Методическая статья

В пробирке Трехмерный анализ ангиогенеза с использованием эмбриональных стволовых клеток мыши для моделирования сосудистых заболеваний и тестирования лекарств

DOI:

10.3791/62554

⸱

11 мая 2021 г.

 ,  ,  , 
1Einthoven Laboratory for Experimental Vascular Medicine, Department of Internal Medicine (Nephrology), Leiden University Medical Center, 2Institute Physics for Medicine Paris, INSERM U1273, ESPCI Paris, CNRS FRE 2031, 3MEMOLIFE Laboratory of Excellence and PSL Research University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом анализе используются эмбриональные стволовые клетки мыши, дифференцированные в эмбриоидные тела, культивируемые в геле 3D-коллагена, для анализа биологических процессов, которые контролируют прорастающий ангиогенез in vitro. Методика может быть применена для тестирования лекарств, моделирования заболеваний, а также для изучения конкретных генов в контексте делеций, которые являются эмбрионально летальными.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Последние достижения в области индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) и технологий редактирования генов позволяют разрабатывать новые модели заболеваний на основе клеток человека для программ открытия фенотипических лекарств (PDD). Хотя эти новые устройства могут более точно предсказывать безопасность и эффективность исследуемых препаратов на людях, их разработка в клинике по-прежнему в значительной степени зависит от данных о млекопитающих, в частности, от использования моделей болезней мышей. Таким образом, параллельно с моделями заболеваний органоидов человека или «орган-на-чипе» разработка соответствующих моделей мышей in vitro является неудовлетворенной потребностью для оценки прямых сравнений эффективности и безопасности лекарств между видами и в условиях in vivo и in vitro . Здесь описан анализ прорастания сосудов, в котором используются эмбриональные стволовые клетки мыши, дифференцированные в эмбриоидные тела (БЭ). Васкуляризированные БЭ, культивируемые на 3D-коллагеновом геле, развивают новые кровеносные сосуды, которые расширяются, процесс, называемый прорастающим ангиогенезом. Эта модель резюмирует ключевые особенности прорастающего ангиогенеза in vivo - образования кровеносных сосудов из ранее существовавшей сосудистой сети, включая отбор клеток кончика эндотелия, миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток, управление клетками, формирование трубок и рекрутирование клеток фремиссии. Он поддается скринингу на лекарства и гены, модулирующие ангиогенез, и показывает сходство с недавно описанными трехмерными (3D) сосудистыми анализами, основанными на технологиях iPSC человека.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

За последние три десятилетия открытие лекарств на основе мишеней (TDD) широко использовалось фармацевтической промышленностью при открытии лекарств. TDD включает в себя определенную молекулярную мишень, играющую важную роль в заболевании, и опирается на разработку относительно простых систем клеточных культур и считывания для скрининга лекарств1. Наиболее типичные модели заболеваний, используемые в программах TDD, включают традиционные методы культивирования клеток, такие как раковые клетки или иммортализированные клеточные линии, выращенные в искусственных средах и нефизиологических субстратах. Несмотря на то, что многие из этих моделей предоставили жизнеспособные инструменты для выявления успешных кандидатов на лекарства, использование таких систем может быть сомнительным из-за их низкой актуальности для болезней2.

Для большинства заболеваний основные механизмы действительно сложны, и часто обнаруживается, что различные типы клеток, независимые сигнальные пути и несколько наборов генов способствуют определенному фенотипу заболевания. Это также верно для наследственных заболеваний, где основной причиной является мутация в одном гене. С недавним появлением технологий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (iPSC) и инструментов редактирования генов теперь можно создавать 3D-органоиды и модели заболеваний органов на чипе, которые могли бы лучше повторять сложность человека in vivo 3,4. Развитие таких технологий связано с возрождением интереса к программам открытия фенотипических лекарств (PDD)1. PDD можно сравнить с эмпирическим скринингом, поскольку они не опираются на знание идентичности конкретной лекарственной мишени или гипотезу о ее роли в заболевании. В настоящее время все шире признается, что подход PDD вносит значительный вклад в открытие первых в своем классе лекарств5. Поскольку развитие технологий органоидов человека и «органов-на-чипе» все еще находится в зачаточном состоянии, ожидается, что модели iPSC (дополненные инновационными инструментами визуализации и машинного обучения6,7) предоставят в ближайшем будущем несколько новых сложных моделей клеточных заболеваний для скрининга лекарств и связанных с ними программ PDD для преодоления низкой производительности подхода TDD8, 9.

