Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Резюме

Здесь представлен протокол имплантации хронического черепного окна для продольной визуализации клеток мозга у бодрствующих мышей с ограничением головы.

Abstract

Чтобы полностью понять клеточную физиологию нейронов и глии у ведущих себя животных, необходимо визуализировать их морфологию и записать их активность in vivo у ведущих себя мышей. В этой статье описывается метод имплантации хронического черепного окна, позволяющий проводить продольную визуализацию клеток мозга у бодрствующих мышей с ограничением головы. В сочетании с генетическими стратегиями и вирусными инъекциями можно маркировать конкретные клетки и области, представляющие интерес, структурными или физиологическими маркерами. Этот протокол демонстрирует, как комбинировать вирусные инъекции для маркировки нейронов в непосредственной близости от GCaMP6-экспрессирующих астроцитов в коре для одновременной визуализации обеих клеток через краниальное окно. Многофотонная визуализация одних и тех же клеток может выполняться в течение нескольких дней, недель или месяцев у бодрствующих, ведущих себя животных. Этот подход предоставляет исследователям метод просмотра клеточной динамики в режиме реального времени и может быть применен для ответа на ряд вопросов в нейробиологии.

Introduction

Способность выполнять in vivo многофотонную флуоресцентную микроскопию в коре мышей имеет первостепенное значение для изучения клеточной сигнализации и структуры 1,2,3,4,5,6,7,8,9, патологии заболевания ^10,11 и клеточного развития ^12,13 . При имплантации хронических черепных окон возможна продольная визуализация, позволяющая повторно визуализировать корковые области в течение дней, недель или месяцев^13,14 у живых животных. Многофотонная микроскопия идеально подходит для повторной визуализации in vivo из-за улучшенного глубинного зондирования и уменьшения фотоповреждений, связанных с используемым инфракрасным лазером. Это позволяет изучать молекулярную и клеточную динамику специфических клеток в различных корковых областях.

Многофотонная микроскопия использовалась для визуализации in vivo нейронных и глиальных клеток у мышей 15,16,17,18,19,20. Различные стратегии могут быть реализованы для маркировки определенных типов клеток и областей интересов. Одним из распространенных подходов является управление экспрессией генетически закодированных флуоресцентных белков специфическим для клеток способом с использованием системы рекомбинации Cre-Lox. Это может быть выполнено с генетически модифицированными мышами, например, скрещивание tdTomato «флоксированной» мыши (Ai14) с мышью, экспрессирующей cre-recombinase под промотором, представляющим интерес²¹. В качестве альтернативы, маркировка клеток и участков может быть достигнута с помощью вирусных инъекций. Здесь вирус, кодирующий Cre-рекомбиназу под клеточным промотором, и вирус, кодирующий интересующий ген флоксированной, вводятся в определенную область. Соответствующие типы клеток, получающие оба вирусных вектора, затем будут экспрессировать желаемый ген (ы). Эти гены могут быть структурными маркерами, такими как tdTomato, для просмотра изменений в клеточной морфологии²² или генетически закодированными показателями кальция (GECI), такими как GCaMP и / или RCaMP, для изучения динамики кальция²³. Методы генетической рекомбинации могут применяться индивидуально или в комбинации для маркировки одного или более типов клеток. Третий подход, не требующий трансгенных мышей или вирусных конструкций (которые имеют ограниченную упаковочную способность), заключается в внутриутробной электропорации конструкций ДНК²⁴. В зависимости от времени электропорации, различные типы клеток могут быть нацелены^на 25,26,27.

При выполнении многофотонной визуализации мыши могут быть изображены во время бодрствования или обезболены. Визуализация бодрствующих мышей может быть выполнена путем закрепления мыши с помощью прикрепленной головной пластины²⁸. Этот подход становится менее стрессовым, позволяя относительно свободно передвигаться животному с использованием методов, таких как свободно плавающие, поддерживаемые воздухом шарики из пенополистирола²⁹, свободно плавающие беговые дорожки¹ или система домашних клеток с воздушным подъемом, где мыши скрепляются прикрепленной головной пластиной и могут перемещаться в открытой камере³⁰. Для каждого из этих условий визуализации сначала необходимо будет приучить мышей к настройке визуализации. В этой статье описывается процедура привыкания и визуализации с использованием системы домашних клеток с воздушным подъемом.

