Методы микроинъекции необходимы для введения экзогенных генов в геномы комаров. Этот протокол объясняет метод, используемый лабораторией Джеймса для микроинъекции ДНК в эмбрионы Anopheles gambiae для генерации трансформированных комаров.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Метод микроинъекции эмбрионов Anopheles gambiae
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Методы микроинъекции эмбрионов необходимы для многих молекулярных и генетических исследований видов насекомых. Они обеспечивают средства для введения экзогенных фрагментов ДНК, кодирующих интересующие гены, а также благоприятные признаки в зародышевую линию насекомых стабильным и наследуемым образом. Полученные трансгенные штаммы могут быть изучены на предмет фенотипических изменений, возникающих в результате экспрессии интегрированной ДНК для ответа на основные вопросы или использованы в практических приложениях. Хотя технология проста, она требует от исследователя терпения и практики для достижения уровня мастерства, который максимизирует эффективность. Здесь показан метод микроинъекции эмбрионов африканского малярийного комара Anopheles gambiae. Цель состоит в том, чтобы доставить путем микроинъекции экзогенную ДНК к эмбриону, чтобы она могла быть поглощена развивающимися клетками зародышевой линии (полюса). Экспрессия из введенной ДНК транспозаз, интеграз, рекомбиназ или других нуклеаз (например, CRISPR-ассоциированных белков, Cas) может вызвать события, которые приводят к его ковалентной вставке в хромосомы. Трансгенные An. gambiae, полученные на основе этих технологий, были использованы для фундаментальных исследований компонентов иммунной системы, генов, участвующих в кроветворении, и элементов обонятельной системы. Кроме того, эти методы были использованы для получения штаммов An. gambiae с признаками, которые могут помочь контролировать передачу малярийных паразитов.
Введение
Методы микроинъекции использовались для экспериментального манипулирования организмами с начала 1900-х годов1. Микроинъекция использовалась для изучения как основных биологических функций, так и/или внесения важных изменений в биологию желаемого организма. Метод микроинъекции представляет особый интерес для векторных биологов и широко используется для манипулирования векторными геномами2-11. Эксперименты по трансгенезу на векторах членистоногих часто направлены на то, чтобы сделать векторы менее эффективными при передаче патогенов путем либо внесения изменений, которые уменьшают приспособленность вектора, либо повышения рефрактерности к патогенам, которые они передают. Комары передают различные патогены человека и оказывают значительное влияние на заболеваемость и смертность во всем мире. Род комаров Anopheles передает паразитарным возбудителям малярии человека, Plasmodium spp. Генно-инженерные эксперименты с Anopheles были направлены на лучшее понимание биологии и снижение векторной способности этих комаров в усилиях по разработке новых стратегий элиминации малярии.
Комары-переносчики, которые способствуют наибольшему количеству случаев заражения малярией во всем мире, находятся в видовом комплексе Anopheles gambiae. Тем не менее, большинство успешных экспериментов по трансгенезу были проведены на переносчике малярии индийского субконтинента Anopheles stephensi. В то время как существует множество лабораторно адаптированных штаммов Anopheles gambiae, количество трансгенных линий Anopheles gambiae spp., о которых сообщается в литературе, не сравнится с количеством линий Anopheles stephensi. Считается, что эмбрион Anopheles gambiae труднее ввести и достичь успешного трансгенеза, чем Anopheles stephensi,хотя причины этих различий неизвестны. Этот протокол описывает метод, который доказал свою неизменно успешную способность к достижению трансгенеза эмбрионов Anopheles gambiae с помощью микроинъекции. Протокол основан на методе, ранее разработанном Эрве Боссеном и Марком Бенедиктом12 с добавлением некоторых дополнительных деталей и изменений, которые, как было установлено, повышают эффективность трансгенеза.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка комаров к микроинъекции
- Посейте клетку13 (~5000см3)с ~100 самцами и 200-300 самками 1-2-дневных взрослых постэклозионных комаров и дайте им спариваться в течение 2 дней.
- После брачного периода обеспечьте комаров кровяной мукой, используя либо 2 мл крови с помощью устройства искусственного кормления, либо живых обезболенных животных в зависимости от инсектарных практик14. На следующий день предоставьте комарам вторую кровавую пищу, чтобы гарантировать, что все спаренные самки имели возможность питаться и что частично откормленные комары стали полностью набухшими.
- Используйте комаров для сбора эмбрионов через 2-4 дня после второго приема пищи в крови.
ПРИМЕЧАНИЕ: Питание личинок важно для выносливости взрослых и репродуктивной пригодности. См. Benedict et al. (2020) для получения информации о том, как выращивать здоровых насекомых14. Существенных различий в яйцекладке не наблюдалось, когда комары питаются искусственной кормушкой или живыми обезболенными животными. Используйте любой метод, который обычно используется для Anopheles gambiae в инсектарии.
2. Подготовка эмбрионов
- Используйте аспиратор, чтобы поместить 20-30 самок в прозрачную коническую трубку объемом 50 мл, которая была разрезана (ленточной пилой), чтобы быть открытой с обоих концов и покрыта латексной стоматологической пленкой на одном конце и нейлоновой сеткой и фильтровальной бумагой на другом(рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Комары будут откладывать свои яйца на фильтровальную бумагу, а нейлоновая сетка будет надежно удерживать фильтровальную бумагу на месте. Яйца комаров имеют цилиндрическую форму, ~500 мкм в длину, ~200 мкм в диаметре в самой широкой точке и сужаются на переднем и заднем концах(рисунок 2). - Поместите заполненную комарами трубку в небольшую (60 мм х 15 мм) чашку Петри, наполненную двойной дистиллированной водой (ddH2O). Поместите трубку и посуду в инкубатор при 28 °C в течение 45 мин(рисунок 3).
- Извлеките трубку из инкубатора и вставьте трубку в пустую клетку. Осторожно постучите по трубке, чтобы позволить комарам вылететь, и извлеките трубку из клетки, как только все комары вылетят.
- Когда трубка освободится от комаров, открутите нижнее кольцо, удалите нейлон и используйте щипцы, чтобы аккуратно удалить фильтровальную бумагу с яйцами из трубки. Поместите фильтровальную бумагу в пластиковую чашку Петри (100 мм х 15 мм), содержащую слой фильтровальной бумаги, смоченной ddH2O.
- Понаблюдайте за яйцами. Яйца, которые состарились до такой степени, что они светло-серого цвета(рисунок 4),готовы к выравниванию.
- Если яйца еще белые, верните их в инкубатор и проверяйте цвет каждые 5 минут. Белые яйца хрупкие, легко разрываются и плохо выживают после процесса инъекции, что приводит к низкому вылуплению.
- Яйца темно-серого или черного цвета слишком сильно состарились. Не используйте их.
3. Выравнивание эмбриона
- Отрежьте лезвием бритвы кусочек нейлоновой промокательной мембраны (2 см х 1 см), убедившись, что край аккуратно подстрижен.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если край не прямой, яйца не будут оставаться прикрепленными к мембране должным образом во время процесса инъекции. - Поместите мембрану на стеклянную горку и накройте мембрану куском фильтровальной бумаги (2 см х 2 см), оставив ~1 мм мембранного фильтра непокрытым(рисунок 5).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что предметные стекла микроскопа чисты перед использованием, и используйте чистые щипцы для манипулирования мембранным фильтром. - Смочите фильтровальную бумагу деионизированнымH2O, так как яйца погибнут при высыхании в течение длительных периодов времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не кладите слишком много воды на бумагу, потому что эмбрионы будут двигаться во время процесса инъекции, но убедитесь, что их достаточно, чтобы предотвратить высыханиеэмбриона (рисунок 6A,B). Лишнюю воду можно удалить, впитав ее листом фильтровальнойбумаги. - Аккуратно перенесите 30-50 эмбрионов к краю мембраны кистью (размер No0). Используйте кисть, чтобы выровнять яйца вертикально вдоль мембраны, осторожно перекатывая их на слайде так, чтобы вентральная сторона (выпуклая) была обращена вверх.
- Ориентируйте все яйца в одном направлении так, чтобы при наблюдении яиц под микроскопом микроинъекции задний конец (более заостренный, рисунок 6A,B)находился в нижнем положении и образовывал угол ~ 15° с иглой(рисунок 6C). Выровняйте весь край мембраны яйцеклетками (30-50) и поместите предметный предмет под микроскоп для инъекций.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно выбирайте яйца. Отбросьте те, которые белые (слишком молодые или неразвитые) или темно-серые (слишком старые и сломают иглу), и ненормальные(рисунок 7). Убедитесь, что фильтровальная бумага всегда остается влажной.
4. Подготовка ДНК
- Очищайте плазмидные ДНК для инъекций, как минимум, с помощью набора максипрепа плазмиды ДНК без эндотоксинов в соответствии с протоколами производителя.
- Повторное суспендирование ДНК в воде и центрифуге класса ПЦР при 17 100 х г в охлажденной центрифуге в течение 30 мин при 4 °C. Затем перенесите супернатант в новую, чистую коническую трубку объемом 1,5 мл. Осторожно используйте микропипетку, чтобы избежать переноса нежелательных твердых частиц из колонны.
- Выполните второе осаждение ДНК, используя одну десятую объема ацетата натрия 3M и двукратный объем 100% этанола.
- Повторно суспендируют ДНК в 300-500 мкл воды ПЦР-класса для конечной плазмидной концентрации 1000 нг/мкл. Смешайте плазмидный коктейль в буфере инъекции для окончательной плазмидной концентрации 300-400 нг/мкл и получите 10-20 мкл аликвот.
ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК может храниться при -20 °C. Микроинъекционные аликвоты ДНК могут храниться при -20 °C или при -80 °C при использовании компонентов РНК. Не превышайте 800 нг/мкл ДНК в инъекционной смеси, потому что вязкость приведет к засорению игл.
5. Подготовка иглы
- Сделайте иглы, вытягивая 10 см кварцевые капилляры с помощью программируемого съемника микропипетки.
- Осмотрите иглу под микроскопом, чтобы убедиться, что наконечник хорошо сформирован. Убедитесь, что настройка иглы на программируемом съемнике дает наконечник, который начинает сужаться примерно на 0,5 мм от конца клеммы и заканчивается тонкой точкой (см. Рисунок 6). Иглы, которые легко ломаются, обычно имеют слишком длинный конус.
ПРИМЕЧАНИЕ: Условия могут отличаться в зависимости от съемника иглы (Авторы предоставят по запросу настройки для программируемого съемника, который они используют. Ограничения журнала не позволяют нам ссылаться на конкретный бренд). Иглы можно вытащить вручную, но для этого требуется набор навыков, недоступных в большинстве лабораторий.
6. Микроинъекция эмбриона
- Используйте наконечник микрозагрузчика, чтобы заполнить иглы 2 мкл смеси ДНК. Вставьте иглу в держатель иглы и подключите автоматическую трубку напорного насоса(рисунок 8).
- Важно: Выровняйте иглу так, чтобы она составляла угол 15° с плоскостью скольжения(рисунок 8).
- Откройте кончик иглы, осторожно коснувшись первого яйца, и введите его, вставив кончик иглы ≤ 10 мкм в задний полюс. Успешная инъекция приведет к небольшому движению цитоплазмы внутри яйцеклетки.
- Используйте контроль коаксиальной стадии микроскопа, чтобы перейти к следующей яйцеклетке, чтобы продолжить инъекцию.
- Чтобы убедиться, что кончик иглы остается открытым и не засорился, нажмите кнопку «Ввести» перед введением другого эмбриона и визуализируйте маленькую каплю в отверстии иглы.
- Если игла засоряется, нажмите кнопку Clear, чтобы очистить иглу, и повторите тест визуализации капель. Отрегулируйте давление по мере необходимости, если отверстие наконечника иглы становится немного больше, чтобы размер капли оставался небольшим.
- Вводят ~40-50 яиц одной иглой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что фильтровальная бумага всегда остается влажной. Поддерживайте достаточное противодавление на иглу, чтобы она была очищена. Игла, которая не может быть очищена, должна быть заменена новой иглой. Размещение эмбриона, введение иглы и инъекция облегчаются с помощью микроскопов, которые имеют коаксиальные элементы управления горизонтальным движением сцены(рисунок 9).
- После завершения инъекций смойте яйца в стеклянный контейнер, выстланный фильтровальной бумагой и заполненный 50 мл деионизированногоH2O(рисунок 10).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы начнут вылупляться через 2 дня после инъекции и могут занять до 3-5 дней. Вылупившиеся первые личинки должны быть немедленно перенесены (проверять 2 раза в день) в чистую емкость с водой и пищей.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Репрезентативный пример применения описанного протокола микроинъекции можно найти в Carballar-Lejarazú et al5. Цель здесь состояла в том, чтобы вставить автономную систему генного драйва в зародышевую линию лабораторного штамма G3 An. gambiae. Система была разработана для нацеливания на кардинальный ортолог локус(Agcd)на третьей хромосоме у этого вида, который кодирует гемпероксидазу, катализирующую превращение 3-гидроксикинуренина в ксантомматин, последний шаг в биосинт...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
С увеличением доступности точных и гибких технологий генной инженерии, таких как CRISPR / Cas9, трансгенные организмы могут быть разработаны более простым и стабильным способом, чем это было возможно ранее. Эти инструменты позволили исследователям создать трансгенные штаммы комаров-переносчиков, которые очень близки к достижению желаемых свойств либо рефрактерности к патогенам (модификация популяции), либо наследственной стерильности (подавление популяции). Однако для развития наиболее безопасных и стабильных генетически...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарны Друзилле Стиллингер, Кионе Паркер, Пэрриш Пауэлл и Мадлен Ноттоли за разведение комаров. Финансирование было предоставлено Калифорнийским университетом, Ирвинской инициативой по борьбе с малярией. AAJ является профессором Дональда Брена в Калифорнийском университете в Ирвине.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 10x Микроинъекционный буфер | - | - | 1 мМ NaHPO<суб>4 буфер, pH 6,8, 50 мМ KCl |
| Блоттинговая мембрана (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | аккуратно и прямо разрезается на кусок 2x1 см | |
| Конические пробирки 50 мл (одноразовая центрифужная пробирка, полипропилен) | Концы Fisher Brand | Cut | |
| Деионизированная или дважды дистиллированная вода (ddH20) | Mili-Q | Во флаконе для стирки | |
| Препарирующий микроскоп | Leica | Leica MZ12 | Для выравнивания эмбрионов |
| Щипцы | No. 5 размер | ||
| Стеклянная тара | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Стеклянная горка | Fisher | Brand No. 12-549-3 | 75x26 мм |
| Инкубатор | Barnsted Lab-line | МодельNo 150 | 28° C |
| KCl | 50 мМ | ||
| Латексная стоматологическая пленка | Crosstex International | No. 19302 | |
| Микроинъектор | Sutter Instrument XenoWorks | Цифровой микроинъектор | |
| Микрозагрузчик Наконечники для пипеток | Eppendorf | 20 &микро; L микрозагрузчик epT.I.P.S. | |
| Микроманипулятор | Sutter Instrument | XenoWorks Микроманипулятор | |
| Micropipette | Rainin | 20 &микро; L | |
| Съемник микропипеток | Sutter Instrument | Sutter P-2000 микропипетка для вытягивания | |
| микроскопа | Leica | DM 1000 LED или M165 FC | для микровпрыска |
| Минимум волоконной фильтровальной бумаги | Фишер | марки No 05-714-4 | Хроматографическая бумага, толстая |
| Комары | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, спаренные взрослые самки, откормленные кровью через 4-5 дней после экклозии | |
| NaHPO4 buffer | 1 мМ, ph 6.8 | ||
| Нейлоновая сетка | |||
| Кисть для рисования | Blick | No. 05831-7040 | Мелкая, размер 4/0 |
| Чашка | Пластик, (60x15 мм, 90x15 мм) | ||
| Ацетат | 3М | ||
| Капилляры из кварцевого стекла | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | С нитью, внешний диаметр 1 мм, ID 0.7 10 см |
| длина Вода ПЦР сорт | Рош | No 03315843001 |
Ссылки
- Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C. Needle Microinjection: A Brief History. Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine. Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. , Birkhauser. Basel. (1999).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
- Meredith, J. M., et al. Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections. PLoS One. 6 (1), 14587(2011).
- Hammond, A., et al. CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
- Carballar-Lejarazu, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Simões, M. L., et al. The Anopheles FBN9 immune factor mediates Plasmodium species-specific defense through transgenic fat body expression. Develomental & Comparative Immunology. 67, 257-265 (2017).
- Arik, A. J., et al. Increased Akt signaling in the mosquito fat body increases adult survivorship. FASEB Journal. 4, 1404-1413 (2015).
- Riabinina, O., et al. Organization of olfactory centres in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature Communications. 7, 13010(2016).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Dong, Y., Simões, M. L., Dimopoulos, G. Versatile transgenic multistage effector-gene combinations for Plasmodium falciparum suppression in Anopheles. Science Advances. 6 (20), (2020).
- Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Molecular Biology. 6, 597-604 (2001).
- Benedict, M. Q. Methods in Anopheles research. Chapter 3: Specific Anopheles techniques. 3.1 Embryonic Techniques. 3.1.1 Microinjection methods for Anopheles Embryos. BEI resources. , Manassas, Virginia. (2015).
- Pham, T. B., et al. Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLoS Genetics. 15 (12), 1008440(2019).
- Benedict, M. Q., et al. Pragmatic selection of larval mosquito diets for insectary rearing of Anopheles gambiae and Aedes aegypti. PLoS One. 15 (3), 0221838(2020).
- Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. Population modification of Anopheline species to control malaria transmission. Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
