Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Платформа культуры органов переднего сегмента для отслеживания травм открытого глобуса и терапевтической эффективности

1.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62649

⸱

25 августа 2021 г.

 , 
1Department of Sensory Trauma, United States Army Institute of Surgical Research, Fort Sam Houston, 2Engineering Processes and Product Development Group, United States Army Institute of Surgical Research, Fort Sam Houston

В этой статье

Краткое содержание

Травмы глаз с открытым глобусом могут быть без лечения в течение нескольких дней в сельских или военных сценариях, что приводит к слепоте. Терапевтические средства необходимы, чтобы свести к минимуму потерю зрения. Здесь мы подробно описываем модель повреждения открытого глобуса культуры органов. С помощью этой модели можно правильно оценить потенциальные терапевтические средства для стабилизации этих травм.

Аннотация

Травмы открытого земного шара имеют плохие визуальные результаты, что часто приводит к постоянной потере зрения. Отчасти это связано с длительной задержкой между травмами и медицинским вмешательством в сельских районах и применением военной медицины, где офтальмологическая помощь недоступна. Нелеченные травмы подвержены инфекции после того, как глаз потерял свое водонепроницаемое уплотнение, а также потере жизнеспособности тканей из-за внутриглазной гипотензии. Терапевтические средства для временной герметизации травм открытого земного шара, если они правильно разработаны, могут восстановить внутриглазное давление и предотвратить инфекцию до тех пор, пока не станет возможным надлежащий офтальмологический уход. Чтобы облегчить разработку продукта, здесь подробно описано использование платформы для травмы органов переднего сегмента с открытым глобусом для отслеживания терапевтической эффективности в течение не менее 72 ч после травмы. Ткань переднего сегмента свиньи может поддерживаться в специально разработанных блюдах для культуры органов и удерживаться при физиологическом внутриглазном давлении. Колотые повреждения могут быть созданы с помощью пневматической системы, способной генерировать травмы диаметром до 4,5 мм, аналогичные размерам травм, имеющих отношение к военным. Потеря внутриглазного давления может наблюдаться в течение 72 ч после травмы, подтверждая надлежащую индукцию травмы и потерю водонепроницаемого уплотнения глаза. Терапевтическая эффективность может быть отслежена путем нанесения на глаз после индукции травмы, а затем отслеживания внутриглазного давления в течение нескольких дней. Кроме того, модель повреждения переднего сегмента применима к широко используемым методам функционального и биологического отслеживания физиологии переднего сегмента, таким как оценка прозрачности, глазной механики, здоровья эпителия роговицы и жизнеспособности тканей. В целом, метод, описанный здесь, является необходимым следующим шагом на пути к разработке биоматериалной терапии для временного уплотнения травм открытого земного шара, когда офтальмологическая помощь недоступна.

Введение

Травмы открытого глобуса (OG) могут привести к постоянной потере зрения, если их не лечить или, по крайней мере, стабилизировать после травмы1. Однако задержки распространены в отдаленных районах, где доступ к офтальмологической интервенции недоступен, например, в сельских районах или на поле боя в военных сценариях. Когда лечение недоступно, текущий стандарт ухода заключается в защите глаза жестким щитом до тех пор, пока медицинское вмешательство не будет возможным. В военной медицине эта задержка в настоящее время составляет до 24 ч, но ожидается, что она увеличится до 72 ч в будущих боевых операциях в городских условиях, где воздушная эвакуация невозможна2,3,4. Эти задержки могут быть еще более длительными в сельских, отдаленных гражданских приложениях, где доступ к офтальмологической интервенции ограничен5,6. Нелеченная травма ОГ очень восприимчива к инфекции и потере внутриглазного давления (ВГД) из-за того, что водонепроницаемое уплотнение глаза скомпрометировано7,8. Потеря ВДМ может повлиять на жизнеспособность тканей, что делает любое медицинское вмешательство маловероятным для восстановления зрения, если задержка между травмой и терапией слишком длинна9.

Чтобы обеспечить разработку простых в применении терапевтических средств для герметизации травм ОГ до тех пор, пока не будет достигнут специалист по офтальмологу, ранее была разработана настольная модель травмы ОГ10,11. С этой моделью высокоскоростные травмы были созданы в целых глазах свиней, в то время как ВГОД было захвачено датчиками давления. Затем терапевтические средства могут быть применены для оценки их способности герметизировать место поврежденияОГ 12. Однако, поскольку эта модель использует целые глаза свиней, она может оценивать только немедленную терапевтическую эффективность без возможности отслеживания долгосрочной производительности через возможное 72-ч окно, в котором терапевтическое средство должно стабилизировать место травмы, пока пациент не достигнет специализированной помощи. В результате была разработана и детализирована модель повреждения OG культуры органов переднего сегмента (ASOC) в качестве платформы для отслеживания долгосрочной терапевтической эффективности13.