Этот протокол описывает имплантацию хронического черепного окна для продольной визуализации in vivo в коре головного мозга. Здесь мы будем использовать мышей, которые условно экспрессируют GCaMP6f в астроцитах, для мониторинга динамики передачи сигналов кальция. Далее в данной работе описывается процедура вирусных инъекций с использованием tdTomato в качестве метки для нейронов. Это позволяет определить изменения в нейрональной синаптической структуре и/или доступность в качестве структурного маркера, который позволяет повторно визуализировать один и тот же астроцит. На протяжении всего протокола будут выделены важные шаги для обеспечения наилучшего качества изображений, полученных с помощью многофотонной микроскопии.

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами, утвержденными IACUC в Медицинском центре Университета Небраски. 1. Перед операцией Подготовьте пипетки для вирусных инъекций. Потяните боросиликатные стеклянные капилляры с помощью съемника пипетки и скосите пипетку под углом 20°. Стерилизуйте пипетки на ночь. Приготовьте свежие кусочки стерильной гелевой пены, разрезав их на небольшие квадратики. Погрузите гелевую пену в стерильную микрофьюжную трубку, содержащую 0,5 мл физиологического раствора. Замочите гелевую пену в физиологическом растворе не менее чем на 30 минут перед использованием. Приготовьте свежие кусочки полосок губки, разрезав их на тонкие полоски. За двадцать минут до операции вводят 4-6-недельным мышам GLAST-CreER/GCaMP6f внутрибрюшинно 0,2 мг/кг дексаметазона для предотвращения отека мозга и 5 мг/кг карпрофена для уменьшения воспаления.ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы индуцировать рекомбинацию и экспрессию GCaMP6f примерно в 40% астроцитов, мышам GLAST-CreER/GCaMP6f вводили 100 мг/кг тамоксифена через 3 недели в течение 5 дней подряд. 2. Начало операции Через 20 мин обезболивают мышей 3% изофлураном кислородом со скоростью потока 1 л/мин в течение примерно 1,5 мин. После анестезии поместите мышь на стереотаксическую рамку, которая сидит на водоциркуляющем одеяле, чтобы поддерживать температуру тела 37 ° C на протяжении всей операции. Прикрепите мышь к раме с помощью зажима морды и ушных вкладышей. Убедитесь, что зажим морды и ушные вкладыши достаточно устойчивы, чтобы голова не двигалась во время процедуры, но не настолько плотно, чтобы череп был поврежден. Поддерживают анестезию 1-1,5% изофлураном с кислородом со скоростью потока 1-2 л/мин. Обратите внимание, что некоторым животным может потребоваться больше или меньше изофлунана для поддержания седации. Следите за дыханием животного, а также его рефлексами на щипки пальцев ног и хвоста и соответствующим образом регулируйте изофлуран. Нанесите глазную мазь на каждый глаз с помощью хлопкового аппликатора, чтобы предотвратить пересыхание глаз во время процедуры. Используя триммеры для грызунов, сбривайте волосы от шеи до самых глаз. Соблюдайте осторожность, чтобы убедиться, что усы животного не были случайно подстрижены. Очистите выбритую область одной прокладкой для приготовления йода, а затем одной прокладкой для приготовления спирта. Используя стерильные тканевые щипцы и хирургические ножницы, вырежьте и удалите кожу с лобных швов перед брегмой вплоть до лямбды. После удаления кожи добавьте примерно 0,1 мл 1% ксилокаина (лидокаина с адреналином 1:200 000) в череп, чтобы свести к минимуму кровотечение черепа. Используя стерильный хирургический клинок из углеродистой стали 11, прикрепленный к рукоятке, аккуратно соскоблите соединительную ткань с черепа. Будьте особенно осторожны при удалении соединительной ткани вблизи края черепа, так как любая оставшаяся ткань может предотвратить сильную адгезию стекла или головной пластины в дальнейшем. Используйте стерильные тканевые щипцы для удаления рыхлой соединительной ткани из черепа. Используя стерильные аппликаторы для хлопчатобумажных наконечников, очистите череп от любого оставшегося ксилокаина. После завершения тщательно обезжирьте череп с помощью стерильного хлопкового наконечника, смоченного в ацетоне. Используйте сжатый воздух, чтобы немедленно высушить череп феном. 3. Краниотомия Используя маркер тонкой точки и линейку, измерьте соответствующий размер отверстия в нужном месте. Подтвердите размер отверстия, сравнив его с размером покровного стекла (3 или 5 мм в диаметре); убедитесь, что отверстие немного меньше размера защитного стекла. С помощью бормашины постепенно прослеживайте контур отверстия, истончая кость. Медленно сверлите, чтобы предотвратить сверление кости, и сверлите в концентрических кругах, чтобы облегчить равномерное истончение кости. После каждого концентрического прохода добавляйте каплю или две стерильного физиологического раствора в пробуренную область. Дайте физиологическому раствору постоять не менее 10 с, чтобы предотвратить перегрев кости и повреждение основной твердой мозговой оболочки. Используйте стерильный аппликатор хлопкового наконечника, чтобы впитать оставшийся физиологический раствор. Выдувайте сжатый воздух над областью, чтобы убедиться, что весь оставшийся физиологический раствор испарился перед возобновлением бурения. Сделайте это, чтобы сдуть остатки кости. Повторяйте шаги 3.2-3.4 до тех пор, пока кость не истончится для удаления. Убедитесь, что кость достаточно истончена для удаления, осторожно надавливая на центральную область кости тонкими щипцами, чтобы проверить, что истонченный череп движется. Подлежащая сосудистая система должна быть видна там, где произошло сверление. Обратите внимание, что кость может выглядеть так, как будто она треснет там, где произошло истончение.ПРИМЕЧАНИЕ: Тренировка на этом этапе имеет решающее значение для определения того, когда кость была истончена соответствующим образом. Прежде чем пытаться удалить кость, проверьте мышь, чтобы убедиться, что она полностью седативна. Если нет, постепенно увеличивайте содержание изофлурана, чтобы предотвратить отек мозга при удалении кости. Добавьте небольшой кусочек гелевой пены, насыщенной физиологическим раствором, к истонченному черепу. Добавьте одну или две дополнительные капли физиологического раствора в истонченный череп.ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие большого количества физиологического раствора над истонченным черепом помогает уменьшить кровотечение и защитить твердую мозговую оболочку при удалении костного лоскута. Используя миниатюрное заостренное лезвие на 15°, аккуратно вставьте лезвие в истонченную кость и разрезайте вдоль истонченной кости. Держите гелевую пену смоченной в физиологическом растворе, готовой остановить любые кровотечения, которые могут возникнуть. Используя щипцы, осторожно поднимите и удалите кость. Будьте максимально щадны, чтобы избежать повреждения подлежащей ткани и сосудистой системы. Будьте предельно осторожны, чтобы не повредить твердую мозговую оболочку. После того, как костный лоскут удален, добавьте свежий кусочек гелевой пены, насыщенной физиологическим раствором, в кору. Добавьте несколько капель физиологического раствора, чтобы предотвратить высыхание гелевой пены, так как это приведет к повреждению подлежащей ткани. 4. Вирусные инъекции Выполняют вирусные инъекции с помощью стереотаксического аппарата. Подготовьте AAV1. CaMKII.0.4.Cre (титр 3 × 1013 копий генома (GC)/мл) при 1:5000 путем последовательных разведений в физиологическом растворе. Приготовьте смесь AAV1. CaMKII.0.4.Cre (1:5,000) и AAV1. ЦАГ. FLEX.tdTomato (титр 5 × 1012 ГК/мл) на небольшом кусочке парапленки. Наполните стерильную скошенную стеклянную пипетку с наконечником размером 20 мкм вирусной смесью, аккуратно положив пипетку на раствор. Опустите пипетку так, чтобы она просто коснулась поверхности мозга и продолжайте опускаться в течение дополнительных 200-300 мкм для инъекций L2/3. Используя внутриклеточную микроинъекционную дозирующую систему (см. Таблицу материалов), вводят давление 12-15 раз в течение 2 мин (20 psi, длительность импульса 9 мс). Наблюдайте, как мениск в пипетке падает с каждой инъекцией, чтобы убедиться, что пипетка не заблокирована. После инъекции оставьте пипетку в мозге на 4-5 минут, чтобы предотвратить обратный поток. Медленно втягивайте пипетку. Повторите инъекции в 2-3 местах (приблизительно на расстоянии 500 мкм друг от друга). Выбросьте использованные стеклянные пипетки, парапленки, наконечники пипеток и микрофьюжировочные трубки, используемые для последовательного разведения вируса Cre, в 10% отбеливатель. 