В то время как модели органоидов человека и «орган-на-чипе» могут дать важную информацию о сложности заболевания и идентификации новых лекарств, внедрение лекарств в новую клиническую практику также в значительной степени зависит от данных животных моделей для оценки их эффективности и безопасности. Среди них генетически модифицированные мыши, безусловно, являются наиболее предпочтительными моделями млекопитающих. У них есть много преимуществ, поскольку они имеют относительно короткое время генерации для млекопитающих, имеют много схожих фенотипов с болезнями человека и могут быть легко генетически манипулированы. Поэтому они широко используются в программах по открытию лекарств10. Тем не менее, преодоление разрыва между мышами и людьми остается важной задачей11. Разработка моделей мышей in vitro, эквивалентных человеческим органоидам и моделям «орган-на-чипе», может, по крайней мере, частично восполнить этот пробел, поскольку это позволит проводить прямые сравнения эффективности и безопасности лекарств между данными о мышах in vivo и людях in vitro .

Здесь описан анализ прорастания сосудов в эмбриоидных телах мышей (БЭ). Кровеносные сосуды состоят из эндотелиальных клеток (внутренняя оболочка стенок сосудов), клеток стенки (клетки гладких мышц сосудов и перициты)12. Этот протокол основан на дифференцировке мышиных эмбриональных стволовых клеток (мЭСК) в васкуляризированные БЭ с использованием висячих капель, которые повторяют de novo эндотелиальные клетки и дифференцировку клеток фрески13,14. ЭСК мышей могут быть легко установлены в культуре из изолированных бластоцист мыши на 3,5-й день, имеющих различный генетический фон15. Они также предоставляют возможности для клонального анализа, отслеживания происхождения и могут быть легко генетически обработаны для создания моделей заболеваний13,16.

Поскольку кровеносные сосуды питают все органы, неудивительно, что многие заболевания, если не все, связаны с изменениями в микроциркуляторном русле. При патологических состояниях эндотелиальные клетки могут принимать активированное состояние или могут стать дисфункциональными, что приводит к гибели клеток или миграции из кровеносных сосудов. Это может привести к чрезмерному ангиогенезу или разрежению сосудов, может вызвать аномальный кровоток и дефектный барьер кровеносных сосудов, что приводит к экстравазации иммунных клеток и воспалению12,17,18,19. Таким образом, исследования по разработке лекарств, модулирующих кровеносные сосуды, высоки, и уже было выявлено множество молекулярных игроков и концепций для терапевтического нацеливания. В этом контексте описанный протокол особенно подходит для построения моделей заболеваний и для тестирования лекарств, поскольку он повторяет ключевые особенности ангиогенеза прорастания in vivo, включая отбор эндотелиальных клеток кончика и стебля, миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток, руководство эндотелиальными клетками, формирование трубок и рекрутирование клеток фремиссии. Он также демонстрирует сходство с недавно описанными 3D-сосудистыми анализами, основанными на технологиях iPSCчеловека 20.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Медиаподготовка и культура mESC

  1. Приготовьте кондиционированную среду +/- (CM+/-), используя добавку 1x среда Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) с 10% (об./об.) инактивированной теплом фетальной бычьей сыворотки (FBS), 0,05 мМ β-меркаптоэтанола, 1x заменимых аминокислот (NEAA 1x), 2 мМ L-глутамина и 1 мМ пирувата натрия.
  2. Приготовьте кондиционированную среду +/+ (CM+/+) с использованием добавки CM+/- среды с фактором ингибирования лейкемии (LIF) (1,500 ЕД/мл) и 0.1 мМ β-меркаптоэтанола.
  3. Приготовьте кондиционированную среду +/+ в присутствии двух ингибиторов (CM+/+ 2i) с использованием добавки CM+/+ среды с 1 мкМ PD0325901 и 3 мкМ CHIR99021.
  4. Приготовьте 0,1% раствор желатина, смешав 25 мл предварительно подогретого 2% раствора желатина с 500 мл фосфатно-буферного физиологического раствора без кальция и магния (DPBS).
  5. Приготовьте 10-кратный буфер трипсина и версенфосфата (TVP 10x), смешав трипсин (2,5%) с TVP 1x (9,5% 10x DPBS, 1 мМ ЭДТА, 0,01% куриной сыворотки, 0,01% трипсина (2,5%) в H2O) (соотношение 1:10, объем/об.).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отфильтруйте все растворы через поровый фильтр 0,22 мкм. Храните питательную среду при температуре -20 °C в течение длительного времени, а другие реагенты храните при температуре 4 °C до 3 недель (см. Таблицу материалов).
  6. Покройте две 12-луночные пластины для культивирования клеток 0,1% раствором желатина (500 мкл на лунку) и инкубируйте их в течение 30 мин в инкубаторе CO 2 (37 °C, 5% CO2, влажная атмосфера).
  7. Вымойте пластины с желатиновым покрытием PBS и добавьте 500 мкл среды CM+/-.
  8. Разморозьте два флакона по 1 x 106 криоконсервированных облученных эмбриональных фибробластов мыши (MEF) при 37 ° C и перенесите клеточную суспензию в коническую трубку с 5 мл среды CM +/-.
  9. Центрифугируйте клетки при 200 x g в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Аспирируют среду и осторожно ресуспендируют клеточную гранулу в 12 мл среды CM+/- в концентрации 1,67 х10,5 клеток на мл.
  10. Высевают 500 мкл суспензии MEF в 12-луночную клеточную культуральную пластину (2,4 x 10,5 клеток на см 2 ) и инкубируют пластину в течение ночи (o / n) в инкубаторе CO 2.
  11. Разморозьте один флакон криоконсервированных мЭСК (1 x 106) в среде CM+/+ 2i.
  12. Засейте суспензию mESC на предварительно промытую 12-луночную пластину с MEF в 1 мл среды CM+/+ 2i и перенесите планшет в инкубатор CO2 . Ежедневно обновляйте средство.
  13. При слиянии 70% промойте колонии mESC с помощью DPBS. Добавьте 150 мкл теплого 10-кратного буфера TVP и инкубируйте при RT в течение 30 с, чтобы инициировать ферментативную диссоциацию.
  14. Осторожно удалите буфер TVP, ресуспендируйте клетки в 1 мл среды CM+/+ 2i и диссоциируйте колонии на отдельные клетки путем осторожного пипетирования.
  15. Пропустите клетки, перенеся их на новую 12-луночную пластину для культивирования клеток с MEF (коэффициент расщепления: 1:3-1:5). Аккуратно перемешайте, чтобы распределить клетки и инкубировать в инкубаторе CO2 .
  16. Освежите питательную среду (2-3 мл) и ежедневно наблюдайте за ростом/морфологией клеток. Повторяйте последовательное прохождение с 70% слиянием каждые 2 дня. Переключитесь на среду CM+/+ в течение двух пассажей, прежде чем начать дифференцировку клеток.