ASOC является широко используемым методом поддержания аваскулярной ткани переднего сегмента, такого как роговица, в течение нескольких недель после энуклеации14,15,16,17. Передний сегмент поддерживается при физиологическом ВГД путем перфузии жидкости на физиологических скоростях потока и сохранения области оттока трабекулярной сетки, ткани, ответственной за регулирование ВГД, во время установки ASOC18,19. Платформа ASOC может поддерживать ткани физиологически, индуцировать травму ОГ с помощью пневматического устройства, применять терапевтическое средство и отслеживать стабилизацию травмы в течение не менее 72 ч после травмы13.

Здесь протокол предоставляет пошаговую методологию использования платформы ASOC. Сначала подробно описывается, как настроить и изготовить платформу ASOC. Затем в протоколе подробно описывается, как асептически рассекать передний сегмент и поддерживать трабекулярную сетку, а затем настраивать ткань переднего сегмента в специально построенных блюдах для культуры органов. Затем в нем подробно описывается, как создать травмы открытого глобуса и применять терапевтические средства сразу после травмы. Наконец, протокол предоставляет обзор параметров характеристики, которые можно использовать с этим методом, который оценивает функциональные, механические и биологические свойства глаза и то, насколько хорошо травма была стабилизирована. В целом, эта модель обеспечивает столь необходимую платформу для ускорения разработки продуктов для стабилизации и лечения травм с открытым глобусом и улучшения прогноза плохого зрения после травмы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Прежде чем выполнять этот протокол, имейте в виду, что существуют юридические и этические требования к использованию животных в исследованиях и обучении. Если живые животные используются в качестве источника глазной ткани, обратитесь за одобрением в местный этический или юридический орган (IACUC или Комитет по этике и т. Д.) Если есть какие-либо вопросы в получении разрешения на использование животных, не приступайте. Ранее мы определили и сообщили, что свежие глаза свиней, полученные и использованные в течение 24 ч после вскрытия, сравнивались с физиологией in vivo и хорошо себя показали для этих исследований (Animal Technologies, Tyler, TX, США)10,13. Ни одно живое животные не использовались на протяжении всего этого протокола, используя поставщика тканей для получения ткани в течение 24 ч.

ПРИМЕЧАНИЕ: До прибытия ткани изготовьте посуду для посева органов(Дополнительный протокол 1),зажимные кольца(Дополнительный протокол 1),подставки для посуды(Дополнительный протокол 1),установку для сбора данных датчика давления(Дополнительный протокол 2)и пневматическую проколотую платформу(Дополнительный протокол 3). Стерилизуйте посуду, инструменты и принадлежности и подготовьте рабочие зоны. Полезно иметь нестерильную область для выполнения грубого рассечения на глазах, так как они обычно поставляются с соединительной, дополнительной орбитальной тканью. Выполните эти первые шаги на открытой, чистой рабочей поверхности, а затем перенесите глаза асептически в шкаф BSC II для микродифекции (шкаф No 1). Оптимально, чтобы шкаф BSC II, используемый для микродифлекции, отделялся от шкафа BSC II (шкаф No 2) для минимизации воздушного потока и максимизации рабочего пространства. Настройте микрофекционный шкаф с рассекающим микроскопом и способом визуализации рабочей поверхности (камеры или окуляров, выступающих из шкафа).

1. Этапы стерилизации, расходные материалы (см. Таблицу материалов для получения более подробной информации) и настройка

  1. Подготовьте и стерилизуйте газом следующие элементы (1 комплект для каждого глаза): противососольная тарелка, зажимное кольцо, два жидких соединителя с уплотнительными кольцами, две ступицы иглы 18 G, четыре винта, две длины трубки PE-100 (длина расстояния должна быть достаточной, чтобы простираться от чашки внутри инкубатора до шприцевого насоса и установки сбора данных датчика давления), две 18 G 90° изогнутые игольчатые ступицы, два 3-х хидных клапана.
  2. Подготовьте и автоклавьте следующие комплекты.
    1. Подготовьте и автоклавите набор инструментов для микродисперсирования, содержащий одну пару тонких щипцов, одну пару ножниц Vannas, одну пару щипцов со средними зубами, одну пару больших ножниц, ватные тампоны и лезвие бритвы или скальпель.
    2. Подготовьте и автоклавите комплект инструментов для сборки, содержащий одну пару средних зубчатых щипцов, одну пару хирургических ножниц и один L-ключ.
    3. Подготовьте и автоклавите ежедневный набор (количество: один в день культивирования), содержащий один L-ключ для затягивания зажимных колец к посуде каждый день по мере необходимости.
    4. Автоклавные четыре 100 мл для дезинфекции и хранения глаз и передних сегментов.
    5. Автоклав проколотых объектов.
  3. Соберите следующие стерильные предметы: чашка Петри (1 чашка / глаз), марля (1-2 / глаз), подставка для посуды, шприцы 20 мл (1 / глаз), шприцы 10 мл (1 / глаз), нейлоновые шприцевые фильтры (1 / глаз).
  4. Готовят стерильные среды: DMEM с 4% FBS, 1x Glutamax, 1x Гентамицин, 1x Антибиотик-Антимикотик (AA; приблизительно 30-40 мл полной среды / глаз).
  5. Приготовьте AA-PBS: PBS с 1x AA (~500 мл).
  6. Подготовьте набор инструментов для грубого вскрытия: очистите и высушите большие хирургические ножницы и щипцы.
  7. Настройте рабочее пространство для нестерильного рассечения: соберите расходные материалы из набора инструментов для грубого вскрытия, энуклеированных глаз свиней, погруженных в PBS и на лед, хирургическую драпировку, 100 мл клюва с PBS. Выложите хирургическую драпировку и предметы, необходимые для грубого рассечения.
  8. Настройте рабочее пространство для стерильного вскрытия: соберите расходные материалы из набора инструментов для микропарекции, стерильной марли, рассекающего микроскопа, раствора бетадина, стерильного PBS, стерильных сред, четырех стерилизованных 100 мл закромок, стерильной чашки Петри. Асептически перенести в кабинет BSC II No1. Настройте шкаф для визуализации глаз на рассекаемом микроскопе.
  9. Настройте рабочее пространство для сборки ASOC: соберите газостерилизованные наборы (комплект для посуды и комплект крышки), комплект сборочных инструментов, стерильные носители, подставки для посуды, стерильные чашки Петри, стерильные шприцы и шприцевые фильтры. Асептически перенести на БСК II кабинет No2. Настройте шкаф для сборки посуды.
  10. Когда глаза стабилизируются и готовы к проколу (72 ч после установки), асептически перенесите их в шкаф BSC II. Настройте рабочее пространство для индукции травм OG: пневматическое индукционное устройство травмы (сборка подробно описана в дополнении 3)и лабораторный разъем и перекрестные тиски для удержания антенны ASOC.

2. Рассечение ткани

  1. Подготовьте свиную ткань, используя нестерильное рабочее пространство для рассечения.
    1. Приобретите энуклеированные глаза свиней на местной скотобойне, в исследованиях на животных или у продавца. Следите за льдом, погруженным в PBS во время доставки и используйте его сразу после получения.
    2. Отрежьте экстраорбитальную ткань и обрежьте конъюнктиву, оставив только корнеосклеральную оболочку и зрительный нерв. Выполните рассечение в нестерильных условиях большими хирургическими ножницами и щипцами в грубом наборе инструментов для рассечения.
    3. Поместите глаза обратно в свежий PBS на льду до тех пор, пока все глаза, необходимые для экспериментальной установки, не будут предварительно / грубо вскрыты.
    4. Погружают глаза в 10% раствор бетадина на 2 мин в закрытые емкости и асептически переложат в шкаф 1 БСК II. Выполняйте все последующие работы в стерильных условиях, чтобы свести к минимуму загрязнения во время установки.
  2. Стерильно рассекает передние сегменты.
    1. Через 2 мин в растворе бетадина переводят глаза в три последовательных промывания стерильным AA-PBS для удаления избытка раствора бетадина с глазной поверхности при сохранении стерильности глазной ткани. После трех промываний выдерживайте ткани в АА-ПБС до дальнейшего использования.
    2. Прихрамывайте глаз с помощью лезвия бритвы/скальпеля и изогнутых ножниц. Поместите глаз на пропитанную AA-PBS марлю и создайте разрез стерильным лезвием бритвы или скальпелем вблизи экватора глаза (60/40 разделено с 40 на передней стороне). Используя изогнутые хирургические ножницы, гемисект глаз, чтобы изолировать передний глаз (половину роговицы).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разрез вокруг переднего сегмента должен быть непрерывным, чтобы предотвратить зубчатые, шероховатые края в склере, которые создадут утечки жидкости после установки в культуре органа.
    3. Используйте микросубчики в качестве лопаты, чтобы зачерпнуть стекловидное тело из переднего сегмента. Снимите хрусталик с переднего сегмента с помощью микроциплин. Оставьте передние сегменты в AA-PBS до дальнейших этапов рассечения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все глаза, которые будут рассечены, могут быть проведены на этом этапе и один за другом проходить через оставшуюся часть процесса рассечения.
    4. С помощью рассекающего микроскопа срезайте радужную оболочку до корня радужки постепенно, радиально до тех пор, пока не будет видна трабекулярная сетка (ТМ). ТМ представляет собой пигментированную ткань, которая содержит волокна по окружности, ориентированные вокруг корнеосклеральной оболочки. Осторожные срезы в радужной оболочке по направлению к корню радужной оболочки обнажат глубину ТМ под тканью.
    5. Отрежьте 360° вокруг радужной оболочки на той же глубине, что и первоначальный врез в ткань, чтобы обнажить всю область ТМ. Очистите все оставшиеся остаточные радужные оболочки, покрывающие ТМ, по мере необходимости.
    6. Обрежьте остатки цилиарного тела с задней части ТМ, оставив только тонкую полосу ткани с задней стороны области ТМ (примерно 1 мм).
    7. