Мы представляем протокол для измерения лекарственного и радиационного ответа в режиме реального времени метастатических клеток рака молочной железы в органотипической модели среза мозга. Методы обеспечивают количественный анализ для изучения терапевтического воздействия различных методов лечения на метастазы в мозг от рака молочной железы ex vivo в интерфейсе микроокружения мозга.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Модель среза мозга Ex Vivo для изучения и нацеливания на метастатический рост опухоли головного мозга рака молочной железы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Метастазы в мозг являются серьезным последствием рака молочной железы для женщин, поскольку эти опухоли трудно поддаются лечению и связаны с плохими клиническими результатами. Доклинические мышиные модели метастатического роста рака молочной железы (BCBM) полезны, но стоят дорого, и трудно отслеживать живые клетки и инвазию опухолевых клеток в паренхиме мозга. Здесь представлен протокол для культур срезов мозга ex vivo от ксенотрансплантированных мышей, содержащих внутрикраниально введенные клональные сублинии рака молочной железы. Клетки, помеченные люциферазой MDA-MB-231BR , вводились интракраниально в мозг самок мышей Nu/Nu, и после образования опухоли мозги были выделены, разрезаны и культивированы ex vivo. Срезы опухоли были сфотографированы для идентификации опухолевых клеток, экспрессирующих люциферазу, и мониторинга их пролиферации и инвазии в паренхиме головного мозга в течение 10 дней. Кроме того, протокол описывает использование покадровой микроскопии для изображения роста и инвазивного поведения опухолевых клеток после лечения ионизирующим излучением или химиотерапией. Реакция опухолевых клеток на лечение может быть визуализирована с помощью микроскопии с живой визуализацией, измерения интенсивности биолюминесценции и выполнения гистологии на срезе мозга, содержащем клетки BCBM. Таким образом, эта модель среза ex vivo может быть полезной платформой для быстрого тестирования новых терапевтических агентов отдельно или в сочетании с радиацией для идентификации лекарств, персонализированных для нацеливания на метастатический рост рака молочной железы отдельного пациента в микросреде мозга.
Введение
Метастазы рака молочной железы в мозг (BCBM) развиваются, когда клетки распространяются от первичной опухоли молочной железы к мозгу. Рак молочной железы является второй наиболее частой причиной метастазирования в мозг после рака легких, причем метастазы встречаются у 10-16% пациентов1. К сожалению, метастазы в мозг остаются неизлечимыми, так как >80% пациентов умирают в течение года после постановки диагноза метастазирования в мозг, а качество их жизни ухудшается из-за неврологических дисфункций2. Существует острая необходимость в определении более эффективных вариантов лечения. Однослойные двухмерные или трехмерные мод....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этот протокол был одобрен и следует руководящим принципам ухода за животными Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Медицинского колледжа Университета Дрекселя (IACUC). В этом исследовании использовались nu/Nu атимические самки мышей (6-8 недель).
1. Внутричерепная инъекция опухолевых клеток
- Стерилизуйте все оборудование (пинцет, ножницы, шовные ножницы, ручную дрель) под сухим циклом автоклава до 45 мин в стерилизационных пакетах, включая индикатор стерилизации. При проведении операций на нескольких животных стерилизуйте инструменты между животными с помощью нагретого стерилизатора бусин (до 3x).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Клетки MDA-MB-231BR-GFP-Люциферазы вводили интракраниально в правое полушарие 4-6-недельных мышей Nu/Nu, как описано выше (рисунок 1A), и позволяли расти в течение 12-14 дней, в течение которых рост опухоли контролировался с помощью биолюминесцентной визуализации (рисунок 1B). Мы ввели 100 000 раковых клеток интракраниально, как сообщают другие группы19, но можно ввести всего 20 000 клеток20. После генерации срезов.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Это исследование устанавливает новый метод культивирования мозга ex vivo для эксплантированных опухолей головного мозга ксенотрансплантата. Мы показываем, что клетки BCBM MDA-MB-231BR, интракрационно вводимые в мозг мышей, могут выживать и расти в срезах мозга ex vivo . Исследование также проверило внутрикраниально введенные клетки глиобластомы U87MG (GBM), а также обнаружило, что эти раковые клетки выживают и растут в срезах мозга (данные не показаны). Мы считаем, что эта модель может быть расширена за.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет финансовых конфликтов, которые можно было бы декларировать.
Благодарности
Мы хотим поблагодарить Джулию Фарнан, Кайлу Грин и Тициану ДеАнджелис за их техническую помощь. Эта работа была частично поддержана Пенсильванской универсальной программой грантов на улучшение исследований (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) и благотворительными фондами W.W. Smith (EjH).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1 мл шприц, скользящий наконечник | BD | 309659 | |
| 30 G1/2 Иглы | BD | 305106 | |
| 6-луночные планшеты | Genessee | 25-105 | |
| Автоматизированный микроскоп и программное обеспечение LUMAVIEW | Etaluma | LS720 | |
| B27 (GEM21) | Gemini Bio-Products | 400-160 | |
| Стакан 50 мл | Fisher | 10-210-685 | |
| Тупой соболиный кисть, размер #5/0 | Электронная микроскопия Sciences | 66100-50 | |
| Костный воск | ModoMed | DYNJBW25 | |
| Шприц для инъекций мозга | Hamilton Company | 80430 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510-250 | |
| Расщепленная каспаза 3 | Антитела Клеточная сигнализация | 14220S | |
| DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| D-люциферин Калийная соль | Perkin Elmer | 122799 | |
| Лезвие бритвы с двойным лезвием | VWR | 55411-060(95-0043) | |
| Фильтровальная бумага , количественные круги, 4,25 см | Fisher | 09-805a (1001-042) | |
| Тонкая соболиная кисть #2/0 | Электронная микроскопия науки | 66100-20 | |
| Щипцы | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gamma-H2AX антитело | Millipore | 05-636 | |
| GFAP антитело | Thermo Fisher | 13-0300 | |
| GFP | антитело Santa Cruz | SC-9996 | |
| Глюкоза | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Glutamine (200 mM) | Corning cellgrow | 25-005-Cl | |
| H& E и KI-67 | Jefferson Core Facility Набор для окрашивания | ||
| Набор ручных сверл с микро мини спиральными сверлами | Amazon | YCQ2851920086082DJ | |
| HEPES, свободная кислота | Fisher Scientific | BP299-1 | |
| Только для мышей Стереотаксическая рама | Гарвардский аппарат (Холлистон, Массачусетс, США). | 72-6049, 72-6044 | |
| KCl | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Большие хирургические ножницы | Fine Science Tools | 14001-18 | |
| MDA-MB-231BR клетки | Любезно предоставлено доктором Патрицией Стиг | Ref 14 | |
| MgCl2· 6H2O | Fisher Scientific | M33-500 | |
| для визуализации мышей | Perkin Elmer | IVIS 200 система | |
| Программное обеспечение для визуализации мышей | Caliper Life Sciences (Waltham, MA, США). | Программное обеспечение | |
| Считыватель микропланшетов | Tecan Искровой | ||
| монтажный раствор | Invitrogen | P36935 | |
| MTS реагент | Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution | (Cat:G3582) | |
| N2 дополнение | Life Technologies | 17502-048 | |
| Нейробазальная среда | Life Technologies | 21103049 | |
| Ню/Ню атимические мыши | Charles Rivers Labs (Уилмингтон, Массачусетс, США) | ||
| Параформальдегид | Affymetrix | 19943 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 145140-122 | |
| Полипропиленовый шов | Medex Supply | ETH-8556H | |
| Палочки для йода Povidone Iodine | Swab DME Supply США | Cat: 689286X | |
| Лезвие скальпеля # 11 (pk of 100) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Ручка скальпеля #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Пируват натрия | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Шпатель/зонд | Fine Science Tools | 10090-13 | |
| SS Двухлезвийные бритвенные лезвия без покрытия (American Safety Razor co (95-0043)) | VWR | 55411-060 | |
| Sucrose | Amresco | 57-50-1 | |
| Хирургический скальпель | Exelint International | D29702 | |
| Измельчитель тканей | Brinkman | (тип McIlwain) | |
| Вставки для культуры тканей | Millipore | PICMORG50 или PICM03050 | |
| рентгеновский аппарат | Precision 250 kVp |
Ссылки
- Watase, C., et al. Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives. Cancers. 13 (5), Basel. (2021).
- Niikura, N., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