2. Формирование ЭБ в висячей капле

  1. Приготовьте свежую среду для дифференцировки мезодермы, дополнив среду CM+/- основным фактором роста фибробластов (bFGF) (50 нг·мл-1) и костным морфогенетическим белком 4 (BMP-4) (5 нг·мл-1) и держите его при температуре 4 °C до использования.
  2. Покройте одну лунку 6-луночного планшета для культивирования клеток 500 мкл 0,1% раствора желатина и поместите его в инкубатор CO2 на 30 мин.
  3. Вымойте пластины с желатиновым покрытием PBS и добавьте 500 мкл среды CM+/-.
  4. Чтобы получить чистую популяцию мЭСК, трипсинизируют пластину для культивирования клеток 10-кратным буфером TVP в течение 30 с при ЛТ, ресуспендируют клетки в среде дифференцировки мезодермы объемом 1 мл, а затем переносят их в 6-луночную пластину, покрытую желатином, в течение 30 мин, позволяя МЭФ прикрепляться, пока мЭСК остаются в суспензии.
  5. Соберите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 50 мл и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра Нойбауэра и красителя трипанового синего для исключения живых/мертвых клеток.
  6. Центрифугируют клетки при 200 x g в течение 5 мин при RT. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в среде дифференцировки мезодермы до достижения 4,55 x 104 клеток на мл.
  7. Наполните дно посуды из полистирола с низкой насадкой 94 мм 15 мл стерильной воды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Четыре чашки с висячими каплями (1,6 x 105 клеток в 3,52 мл среды) потребуются для тестирования одного конкретного состояния с использованием 3D-анализа прорастающего ангиогенеза.
  8. Перенесите клеточную суспензию в стерильный пластиковый резервуар и загрузите в четыре положения многоканальной пипетки 22 мкл клеточной суспензии на канал (1 x10,3 клетки на 22 мкл капли).
  9. Поднимите и переверните крышку посуды диаметром 94 мм и поставьте ее на чистую поверхность шкафа внутренней стороной вверх.
  10. Нанесите 40 капель клеточной суспензии на внутреннюю поверхность каждой крышки. Осторожно переверните крышку без помех и положите ее обратно на блюдо так, чтобы капли были обращены к воде.
  11. Инкубируйте посуду в инкубаторе CO2 . Считайте, что это день дифференциации 0. Выдерживайте пластины в течение 4 дней до образования ЭБ.

3. Конкурсный анализ положения ячейки наконечника

  1. Культивируют одну флуоресцентную и одну нефлуоресцентную линию mESC, как описаноранее 13. В качестве примера используются мЭСК 7ACS/EYFP, помеченные желтым цветом, и мЭСК R1.
  2. Приготовьте мозаичные ЭБ, смешав равные количества двух линий mESC (соотношение 1:1), и инкубируйте подвесные чашки в инкубаторе CO 2, как описано на шаге2 .

4. Плавающая культура БЭ для дифференцировки сосудов

  1. Перед сбором ЭБ из висячих капель подготовьте следующее.
    1. Приготовьте 5% раствор агара вН2О и стерилизуйте его автоклавированием (20 мин при 120 °С).
    2. Используйте теплый 5% раствор агара для приготовления среды G-MEM BHK-21, содержащей 1% агара, и быстро налейте 3 мл в одну из 60-миллиметровых полистирольных посуд. Дайте агару застыть в течение 1 часа при RT. Храните посуду при температуре 4 °C до использования.
  2. Приготовьте свежую 2-кратную среду для сосудистой дифференцировки, дополнив среду CM+/- bFGF (100 нг·мл-1) и VEGF-A (50 нг·мл-1). Хранить средство при температуре 4 °C до использования.
  3. Соберите висячие капли в коническую пробирку объемом 15 мл с помощью пипетки P1000 и удалите надосадочную жидкость через несколько минут после осаждения EB.
  4. Ресуспендировать БЭ в 3 мл 2-кратной среды для сосудистой дифференцировки, перенести суспензию ЭБ в одну суспензию, покрытую агаром, равномерно распределить БЭ, чтобы избежать агрегации.
  5. Инкубируйте чашки в инкубаторе CO 2 и обновляйте среду каждые2 дня до 9-го дня, используя 1x среду для сосудистой дифференцировки в присутствии bFGF (50 нг·мл-1) и VEGF-A (25 нг·мл-1).
  6. В качестве альтернативы добавляют тромбоцитарный фактор роста-BB (PDGF-BB) (10 нг · мл -1 на 4-й день и 5 нг · мл-1 на 6-й и 8-й день) в сосудистую дифференцировочную среду, чтобы стимулировать дифференцировку клеток стенки.

5. Анализ проточной цитометрии

  1. Соберите 9-дневные ЭБ в коническую пробирку объемом 15 мл с помощью пипетки P1000 и промойте их один раз теплым PBS.
  2. Добавьте 1 мл среды G-MEM BHK-21, содержащей 0,2 мг·мл-1 коллагеназы А, и инкубируйте клетки в инкубаторе CO2 в течение 5 минут.
  3. Диссоциируйте ЭБ, аккуратно пипетируя вверх и вниз пипеткой P1000.
  4. Остановите активность коллагеназы, добавив 1 мл холодной среды G-MEM BHK-21 с 10% FBS.
  5. Центрифугируйте клетки при 200 x g в течение 5 мин при RT.
  6. Ресуспендируют клетки в 500 мкл PBS с 2% FBS.
  7. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра Нойбауэра.
  8. Ресуспендировать 400 000 клеток в 100 мкл PBS с 2% FBS на одно условие окрашивания.
  9. Инкубируют клетки в течение 45 мин при 4 °C со следующими антителами: конъюгированным антителом PECAM-1 против мыши APC (клон MEC13.3) и конъюгированным антителом против мыши CD45 (клон 30-F11) или антителами контроля изотипа.
  10. Дважды промойте клетки 1 мл PBS, содержащего 2% FBS.
  11. Ресуспендируют клетки, чтобы достичь конечной концентрации 5 x10,6 клеток на мл.
  12. Отфильтруйте ячейки с помощью пробирки из полистирола с круглым дном и защелкивающейся крышкой сетчатого фильтра.
  13. Проанализируйте 20 000 событий PECAM-1 (+) с помощью проточной цитометрии.