5. Имплантация краниального окна Удалите любую гелевую пену и используйте небольшую полоску губчатых полосок, чтобы впитать оставшийся физиологический раствор. Добавьте несколько капель антибиотика энрофлоксацина (22,7 мкг/мл) в отверстие и дайте ему остаться там в течение 1 мин. Через 1 мин используйте свежий кусочек губчатой полоски, чтобы впитать оставшийся энрофлоксацин. Повторите этот процесс еще два раза. После третьей промывки добавьте в отверстие несколько капель физиологического раствора и дайте ему остаться там в течение 1 мин. Через 1 мин используйте свежий кусочек губчатой полоски, чтобы впитать оставшийся физиологический раствор. Повторите этот процесс промывки еще два раза и после третьей стирки добавьте небольшую каплю физиологического раствора в отверстие. Поместите покровное стекло над отверстием. Используйте щипцы, чтобы убедиться, что стекло находится заподлицо над отверстием для получения изображений хорошего качества. Осторожно удерживая стекло на месте, нанесите цианоакрилатный клейкий гель (Таблица материалов) по периметру стекла, чтобы запечатать края окна на черепе. Убедитесь, что клей не просачивается под покровное стекло, и держите как можно больше клея с поверхности покровного стекла. Нанесите слой суперклея поверх клеевого геля. Добавьте слой зубной цементной жидкости поверх клея, чтобы он затвердел. Возьмите головную пластину вертолетного типа соответствующего размера и нанесите тонкий слой клея вокруг центрального отверстия. Поместите головную пластину поверх покровного стекла и дайте клею ненадолго высохнуть. В микрофрагменную трубку объемом 1,5 мл добавьте порошок зубного цемента к отметке 0,1 мл на трубке. Добавьте 7-8 капель быстроотверждающегося, мгновенного клея и перемешайте. Втяните в шприц объемом 1 мл с помощью иглы 19 г, которая была разрезана, чтобы создать большее отверстие. Впрыскивайте смесь через боковые отверстия вертолетного стержня до тех пор, пока она не просочится с обеих сторон. Нанесите зубную цементно-клеевую смесь на остальную часть открытого черепа, чтобы закрепить головную пластину на черепе, что уменьшит артефакты движения во время визуализации. Дайте смеси высохнуть на воздухе не менее 15 минут. Введите мышам 0,5 мл физиологического раствора подкожно, чтобы помочь в выздоровлении. 6. После операции Извлеките мышь из стереотаксической рамки и верните ее в клетку. Поместите часть клетки на водоциркуляционное одеяло, прокладки с космическим гелем или изотермические прокладки, чтобы помочь с восстановлением. Обеспечьте животному небольшую помощь пищевыми гранулами и влажным кормом, в дополнение к их обычному рациону, чтобы еще больше помочь в выздоровлении. Добавляйте новые пищевые гранулы и влажный корм каждый день после операции на время восстановления. На следующий день после операции мышам однократно вводят 5 мг/кг карпрофена и 5 мг/кг энрофлоксацина. На 2-6 день вводите мышам один раз с 5 мг / кг карпрофена и два раза с 5 мг / кг энрофлоксацина, в ожидании одобрения местным IACUC. Отделяют инъекции энрофлоксацина не менее чем на 8 ч. В дни 7-20 ежедневно вводят мышам 5 мг/кг карпрофена. 7. Привыкание животных к визуализации На 14-й день после операции осмотрите краниальное окно на предмет оптической прозрачности. Не используйте мышей с неясными или иным образом поврежденными окнами (т.е. чрезмерным ангиогенезом). Проверьте экспрессию tdTomato под флуоресцентным микроскопом. Если меченые клетки могут быть идентифицированы, приступайте к привыканию животных. Первый день привыкания (обращения) Подержите мышь в течение нескольких минут и верните ее в клетку после обработки. Повторите обработку три раза с интервалом в 15 минут между сеансами. После третьего испытания приучите мышь, завернув животное в небольшой кусочек ткани. Держите мышь завернутой в ткань примерно 1 минуту. После испытания верните мышь в клетку. Повторите этот процесс еще два раза, обеспечивая 15-минутный интервал между каждым испытанием. Второй день привыкания Взвесьте и запишите вес мыши. Заверните мышь в ткань и закрепите ее через головную пластину к рычагу фиксации головы поднятой по воздуху домашней клетки. Оставьте домашнюю клетку открытой для света. Дайте мыши оставаться в клетке мобильного дома в течение 15 минут. После привыкания выньте мышь из домашней клетки и выключите воздушный поток. Взвесьте мышь и верните ее в клетку. Позаботьтесь о том, чтобы включить только мышей, которые не теряют более 10% своей массы тела. Исключите мышей, которые теряют более 10% своего веса в течение любого дня привыкания из экспериментов по визуализации. Третий день привыкания и далее Взвесьте и запишите вес мыши, прежде чем закрепить ее в домашней клетке, поднятой по воздуху. Закрепите мышь в домашней клетке, поднятой по воздуху. Накройте домашнюю клетку чем-то, что обеспечит темную внутреннюю часть, например, коробкой, и позвольте мыши оставаться защищенной в течение 30 минут. Через 30 минут раскройте домашнюю клетку, извлеките мышь и выключите воздушный поток. Взвешивайте и записывайте вес мыши после привыкания. Повторяйте этот процесс каждый день, увеличивая продолжительность закрепления мыши в домашней клетке на 15 минут. Продолжайте этот процесс до тех пор, пока мышь не будет закреплена в домашней клетке в течение 1,5 ч, так как это приблизительная продолжительность сеанса двухфотонной визуализации. Чтобы приучить мышь к шуму, выполните некоторые сеансы привыкания на микроскопе, чтобы акклиматизировать мышь к звукам лазерных сканирующих зеркал. Исключите мышей, которые не привыкают в достаточной степени (т. Е. Вокализации и дефекация, вызванная стрессом). 8. Многофотонная визуализация Начните визуализацию через 3 недели после операции, чтобы окно очистилось. Выполняйте визуализацию на специально изготовленном или коммерчески доступном многофотонном микроскопе, оснащенном Ti:Sapphire лазером. Получайте изображения с помощью объектива с высокой числовой диафрагмой (NA).ПРИМЕЧАНИЕ: Двухканальная визуализация достигается с помощью 565 нм дихроичного зеркала и двух внешних фотоумноживателей. Полосовой фильтр 535/50 используется для обнаружения излучения GCaMP6f, а для обнаружения tdTomato используется полосовой фильтр 610/75. Для получения изображений, показанных на рисунках 1 и 2, использовались 25-кратный объектив погружения в воду (1,05 NA) и резонансные сканеры. Каждая интересующая область состояла из стопки изображений, разделенных в осевом направлении на 1 мкм. Каждая оптическая секция была собрана в 512 x 512 пикселей, 0,18 мкм / пиксель. Изображения были получены из передней области первичной моторной коры, определяемой стереотаксическими координатами. Установите длину волны лазера на 920 нм (990 нм, если используется GECI с красным смещением). Поместите мышь в клетку мобильного дома и прижмите головную панель к рычагу фиксации головы. Добавьте несколько капель воды в центр окна. Используя широкоугольный режим микроскопа, выберите 2-3 положения легко идентифицируемой сосудистой системы. Сохраните изображения этих кровеносных сосудов и запишите координаты X и Y, которые появляются на контроллере двигателя, чтобы переместить дендриты, меченые tdTomato, для последующих сеансов визуализации. Каждый раз корректируйте координаты X и Y, чтобы перестроиться с сохраненными изображениями кровеносных сосудов. После того, как сосудистая система была визуализирована и позиции записаны, найдите области с нейронами, экспрессирующими tdTomato (рисунок 1). Изображение синаптических структур (дендритов и аксонов) нейронов и активности GCaMP6f в астроцитах.ПРИМЕЧАНИЕ: Дендриты будут служить ориентирами для надежного возвращения в одни и те же области и изображения одних и тех же дендритов и астроцитов в течение нескольких дней. Не наблюдалось заметного сдвига в плоскости визуализации при стабильной фиксации головы и после привыкания к фиксации головы. Смещение, происходящее в направлениях X и Y, корректируется движением. После визуализации верните мышь в клетку.ПРИМЕЧАНИЕ: Мышей обычно держат на прицеле максимум 2 ч. Когда визуализация длится в течение длительного времени, вода под объективом может высохнуть. Воду следует добавлять во время экспериментов. В качестве альтернативы вместо воды можно использовать ультразвуковой гель.

Representative Results

Качество черепного окна можно оценить по тому, насколько четкими выглядят нейронные структуры. В хорошем окне хорошо видны дендритные шипы (рисунок 1). При сохранении структурных и позиционных данных одно и то же животное может быть изображено многократно в течение неск…

Discussion

Здесь мы представили протокол имплантации хронических черепных окон для визуализации in vivo корковых астроцитов и нейронов у бодрствующих, с задержкой головы мышей в воздушной домашней клетке. Были приведены конкретные примеры применения краниального окна для визуализации астроц…

Materials

15o Pointed Blade	Surgistar	6500	Surgery Tools
19 G Needles	BD	305186	Surgery Supply
AAV1-CAG-FLEX-tdTomato	Addgene	28306-AAV1	Viral Vector
AAV1-CaMKII-0-4-Cre	Addgene	105558-AAV1	Viral Vector
Acteone	Fisher Scientific	A16P4	Reagent
Alcohol Prep Pads	Fisher Scientific	Covidien 5750	Surgery Supply
Beveler	Narishige		Equipment
Borosilicate Glass	World Precision Instruments	TW100F-4	Surgery Supply
Carbide Burs	SS White Dental	14717	Surgery Tools
Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL	Zoetis Mylan Institutional, LLC.		Drug
Compressed Air	Fisher Scientific	23-022-523	Surgery Supply
Cotton Tip Applicators	Puritan	836-WC NO BINDER	Surgery Supply
Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm	Warner Instruments	64-0720, 64-0700	Surgery Supply
Dental Drill	Aseptico		Equipment
Dexamethasone, 4 mg/mL	Mylan Institutional, LLC.		Drug
Dissecting Microscope	Nikon		Equipment
Duralay Liquid  (dental cement liquid)	Patterson Dental	602-8518	Reagent
Duralay Powder  (dental cement powder)	Patterson Dental	602-7932	Reagent
Enrofloxacin, 2.27%	Bayer		Drug
Eye Ointment	Dechra	17033-211-38	Surgery Supply
Fiber Lite High Intensity Illuminator	Dolan-Jenner Industries		Equipment
Forceps (Large)	World Precision Instruments	14099	Surgery Tools
Forceps (Small)	World Precision Instruments	501764	Surgery Tools
GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J	The Jackson Laboratory	Stock No: 024105	Mouse line
Germinator	Fisher Scientific		Equipment
GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J	The Jackson Laboratory	Stock No: 012586	Mouse Line
Headplate	Neurotar	Model 1, Model 3	Surgery Supply
Hemostatic forceps	World Precision Instruments	501705	Surgery Tools
Holder for 15o Pointed Blade	World Precision Instruments	501247	Surgery Tools
Holder for Scalpel Blades	World Precision Instruments	500236	Surgery Tools
Iodine Prep Pads	Avantor	15648-926	Surgery Supply
Isoflurane	Piramal		Surgery Supply
Isoflurane table top system with Induction Box	Harvard Apparatus		Equipment
Isoflurane Vaporizer	SurgiVet		Equipment
Krazy Glue	Office Depot	KG517	Reagent
Loctite 401	Henkel	40140	fast-curing instant adhesive
Loctite 454	Fisher Scientific	NC9194415	cyanoacrylate adhesive gel
Micropipette Puller	Sutter Instruments		Equipment
Multiphoton Microscope			Equipment
Nitrogen	Matheson	NI M200	Gas
Oxygen	Matheson	OX M250	Gas
Picospritzer	Parker		intracellular microinjection dispense system
Pipette Tips	Rainin	17014340	Surgery Supply
Rodent Hair Trimmer	Wahl		Equipment
Saline (0.9% Sodium Chloride)	Med Vet International	RX0.9NACL-30BAC	Surgery Supply
Scalpel Blades, Size 11	Integra	4-111	Surgery Tools
Scissors	World Precision Instruments	503667	Surgery Tools
Stereotaxic Instrument	Stoelting		Equipment
Sugi Sponge Strips (sponge strips)	Kettenbach Dental	31002	Surgery Supply
SURGIFOAM (gel foam)	Ethicon	1972	Surgery Supply
Syringe with 26 G Needle	BD	309625	Surgery Supply
Tamoxifen	Sigma Aldrich	T5648-1G	Reagent
Ti:Sapphire Laser	Coherent		Equipment
Transfer Pipettes	Fisher Scientific	13-711-9AM	Surgery Supply
Water Blanket	Fisher Scientific		Equipment
Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL	Fresenius Kabi USA		Drug