) (1 мл) | Roche | 11120166001 | |
| ESGRO Рекомбинантный мышиный белок LIF (10? единиц 1 мл) | Пробирки Milipore, Merck | ESG1107 | |
| Falcon 15 мл | пробирки Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon 50 мл | Greiner Bio-0ne | 227270 | |
| Фильтрующий наконечник прозрачный ,стерильный F.Gilson, P-200 | Greiner Bio-One | 739288 | |
| Фильтрующий наконечник ,прозрачный ,стерильный F.Gilson, P10 | Greiner Bio-One | 771288 | |
| Фильтрующий наконечник ,прозрачный , стерильные F.Gilson, P1000 | Greiner Bio-One | 740288 | |
| FITC конъюгированные анти-& альфа; Актин гладкой мускулатуры (СМА) (клон 1A4) | Sigma Aldrich | F3777 | |
| FITC конъюгированный крысиный антимышиный CD45 (клон 30-F11) | Biolegend | 103107 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Антитело (клон RTK4530) | Biolegend | 400605 | |
| Флуоресцентный монтажный материал | DAKO | S3023 | |
| Gascompress | Cutisoft | 45846 | |
| Марля Cutisoft 10 x 10 см | Bsn Medical | 45844_00 | |
| Гелевая промокательная бумага, Grade GB003 | Ватман | WHA10547922 | |
| Раствор желатина, тип B | Sigma-Aldrich | G1393-100 мл | |
| Glasgow's MEM (GMEM) | Gibco, Thermofisher scientific | 21710082 | |
| IHC Zinc Fixative | BD Pharmigen | 550523 | |
| IncuSafe CO2 инкубатор | PHCBi | MCO-170AICUV-PE | |
| интерлейкин-6, человеческий (hIL-6) | Roche | 11138600001 | |
| L-глутамин 200 мМ | Gibco, Thermofisher scientific | 25030-024 | |
| MEM Раствор заменимых аминокислот (100x) | Gibco, Thermofisher Scientific | 11140035 | |
| Коробка для микроскопа | Kartell Labware | 278 | |
| Предметное стекло для микроскопа, стекло Starfrost | Knittel | VS113711FKB.0 | |
| Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00110467 | |
| Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00148981 | |
| Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00093576 | |
| Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00154014 | |
| Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00096292 | |
| Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | ||
| Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT01658692 | |
| Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00097020 | |
| Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT00156982 | |
| Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00153104 | |
| Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT01052044 | |
| Mm_Tek_1_SG QuantiTect Праймерный анализ | |||
| мыши (2 М) | Gibco, Thermofisher scientific | A24903 | Хранить флаконы в жидком азоте (195,79 ° C) |
| Линия эмбриональных стволовых клеток мыши 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033) | ATCC | SCRC-1033 | Получено доктором А. Надь, Научно-исследовательский институт Сэмюэля Луненфельда, больница Маунт-Синай, 600 Юниверсити Авеню, Торонто, Онтарио, M5G 1X5, Канада. [Хаджантонакис, А. К., и др. Механизмы развития. 76 (1– 2), 79– 90 (1998)]. |
| Линии эмбриональных стволовых клеток мыши Acvrl1 +/- и Acvrl1 +/+ | Получены в Медицинском центре Лейденского университета [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698– 2712 (2018)]. | ||
| Эмбриональные стволовые клетки мыши линии E14 | предоставлены лабораторией M Letarte и получены в соответствии с Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635– 3642 (2001). | ||
| Эмбриональные стволовые клетки мыши линии R1 (ATCC SCRC-1011) | ATCC | SCRC-1011 | Получено доктором А. Надь, Научно-исследовательский институт Сэмюэля Луненфельда, больница Маунт-Синай, 600 Юниверсити Авеню, Торонто, Онтарио, M5G 1X5, Канада. [Надь, А., и др. Процедуры Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 90 (18), 8424– 8428 (1993)]. |
| Эмбриональные стволовые клетки мыши линии Z/Red (штамм 129/Ola) | Создано доктором А. Надь, Научно-исследовательский институт Сэмюэля Луненфельда, больница Маунт-Синай, 600 Юниверсити Авеню, Торонто, Онтарио, M5G 1X5, Канада [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241– 246 (2004)]. | ||
| Спектрофотометр NanoDrop 1000 UV/VIS | Thermo Fischer Scientific | ND-1000 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PDGF-BB, рекомбинантное антитело | Peprotech | 100-14B | |
| Pecam-1, Rat Anti-Mouse | BD Biosciences | 550274 | |
| пенициллин-стрептомицин (10 000 Ед/мл) | Gibco, Thermofisher scientific | ||
| Чашка Петри, PS, 94/16 мм, стандартная, с вентиляционными отверстиями, стерильная | Greiner Bio-One | 633181 | |
| Pipetboy acu 2 | Integra-Biosciences | 155 019 | |
| Pipetman G Multichannel P8 x 200G | Gilson | F144072 | |
| Pipetman G Стартовый набор, 4 пипетки, P2G, P20G, P200G, P1000G | Gilson | F167360 | |
| рекомбинантный человек BMP-4 Protein | R& D Systems | 314-BP | |
| RNeasy Plus mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
| Серологические пипетки, 10 мл | Greiner Bio-One | 607 180 | |
| Серологические пипетки, 25 мл | Greiner Bio-One | 760 180 | |
| Серологические пипетки, 5 мл | Greiner Bio-One | 606 180 | |
| Гидроксид натрия (NaOH) | Merck | 106498 | |
| Пируват натрия 100 мМ | Gibco, Thermofisher scientific | 11360039 | |
| Пробирки 5мл круглое дно с крышкой клеточного фильтра | Corning | 352235 | |
| Thermal Cycler, T100 | Biorad | 1861096 | |
| Triton X-100 (BioXtra) | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Gibco, Thermofisher scientific | ||
| Трипсин (2,5%) | Gibco, Thermofisher Scientific | 15090046 | |
| Система вакуумных фильтров/бутылок для хранения, 500 мл | Corning | 430758 | |
| VEGFA165 , рекомбинантная мышиная вода | Peprotech | 450-32 | |
| , стерильный | Fresenius-Kabi | B230531 | |
| водяная баня, Lab-Line Digital | Thermo Fischer Scientific | 18052A |
Ссылки
- Moffat, J. G., Vincent, F., Lee, J. A., Eder, J., Prunotto, M. Opportunities and challenges in phenotypic drug discovery: an industry perspective. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (8), 531-543 (2017).
- Horvath, P., et al. Screening out ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
