Животные модели депрессии - Модель хронического отчаяния (CDM)

Аффективные расстройства, такие как большое депрессивное расстройство, относятся к числу наиболее частых и сложных психических заболеваний и связаны с высокими индивидуальными ^{страданиями1}, увеличением риска ^{самоубийств2} и вызывают значительное социально-экономическое ^бремя3 для общества. Несмотря на его воздействие, варианты лечения ограничены, и существует острая необходимость в разработке новых антидепрессивных вмешательств, особенно из-за инновационного кризиса в психофармакологии за последние десятилетия. Чтобы понять патофизиологию депрессии и проверить потенциальные новые агенты, срочно необходимы рациональные и достоверные модели на ^{животных4}. В течение почти полувека классический тест принудительного плавания (FST), первоначально описанный ^Porsolt5, использовался в качестве индукции и считывания для скрининга потенциальных новых антидепрессантов. Он состоит из периода форсированного плавания в течение 5-15 мин на 1-й день, последующего однократного применения препарата и оценки порции, которую мыши проводят неподвижно в воде в другой период плавания на следующий день. Считалось, что время неподвижности представляет собой отсутствующее естественное поведение побега и, как полагают, коррелирует со степенью депрессивного состояния у ^мышей5.

Классический FST подвергся резкой критике не только в научном ^{сообществе6,7,8,} но и в общественных ^СМИ8. Большинство споров вокруг FST связаны с короткими индукционными и лечебными периодами всего 1 день в классической парадигме. Утверждалось, что FST представляет собой скорее модель острой травмы, чем состояние, сопоставимое с депрессией человека. Кроме того, тест Порсолта может быть подходящим в качестве инструмента скрининга потенциальных антидепрессивных агентов, но он игнорирует отсроченное начало действия многих антидепрессантов.

Модель хронического отчаяния (CDM)9,10,11,12,13,14,15, которая получена из оригинального FST, представляет собой более подходящую животную модель депрессии. При CDM повторный плавательный стресс в течение 5 дней подряд позволяет избежать острых травматических эффектов. Не сумев вырваться из повторяющейся и продолжающейся стрессовой ситуации, мыши, как полагают, развивают состояние беспомощности, капитуляции и, в конечном счете, отчаяния. Эта парадигма более сопоставима с современными психологическими теориями развития депрессии у людей, чем с одной острой травмой, которая обычно переживается в начале посттравматического стрессового расстройства. Результирующее депрессивное состояние при CDM стабильно до 4 ^{недель9} и, следовательно, открывает возможность для более длительных периодов лечения, которые лучше сопоставимы с клиническими состояниями, где антидепрессантам обычно требуется 2-4 недели, чтобы показать ^{пользу16}.

Оценка депрессивно-подобного состояния должна быть многомерной. Измерение времени неподвижности, как в классическом FST, полезно, но не должно использоваться в качестве единственного параметра результата. Различные методы, которые описаны ниже, должны быть в состоянии отобразить различные измерения депрессивного состояния в соответствии с симптомами, обычно встречающимися у депрессивных людей. Подходящие оценки считывания могут включать поведение побега (время неподвижности9,10,17), тест на подвеску хвоста (TST)⁹, ангедонию (классический тест предпочтений сахарозы (SPT)¹⁸), поведение, ориентированное на мотивацию (тест предпочтения сахарозы (NPSPT)¹⁰), ожидание/поведение исследования (реакция на неоднозначный ^{сигнал19}); Тест Y-лабиринта9), электрофизиология (измерения долгосрочной пластичности (долгосрочное потенцирование, LTP; долгосрочная депрессия, LTD)²⁰), молекулярные оценки (паттерны активации непосредственных ранних генов (IEG); дальнейшие стрессовые ^{паттерны21}).

Теоретически, повторный тест на плавание может быть использован для индуцирования депрессивного состояния без какой-либо оценки времени неподвижности. Тем не менее, настоятельно рекомендуется предоставить, по крайней мере, экспериментальную серию доказательств концепции с временем неподвижности. Кроме того, МЧР представляет собой подходящую модель для оценки развития депрессивно-подобного состояния путем измерения времени неподвижности во время фазы индукции. Конкретные штаммы мышей или мышей, обработанных перед плаванием, могут быть оценены с точки зрения устойчивости или уязвимости к стрессу и индукции поведенческого отчаяния.

Все эксперименты проводились в соответствии с европейскими руководящими принципами (EU 2010/63) и в соответствии с немецким законом о защите животных (TierSchG), FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php), руководством национального органа по защите животных GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html) по уходу за лабораторными животными и их использованию, и были одобрены комитетом по защите животных Фрайбургского университета и Комитетом по этике по экспериментам в Страсбурге (CREMEAS, CEEA35), а также местные органы власти. Оба пола мышей дикого типа C57Bl6N в возрасте 10-14 недель (70-98 послеродовых дней, PND) использовались для экспериментов дикого типа (WT). В качестве стрессоустойчивой линии использовалась трансгенная линия мыши с усиленной экспрессией рецепторов аденозина _А1 под промотором CaMKII нейронов переднего ^{мозга9,15}. После экспериментов мышей приносили в жертву вывих шейки матки.

1. Подготовка

1. Получите лицензию на исследования на животных, включая тщательное экспериментальное планирование.
2. Прибытие: По прибытии вырастите животных в животноводческом учреждении для выполнения CDM. Если животные куплены у внешнего поставщика, дайте им не менее 2 недель на адаптацию к новой среде.
3. Содержание: Чтобы разместить животных, убедитесь, что клетки не заняты максимальным количеством животных, чтобы избежать дополнительного стресса. Гарантировать, что жилищные условия соответствуют международным рекомендациям мышиного жилья (для получения дополнительной информации см. ²²) и постоянно поддерживать их в любое время.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наиболее важные стандартные жилищные условия включают индивидуально вентилируемые клетки с 25-120 изменениями воздуха в час, 12-часовым циклом света-темноты, температурой как можно более стабильной (по крайней мере, постоянной между 20-24 °C), влажностью максимально стабильной (по крайней мере, между 45%-65%), грызущим материалом и присутствием укрытия, отсутствием индивидуального жилья.
4. Точка времени: Выполняйте все эксперименты в одно и то же время суток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не было проведено прямой оценки для проверки влияния дневного времени на МЧР, но большинство поведенческих тестов, оценивающих депрессивно-подобные состояния, показывают вариации в зависимости от времени ^{суток23,24,25}, и весьма вероятно, что дневное время также влияет на МЧР.
5. Материал для вложений: сведите вложенный материал к минимуму. Убедитесь, что в клетке нет ходовых колес и т. Д.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обогащенная среда предотвращает индукцию депрессивного состояния.
6. Состав группы: Позвольте животным оставаться в одной группе на протяжении всего эксперимента. Группируйте самок мышей вместе даже из разных пометов; группируйте самцов мышей вместе с самцами помета. Из-за предстоящей агрессивности, особенно самцов, кусание и парикмахерское искусство могут стать проблемой, поэтому особое внимание уделяется составу группы. Избегайте одиночного жилья, так как лишение является основным дополнительным стрессором.
7. Животные: Используйте различные штаммы мышей, хотя наблюдались определенные ^{различия9,10}. Часто используемым штаммом мыши является C57Bl6N. Маркировка мышей для выполнения парного статистического анализа (см. шаг 3.2.4).
8. Пол животных: в равной степени используйте как самцов, так и самок мышей.
9. Возраст животных: убедитесь, что животным не менее 10 недель (70 PND). Не используйте молодых животных из-за истощения, вызванного плаванием.
10. Оборудование: Используйте прозрачный стеклянный цилиндр/стакан емкостью не менее 2 л, диаметром 24-26 см и минимальной высотой 30 см. Дополнительные требования включают термометр для проверки температуры воды, бумажные полотенца, лампу красного света / нагревательный коврик или сопоставимый источник отопления, таймер, секундомер, тихую обстановку. Видеозапись сеансов плавания для автономного анализа и документирования. Убедитесь, что дата и время постоянно видны на ленте/файле вместе с идентификационным кодом для отдельного животного. Сохраните файлы для последующего анализа и дальнейшего использования. Пленка со стороны стеклянного цилиндра, а не сверху, для облегчения анализа.

2. Индукционная фаза

1. Перед началом работы
   1. Визуально наблюдать за животными на предмет отклонений, в том числе признаков укусов или парикмахерских. Исключите всю клетку из экспериментальной серии, если животное показывает какие-либо минимальные травмы. Убедитесь, что ветеринар доступен в любое время, так как травмы ухудшатся во время эксперимента и предотвратят продолжение, поскольку мыши становятся более агрессивными под воздействием стресса.
   2. Получите массу тела для каждого животного перед началом эксперимента. Следите за тем, чтобы часто наблюдаемая потеря веса не превышала 20% от исходной массы тела. Исключить животных с потерей веса более 20% и немедленно усыпить их из-за предполагаемых высоких страданий.
   3. Наполните стакан или цилиндр водой комнатной температуры (22-23 °C) на высоту не менее 20 см от дна, оставив между поверхностью воды и верхней границей сосуда не менее 10 см.
2. Производительность
   1. Осторожно перенесите животных в воду. Во время фазы плавания держите животное под постоянным наблюдением, чтобы предотвратить утопление. Наблюдение с позиции, когда животное не может видеть экспериментатора (например, видеонаблюдение из соседней комнаты).
   2. Установите хронометр в начале эксперимента. Вытащите животных из воды через 10 минут, просто схватив их за хвосты. Аккуратно высушите их бумажным полотенцем и положите либо под нагревательный свет, либо на нагревательный коврик.
   3. Оценивайте только одно животное за раз. Убедитесь, что животные не могут видеть друг друга (например, отделите клетку корпуса от экспериментальной установки с помощью разделителя комнаты).
   4. Выполняйте сеанс форсированного плавания в течение 10 минут каждый день в течение 5 дней подряд.
3. Отделка
   1. Переместите животных обратно в их домашние клетки после пяти сеансов плавания и дайте им отдохнуть не менее 2 дней. Впоследствии начинайте специфические лечебные мероприятия.

3. Оценка антидепрессивного лечения

1. Тайм-курс
   1. Оценить острое и субхроническое лечение с помощью CDM. В зависимости от научного вопроса, адаптируйте период покоя между фазой индукции и считыванием.
   2. Чтобы оценить острую и быстродействующую потенцию кетамина, выберите короткий период покоя (несколько дней) после фазы индукции CDM. Примените лечение (т.е. внутрибрюшинную инъекцию), а затем выполните оценку (дополнительный сеанс плавания или другой метод оценки) вскоре после этого.
   3. Чтобы оценить эффекты субхронического лечения, увеличьте период лечения до 4 недель (нет данных о более длительных периодах лечения). Например, давайте пероральное лечение имипрамином животным в течение 4 недель после фазы индукции и оценивайте после этого.
   4. Начинают оценивать депрессивное состояние сразу после окончания периода лечения, например, на следующий день. Всегда выбирайте одинаковый период времени для контрольных и экспериментальных условий.
2. Время неподвижности
   1. Доказательство концепции
      1. Чтобы использовать время неподвижности в качестве метода считывания, оцените каждый день фазы индукции и день теста, чтобы обеспечить доказательство концепции (см. Рисунок 1). Для дальнейших экспериментальных серий сократите оценки до дня 1, дня 5 и дня испытаний (см. Рисунок 1С).
      2. Видеозапись каждого эксперимента. Позвольте двум обученным наблюдателям, которые слепы к условиям эксперимента, выполнить анализ независимо. Видеоанализ позволяет экспериментатору наблюдать за поведением из другой комнаты, тем самым сводя к минимуму помехи тесту (например, см. видеофайл в дополнительном материале).
   2. Условия: Наблюдайте и идентифицируйте три различных поведенческих состояния во время теста на плавание: борьба, плавание и неподвижность. Большинство исследователей сосредотачиваются на неподвижности; дальнейшее различие между борьбой и плаванием редко полезно и резко увеличивает сложность и продолжительность анализа.
      1. Борьба: Животное активно пытается вырваться из угрожающей ситуации. Это включает в себя лапу боковой части цилиндра с головкой, ориентированной на стену, и движения всех конечностей. Водная гладь, как правило, слегка турбулентная.
      2. Плавание: Животное двигает, по крайней мере, обеими задними лапами и путешествует на расстояние по всей воде. Он активно ищет выход, но не пытается преодолеть стеклянную стенку сосуда. Плавание не предполагает подъема лап над поверхностью воды, а тело обычно ориентировано параллельно стенкам цилиндра. В этом состоянии животные часто поворачиваются или передвигаются кругами.
      3. Неподвижность: животное держится неподвижно, в холодном положении, и вообще не двигается или только двигает хвостом или передними лапами, чтобы держать голову над поверхностью воды. Никакое расстояние активно не преодолевается, кроме пассивного плавания, и не наблюдается направленного движения передних лап.
   3. Слежение
      1. Выполните оценку с помощью автономных видеозаписей. Используйте слепые оценки двух независимых и опытных экспертов и рассчитывайте средние значения между двумя оценками.
      2. Повторите оценки, если результаты двух оценщиков отличаются выше ранее определенного диапазона. Постоянно наблюдайте за мышами, поскольку различные условия часто меняются между борьбой, плаванием и неподвижностью.
      3. Используйте секундомер для измерения общего времени, проведенного в сфокусированной стадии (обычно неподвижности) в течение 10 минут, в течение которых мышь остается в воде. Рассмотрим короткую задержку около секунды перед изменением текущего измерения времени (например, если животное остается в течение 20 с в неподвижности и движется только один раз менее чем на секунду и возвращается к неподвижности еще на 10 с, общее время неподвижности составляет 30 с).
   4. Статистика: Из-за относительно высокого межиндивидуального стандартного отклонения (вероятно, вызванного переносом иерархического поведения из клетки в тест на плавание), отметьте или пометьте животных для выполнения парных (вместо непарных) параметрических тестов впоследствии. Оцените распределение нормальности и, в зависимости от конкретного вопроса, выполните анализ дисперсии (ANOVA) с помощью пост-специальных t-тестов или парных t-тестов для сравнения различных групп. Выполняют анализ с использованием абсолютных значений времени (времени) неподвижности или в виде нормализованных значений.
      1. Абсолютные значения: Дайте средние значения времени неподвижности с 1-го по 5-й день и для испытательного дня ± SEM (см. Рисунок 1A). Сравните усредненные значения для дня 1 и дня 5, предпочтительно с использованием парного t-теста для проверки индукции депрессивного состояния. Если между 1 и 5 днем есть существенная разница, сравните средние значения 5-го дня с усредненными результатами тестового дня. Убедитесь, что типичный размер группы в одном эксперименте составляет от 6 до 10 животных, и ожидайте значительных различий между исходным и постиндукционным временем неподвижности у животных дикого типа. Сравнение различных групп с непарным т-тестом затруднено, если используются абсолютные значения из-за базовых различий; поэтому используйте нормализованные значения.
      2. Относительные/нормализованные значения: Сравните различные эффекты лечения путем нормализации с индивидуальным результатом на 5-й день, а затем выразите значения в процентах от дня 5 (см. Рисунок 1B).
   5. Контрольные эксперименты
      ПРИМЕЧАНИЕ: Производительность плавания может быть коррелирована с локомоцией. Вещества, вызывающие гиперлокомоцию, могут вызывать ложноположительные результаты (а именно, уменьшение времени неподвижности); а также седативные средства могут искусственно увеличивать время неподвижности.
      1. Оцените изменения в локомоции для неизвестных веществ перед выполнением анализа плавания. Используйте Open Field Test (OFT) в отдельной группе животных в течение не менее 10 минут.
      2. Выберите такое же время наблюдения (10 мин) в ОФТ, как и в МЧР, для выявления неспецифических гипервозных эффектов испытанного соединения, которые могут повлиять на считывание МЧР путем измерения времени неподвижности с высокой достоверностью.
      3. В случае значительных гипервозных эффектов не оценивайте сеанс плавания для оценки антидепрессивной потенции, а используйте различные методы считывания (например, предпочтение сахарозы, тест на хвостовую подвеску и т. Д.).

4. Оценка развития депрессивно-подобного состояния

1. Чтобы оценить развитие депрессивного расстройства, оцените каждый день фазы индукции, чтобы измерить время неподвижности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае незначительное увеличение времени неподвижности между каждым днем описывает устойчивость, тогда как более сильное и более раннее увеличение по сравнению с необработанными или дикими животными представляет собой повышенную уязвимость к отчаянию, вызванному стрессом. При лечении мышей перед плаванием можно было оценить профилактическое вмешательство или трансгенные линии мышей на предмет развития поведенческого отчаяния.

В первом сеансе плавания индукционной фазы CDM мыши обычно показывают среднее время неподвижности между 190 с и 230 с, которое постоянно увеличивается с каждым дополнительным сеансом плавания (рисунок 1A). Это увеличение более выражено в первые 3 дня и достигает платоподобной фазы в течение последних 2-3 дней. Время неподвижности, измеренное на 5-й день, остается стабильным в течение 4 недель, что указывает на стабильное поведенческое отчаяние. Антидепрессивная эффективность вмешательства может быть оценена путем лечения животного между последним днем фазы индукции и днем тестирования. Обратите внимание, что абсолютное время подсчета очков во время сеансов плавания довольно субъективно и зависит от экспериментатора, возраста, пола и используемой линии мыши. Тем не менее, относительная разница между сессиями довольно стабильна с небольшими межрейтерными различиями.

На рисунке 1 показано несколько репрезентативных методов лечения. Имипрамин, лишение сна и кетамин значительно уменьшали время неподвижности, в то время как лишение сна в сочетании с восстановительным сном не показало значительного изменения депрессивно-подобного фенотипа. Эти результаты согласуются с антидепрессивной потенцией применяемых методов лечения и аналогичны эффектам, наблюдаемым у пациентов на людях. Лечение включало прием внутрь имипрамина 20 мг/кг/сут в течение 3 недель через питьевую воду, 3 мг/кг кетамина однократной внутрибрюшинной инъекцией за 24 ч до тестирования и лишение сна в течение 6 ч перед тестированием.

В зависимости от исследовательского вопроса могут отображаться различные представления. Представление абсолютных значений может дать реальный обзор данных и позволяет хорошо оценить фазу индукции и однократное лечение (рисунок 1A,D). Однако различия различных методов лечения не могут быть напрямую сопоставлены; следовательно, каждая группа лечения имеет различные средние значения неподвижности времени на 5-й день. Поэтому в данном случае рекомендуется использовать представление нормализованных средних значений (рисунок 1В). Уменьшенное представление может быть выбрано из-за ограниченности пространства (рисунок 1С). Обратите внимание, что в обязательном порядке необходимо показать хотя бы результаты 1-го дня, 5-го дня и дня тестирования.

Рисунок 1: Успешные результаты в абсолютных и нормализованных значениях. (А) Можно наблюдать успешную индукцию депрессивного состояния у 30 мышей. Каждая точка представляет время неподвижности одного животного в определенный день, а столбики представляют средние значения испытуемых животных. Время неподвижности представлено для каждого дня фазы индукции (день с 1 по день 5) и для тестового дня (после пунктирной линии) с лечением или без него. Отметим, что в этой выборке значительное увеличение может наблюдаться между 1-м и 2-м днем. В некоторых случаях уровни значимости сначала достигаются между 1-м и 3-м днями. Для продолжения эксперимента обязательно статистически значимое увеличение между 1 и 5 днем. Обратите внимание на типичный эффект потолка (увеличение между днями 1, 2 и 3 по сравнению с разницей между днями 4 и 5). Между 5-м днем и тестовыми днями животных помещали в течение 4 недель в домашние клетки, либо без дальнейшего лечения (CDM), либо обрабатывали имипрамином (Imip.); лишение сна (SD); лишение сна и восстановление сна (RS) и кетамин (Ket). (B) Примерный временной курс выступления отдельных животных дается за каждый день. (C) Нормализованное представление тех же результатов, которые уже показаны на рисунке 1А. Время неподвижности каждого животного и суток нормализовали до соответствующего ему времени неподвижности на 5 день и выражали в процентах. Значения после обработки различных групп могут быть лучше отображены и сопоставлены с использованием этого подхода. D) Представление нормализованных значений для дня 1, дня 5 и испытательного дня (МЧР). После успешного исследования, подтверждающего концепцию, точки оценки могут быть сокращены до первого дня, пятого дня и тестового дня. Эти временные точки необходимы, потому что значительное увеличение между днем 1 и днем 5 необходимо для демонстрации успешной индукции, а день 5 необходимо сравнить с днем тестирования, чтобы дать отчет об эффективности лечения. (E) Сравнение времени неподвижности трех различных линий мыши: Wildtype (WT) показывает успешную индукцию; примерная устойчивая линия (RL) показывает значительное снижение депрессивного поведения в первые три дня и в день тестирования. Односторонний ANOVA с Bonferroni post hoc test: ∗/#p < 0.05, ∗∗/##p < 0.01, ∗∗∗/###p < 0.001, ∗∗∗∗/#####p < 0.0001. (#укажите разницу со средними значениями дня 1, ∗укажите разницу со средними значениями дня 5 на рисунке 1A,C и на линию мыши WT на рисунке 1E). Данные выражаются как средства ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В случае неизменного времени неподвижности в течение всех 5 дней (рисунок 2) примененный стресс не смог соответствующим образом изменить поведение, и никакие эффекты лечения не могут быть оценены; животные должны быть принесены в жертву и не должны использоваться дальше.

Рисунок 2: Неудачные результаты. На рисунке показано представление неэффективной индукции. Обратите внимание, что значительного увеличения времени неподвижности между 1-м и 5-м днем не происходит. Поэтому критерии продолжения эксперимента не были достигнуты, и никакое дальнейшее продление не является рациональным (в данном случае тестировались только самцы мышей, а после ретроспективного исследования было установлено, что они не являются однопометниками). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дальнейшие методы считывания должны быть использованы для описания более широкого взгляда на поведенческое отчаяние животных. Доступны различные поведенческие тесты, электрофизиологические измерения и молекулярные оценки изменений, вызванных стрессом. Примерные результаты теста на суспензию хвоста (TST) с лечением CDM, имипрамином и кетамином, тестом предпочтения носовой сахарозы (NPSPT) и оценкой долгосрочного потенцирования с использованием метода зажима пластыря приведены на рисунке 3. Эти результаты поощряют использование фазы индукции CDM в качестве общего инструмента для индукции поведенческого отчаяния. Более подробную информацию об используемых методах (ТСТ, НППТ, ЛТП-оценка) см. в разделе 9,10,17,20.

Рисунок 3: Дополнительные результаты с МЧР-мышами. (A) Примерное представление эффектов МЧР в тесте на хвостовую подвеску. Мышей подвешивали за хвост, и было зарегистрировано время, проведенное неподвижно (методологические подробности см. в разделе9). Каждая точка представляет время неподвижности одного животного, а столбики представляют средние значения испытуемых животных. Односторонний ANOVA с bonferroni post hoc test: ∗∗∗p < 0,001. Данные выражаются как средства ± SEM. (B) Репрезентативные результаты недавно установленного теста предпочтения сахарозы с носовыми тычками у мышей CDM. В этом задании предпочтение сахарозы измерялось с постепенным увеличением усилий, чтобы достичь бутылки сахарозы (количество носовых полек) (для методологических деталей см. 10). Обратите внимание, что предпочтение сахарозы было уменьшено при CDM и что разница между CDM и контрольными мышами постепенно увеличивается с усилием (средние значения тычков носа в каждый день, указанные как Nspk1-7), которые мыши должны были применить, чтобы выпить сладкий раствор. Двусторонний ANOVA с bonferroni post hoc test: ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001. Данные выражены в виде средств ± SEM. (C) CDM-зависимые изменения долгосрочной синаптической пластичности представлены как изменения средних значений EPSP после применения ассоциативного протокола индукции LTP в срезах мозга гиппокампа мышей WT. Данные получены путем стимуляции синапса CA3-CA1 (подробнее см. 17,20). Непарный t-test, ∗∗p < 0,01, данные выражаются как средства ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительные материалы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.