6.3D Анализ прорастающего ангиогенеза и иммунофлюоресцентное окрашивание

  1. На 9-й день приготовьте среду для прорастания, добавив 10% FBS (об./об.), bFGF (50 нг·мл-1), VEGF-A (25 нг·мл-1), человеческий рекомбинантный эритропоэтин (hEPO) (20 нг·мл-1), человеческий интерлейкин-6 (IL-6) (10 нг·мл-1), 0,05 мМ β-меркаптоэтанол, NEAA (1x), L-глютамин (1x), пируват натрия (1x), коллаген крысиного хвоста I типа (1,25 мг·мл-1), и NaOH (3,1 мМ) в среду GMEM BHK-1.
  2. Чтобы избежать гелеобразования коллагена, поддерживайте среду для проращивания на льду до использования.
  3. Чтобы оценить эффект проангиогенных молекул, добавьте выбранное лекарство или носитель в среду для прорастания в выбранной концентрации.
  4. Соберите 9-дневные ЭБ из одной чашки агара диаметром 60 мм в коническую пробирку объемом 15 мл (эквивалентно одному условию) и удалите надосадочную жидкость через несколько минут после осаждения.
  5. Накройте дно чашки для культур диаметром 35 мм 1 мл прорастающей среды и инкубируйте при 37 ° C в течение 5 минут, чтобы вызвать гелеобразование.
  6. Ресуспендируют ЭБ в 2 мл среды для холодного проращивания.
  7. Перенесите суспензию в культуральную чашку диаметром 35 мм, покрытую первым слоем проращивающей среды.
  8. Распределите ЭБ по всей тарелке и убедитесь, что они находятся на равном расстоянии друг от друга. Инкубируйте чашку в инкубаторе CO2 . Формирование первого ростка происходит в течение 24-48 часов.
  9. На 12-й день коллагеновый гель, содержащий ЭБ, осторожно переносится на предметное стекло (75 х 26 мм) с помощью шпателя.
  10. Удалите лишнюю жидкость с помощью пипетки (P1000) и обезвоживайте гель, положив поверх геля марлевый лист нейлонового льна и впитывающие фильтрующие карты (гелевую промокательную бумагу). Надавите, поместив груз (250 г) на 2 мин. Осторожно снимите нейлоновую / фильтровальную бумагу и дайте предметным стеклам высохнуть на воздухе в течение 30 минут при RT.
  11. Промойте предметные стекла три раза с помощью PBS в течение 5 минут при RT.
  12. Исправьте ЭБ раствором цинка (см. Таблицу материалов) о/при 4 °C. В качестве альтернативы можно закрепить мозаичные флуоресцентные ЭБ параформальдегидом (ПФА) (4%) o/n при 4 °C в темноте.
  13. Снимите фиксатор. Промойте предметные стекла пять раз с помощью PBS в течение 5 минут при RT.
  14. Пермеабилизируйте ЭБ в PBS, содержащий 0,1% Triton-X100, в течение 15 мин при ЛТ.
  15. Удалите раствор для пермеабилизации. Промойте предметные стекла пять раз с помощью PBS в течение 5 минут.
  16. Инкубируйте ЭБ в блокирующем буфере (PBS с 2% бычьим сывороточным альбумином, BSA) в течение 1 ч при ЛТ.
  17. Чтобы окрасить эндотелиальные ростки, используйте первичное антитело против мыши против PECAM-1 крысы (разведение 1:100) в блокирующем буфере o/n при 4 ° C.
  18. Промойте предметные стекла пять раз с помощью PBS в течение 5 минут.
  19. Инкубируйте предметные стекла с вторичным антителом Alexa 555 против крыс в блокирующем буфере (разведение 1:250) и, при необходимости, с FITC-конъюгированным антителом против α-SMA в блокирующем буфере (разведение 1:250) для окрашивания клеток росписи в течение 2 ч при RT в темноте.
  20. Промойте предметные стекла три раза с помощью PBS в течение 5 минут и один раз с H20 перед их установкой.

7. Конфокальная визуализация, морфометрический и количественный анализ эндотелиальных ростков БЭ

  1. Получение изображений иммуноокрашенных ЭБ с высоким разрешением путем слияния в фокальной плоскости (z-стекирование) с помощью конфокального микроскопа. Используйте объектив с 10-кратным увеличением для получения изображения целых ЭБ.
  2. Проанализируйте изображения, полученные с помощью ImageJ, для оценки морфологии и количественной оценки характеристик положительных эндотелиальных ростков PECAM-1 в соответствии с установленными методами количественной оценки13,14,21.
    1. Рассчитайте среднее количество эндотелиальных ростков на ЭБ, вручную подсчитав общее количество ростков на отдельные ЭБ.
    2. Измерьте длину отдельных ростков с помощью инструмента рисования ImageJ. Определите основание эндотелиального ростка, начиная с области ядра БЭ, и вручную проведите линию до конца кончика ростка.
    3. Рассчитайте среднее количество ячеек верхушки на росток, вручную подсчитав количество клеток кончиков на отдельный росток, а затем рассчитайте среднее значение на ЭБ.
    4. Рассчитайте ориентацию филоподии, вручную определив ось родительского ростка, и измерьте острый угол между ними с помощью программного инструмента угла ImageJ. Рассчитайте количество ростков с ориентацией >50° и разделите его на общее количество ростков интересующего ЭБ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Углы всегда находились в диапазоне от 0° до 90°.
  3. Получение изображений иммуноокрашенных БЭ с высоким разрешением с помощью конфокального микроскопа. Используйте объектив с 40-кратным увеличением для получения изображений с высоким разрешением отдельных эндотелиальных ростков.
  4. Количественно оцените покрытие сосудов положительными ЕС-ростками PECAM-1, окруженными положительными MC α-SMA, с помощью программного обеспечения ImageJ.
    1. Разделите объединенные изображения на отдельные красный и зеленый каналы.
    2. Преобразуйте изображения в двоичную форму.
    3. Измерьте общую клеточную площадь ростка, занятую отдельно PECAM-1 (эндотелиальные клетки, помеченные красным цветом) и α-SMA (настенные клетки, помеченные зеленым цветом) положительными клетками.
    4. Сгенерируйте объединенное изображение с помощью функции калькулятора изображений и оператора AND. Измерьте общую площадь ячейки изображения. Чтобы рассчитать охват, разделите площадь колокализованного изображения на площадь двоичного изображения PECAM-1.
  5. Чтобы проанализировать клеточную конкуренцию за положение эндотелиальных клеток верхушки / стебля ростков, разработанных мозаичными ЭБ, вручную оцените количество верхушечных клеток и отметьте их генотипическое происхождение на основе сигнала флуоресценции. Рассчитайте средние значения на EB.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обзор протокола анализа прорастания кровеносных сосудов показан на рисунке 1. Девятидневные БЭ, полученные из трех независимых линий 129 / Ola mESC (Z / Red, R1 и E14), были ферментативно диссоциированы на отдельные клетки с использованием коллагеназы A. Клетки окрашивали для PECAM-1 и анализировали с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS), как описано. Все клеточные линии демонстрировали надежную эндотелиальную дифференцировку, и никаких различий в их способности дифф...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает объективный, надежный и воспроизводимый 3D-анализ прорастания сосудов на основе EB, который поддается скринингу лекарств и генов, модулирующих ангиогенез. Этот метод имеет преимущества по сравнению со многими широко используемыми двумерными (2D) анализами с использованием культур эндотелиальных клеток, таких как эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC), для мониторинга миграции (анализ боковых царапин или анализ камеры Бойдена)22,23 или пролиферации (подсчет количества клеток, обнаруже...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), ведущей программы стипендиатов Марии Склодовской-Кюри COFUND и Ассоциации Maladie de Rendu-Osler (AMRO).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-меркаптоэтанолMilipore, Merck805740Biohazard: следует соблюдать надлежащие инструкции по технике безопасности при обращении
Agar NobleDifco, BD Pharmigen214220
Alexa Fluo 555 козий анти-крысиный IgGLife technologiesA21434
APC конъюгированный крысиный анти-мышиный PECAM-1 антитело (клон MEC13.3)BD Biosciences551262
APC Rat IgG2a κ Контроль изотипа (Клон  R35-95)BD Biosciences553932
Axiovert 25 микроскоп для инвертированной фазоконтрастной культуры тканейZEISS
Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF)Peprotech450-33
, Allegra X-15RBeckman Coulter392932
шкаф биобезопасности BioVanguard (Green Line)Telstar133H401001
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Sigma-AldrichA9418
Камера для подсчета клеток, Buerker, 0,100 ммMarienfeld640211
Чашки для клеточных культур 60 x 15 ммCorning353802
Чашки для клеточных культур, 35 x 10 ммCorning353801
Тарелки для клеточных культур 12-луночные Corning3512
CFX96 Touch Система обнаружения ПЦР в реальном времениBiorad1855196
Сыворотка курицыSigma-AldrichC5405
CHIR-99021 (CT99021) HClSelleckchemS2924
Collagen I, высокая концентрация, крысиный хвост, 100 мгCorning354249
коллагеназой ARoche10103586001
Конфокальное лазерное сканирование Микроскоп, TCS SP5Leica
Cover glasses, 24 &x 50 mmVwr631-0146
DAPT γ? ингибитор секретазыSigma AldrichD5942
DC101 антимышиный VEGFR-2 клонBioXcellBP0060
DC101 изотип крысы IgG1BioXcellBP0290
диметилсульфоксид (ДМСО)Sigma-AldrichD2438-5XBiohazard: следует соблюдать соответствующие инструкции по технике безопасности при работе с
DPBS (10x), без кальция, без магнияGibco, Thermofisher scientific14200067
EDTA 40 mMGibco, Thermofisher scientific15575-038
Эмбриональные стволовые клетки Фетальная бычья сывороткаGibco, Thermofisher scientific16141-079Должны быть протестированы на максимальную жизнеспособность и рост ES-клеток. Тепловая инактивация при 60°С; C и хранить при &минус; 20 ° C на срок до 1 года
Eppendorf Microcentrifuge 5415REppendorf AG 
Эритропоэтин, человеческий (hEPO), 250 Ед (2,5 &; g) (1 мл)Roche11120166001
ESGRO Рекомбинантный мышиный белок LIF (10? единиц    1 мл)Пробирки Milipore, MerckESG1107
Falcon 15 млпробирки Greiner Bio-One188271
Falcon 50 млGreiner Bio-0ne227270
Фильтрующий наконечник прозрачный ,стерильный F.Gilson, P-200Greiner Bio-One739288
Фильтрующий наконечник ,прозрачный ,стерильный F.Gilson, P10Greiner Bio-One771288
Фильтрующий наконечник ,прозрачный , стерильные F.Gilson, P1000Greiner Bio-One740288
FITC конъюгированные анти-& альфа; Актин гладкой мускулатуры (СМА) (клон 1A4)Sigma AldrichF3777
FITC конъюгированный крысиный антимышиный CD45 (клон 30-F11)Biolegend103107
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Антитело (клон RTK4530)Biolegend400605
Флуоресцентный монтажный материалDAKOS3023
GascompressCutisoft45846
Марля Cutisoft 10 x 10 смBsn Medical45844_00
Гелевая промокательная бумага, Grade GB003ВатманWHA10547922
Раствор желатина, тип BSigma-AldrichG1393-100 мл
Glasgow's MEM (GMEM)Gibco, Thermofisher scientific21710082
IHC Zinc FixativeBD Pharmigen550523
IncuSafe CO2 инкубаторPHCBiMCO-170AICUV-PE
интерлейкин-6, человеческий (hIL-6)Roche11138600001
L-глутамин 200 мМGibco, Thermofisher scientific25030-024
MEM Раствор заменимых аминокислот (100x)Gibco, Thermofisher Scientific11140035
Коробка для микроскопаKartell Labware278
Предметное стекло для микроскопа, стекло StarfrostKnittelVS113711FKB.0
Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00110467
Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00148981
Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00093576
Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00154014
Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00096292
Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagen
Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT01658692
Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00097020
Mm_Notch1_1_SG QuantiTect PrimerQiagenQT00156982
Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00153104
Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect PrimerQiagenQT01052044
Mm_Tek_1_SG QuantiTect Праймерный анализ
мыши  (2 М)Gibco, Thermofisher scientificA24903Хранить флаконы в жидком азоте (195,79 ° C)
Линия эмбриональных стволовых клеток мыши 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033)ATCCSCRC-1033Получено доктором А. Надь, Научно-исследовательский институт Сэмюэля Луненфельда, больница Маунт-Синай, 600 Юниверсити Авеню, Торонто, Онтарио, M5G 1X5, Канада. [Хаджантонакис, А. К., и др. Механизмы развития. 76 (1– 2), 79– 90 (1998)].
Линии эмбриональных стволовых клеток мыши Acvrl1 +/- и Acvrl1 +/+Получены в Медицинском центре Лейденского университета [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698– 2712 (2018)].
Эмбриональные стволовые клетки мыши линии E14предоставлены лабораторией M Letarte и получены в соответствии с Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635– 3642 (2001).
Эмбриональные стволовые клетки мыши линии R1 (ATCC SCRC-1011)ATCCSCRC-1011Получено доктором А. Надь, Научно-исследовательский институт Сэмюэля Луненфельда, больница Маунт-Синай, 600 Юниверсити Авеню, Торонто, Онтарио, M5G 1X5, Канада. [Надь, А., и др. Процедуры Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 90 (18), 8424– 8428 (1993)].
Эмбриональные стволовые клетки мыши линии Z/Red (штамм 129/Ola)Создано доктором А. Надь, Научно-исследовательский институт Сэмюэля Луненфельда, больница Маунт-Синай, 600 Юниверсити Авеню, Торонто, Онтарио, M5G 1X5, Канада [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241– 246 (2004)].
Спектрофотометр NanoDrop 1000 UV/VISThermo Fischer ScientificND-1000
PD0325901SelleckchemS1036
PDGF-BB, рекомбинантное антителоPeprotech100-14B
Pecam-1, Rat Anti-MouseBD Biosciences550274
пенициллин-стрептомицин (10 000 Ед/мл)Gibco, Thermofisher scientific
Чашка Петри, PS, 94/16 мм, стандартная, с вентиляционными отверстиями, стерильнаяGreiner Bio-One633181
Pipetboy acu 2Integra-Biosciences155 019
Pipetman G Multichannel P8 x 200GGilsonF144072
Pipetman G Стартовый набор, 4 пипетки, P2G, P20G, P200G, P1000GGilsonF167360
рекомбинантный человек BMP-4 ProteinR& D Systems314-BP
RNeasy Plus mini KitQIAGEN74134
Серологические пипетки, 10 млGreiner Bio-One607 180
Серологические пипетки, 25 млGreiner Bio-One760 180
Серологические пипетки, 5 млGreiner Bio-One606 180
Гидроксид натрия (NaOH)Merck106498
Пируват натрия 100 мМGibco, Thermofisher scientific11360039
Пробирки 5мл круглое дно с крышкой клеточного фильтраCorning352235
Thermal Cycler, T100Biorad1861096
Triton X-100 (BioXtra)Sigma AldrichT9284
Trypan Blue Solution, 0,4%Gibco, Thermofisher scientific
Трипсин (2,5%)Gibco, Thermofisher Scientific15090046
Система вакуумных фильтров/бутылок для хранения, 500 млCorning430758
VEGFA165 , рекомбинантная мышиная водаPeprotech450-32
, стерильныйFresenius-KabiB230531
водяная баня, Lab-Line DigitalThermo Fischer Scientific18052A
Настольная центрифуга Z605212QT00099064 Инактивированные эмбриональные фибробласты мышей (ICR) QT00114576 1514012215250061

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moffat, J. G., Vincent, F., Lee, J. A., Eder, J., Prunotto, M. Opportunities and challenges in phenotypic drug discovery: an industry perspective. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (8), 531-543 (2017).
  2. Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
  3. Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. Organs-on-chips: into the next decade. Nature Reviews. Drug Discovery. , (2020).
  4. Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-Chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
  5. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507-519 (2011).
  6. Hussain, S., et al. High-content image generation for drug discovery using generative adversarial networks. Neural Networks: The Official Journal of the INternational Neural Network Society. 132, 353-363 (2020).
  7. Scheeder, C., Heigwer, F., Boutros, M. Machine learning and image-based profiling in drug discovery. Current Opinion in Systems Biology. 10, 43-52 (2018).
  8. Wagner, B. K., Schreiber, S. L. The power of sophisticated phenotypic screening and modern mechanism-of-action methods. Cell Chemical Biology. 23 (1), 3-9 (2016).
  9. Scannell, J. W., Bosley, J. When quality beats quantity: Decision theory, drug discovery, and the reproducibility crisis. PLoS One. 11 (2), 0147215(2016).
  10. Webster, J. D., Santagostino, S. F., Foreman, O. Applications and considerations for the use of genetically engineered mouse models in drug development. Cell and Tissue Research. 380 (2), 325-340 (2020).
  11. Howland, D. S., Munoz-Sanjuan, I. Mind the gap: models in multiple species needed for therapeutic development in Huntington's disease. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Scoiety. 29 (11), 1397-1403 (2014).
  12. Galaris, G., Thalgott, J. H., Lebrin, F. P. G. Pericytes in hereditary hemorrhagic telangiectasia. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1147, 215-246 (2019).
  13. Thalgott, J. H., et al. Decreased expression of vascular endothelial growth factor receptor 1 contributes to the pathogenesis of hereditary hemorrhagic telangiectasia type 2. Circulation. 138 (23), 2698-2712 (2018).
  14. Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nature Medicine. 16 (4), 420-428 (2010).
  15. Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
  16. Elling, U., et al. A reversible haploid mouse embryonic stem cell biobank resource for functional genomics. Nature. 550 (7674), 114-118 (2017).
  17. Cheng, J., et al. Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders. Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).
  18. Chade, A. R. Small vessels, big role: Renal microcirculation and progression of renal injury. Hypertension. 69 (4), 551-563 (2017).
  19. Jourde-Chiche, N., et al. Endothelium structure and function in kidney health and disease. Nature Reviews. Nephrology. 15 (2), 87-108 (2019).
  20. van Duinen, V., et al. Standardized and scalable assay to study perfused 3D angiogenic sprouting of iPSC-derived endothelial cells in vitro. Journal of Visualized Experiment: JoVE. (153), e59678(2019).
  21. Chappell, J. C., Taylor, S. M., Ferrara, N., Bautch, V. L. Local guidance of emerging vessel sprouts requires soluble Flt-1. Developmental Cell. 17 (3), 377-386 (2009).
  22. Sato, Y., Rifkin, D. B. Inhibition of endothelial cell movement by pericytes and smooth muscle cells: activation of a latent transforming growth factor-beta 1-like molecule by plasmin during co-culture. Journal of Cell Biology. 109 (1), 309-315 (1989).
  23. Tchaikovski, V., Olieslagers, S., Bohmer, F. D., Waltenberger, J. Diabetes mellitus activates signal transduction pathways resulting in vascular endothelial growth factor resistance of human monocytes. Circulation. 120 (2), 150-159 (2009).
  24. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International Journal of Experimental Pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
  25. Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (9), 551-564 (2011).
  26. Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 65-82 (2008).
  27. Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (186), (2007).
  28. Gau, D., et al. Pharmacological intervention of MKL/SRF signaling by CCG-1423 impedes endothelial cell migration and angiogenesis. Angiogenesis. 20 (4), 663-672 (2017).
  29. Torres-Estay, V., et al. Androgens modulate male-derived endothelial cell homeostasis using androgen receptor-dependent and receptor-independent mechanisms. Angiogenesis. 20 (1), 25-38 (2017).
  30. Merjaneh, M., et al. Pro-angiogenic capacities of microvesicles produced by skin wound myofibroblasts. Angiogenesis. 20 (3), 385-398 (2017).
  31. Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
  32. Wang, X., Phan, D. T. T., George, S. C., Hughes, C. C. W., Lee, A. P. 3D Anastomosed microvascular network model with living capillary networks and endothelial cell-lined microfluidic channels. Methods in Molecular Biology. 1612, Clifton, N.J. 325-344 (2017).
  33. Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 63 (1), 115-122 (1990).
  34. Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (10), 4113-4136 (2009).
  35. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425(2018).
  36. Belair, D. G., Schwartz, M. P., Knudsen, T., Murphy, W. L. Human iPSC-derived endothelial cell sprouting assay in synthetic hydrogel arrays. Acta Biomaterialia. 39, 12-24 (2016).
  37. Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures. Scientific Reports. 8 (1), 2671(2018).
  38. Henderson, A. R., Choi, H., Lee, E. Blood and lymphatic vasculatures on-chip platforms and their applications for organ-specific in vitro modeling. Micromachines (Basel). 11 (2), 147(2020).
  39. Lin, D. S. Y., Guo, F., Zhang, B. Modeling organ-specific vasculature with organ-on-a-chip devices. Nanotechnology. 30 (2), 024002(2019).
  40. Pollet, A., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using organ-on-chip technology. Bioengineering. 7 (1), Basel, Switzerland. 17(2020).
  41. Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи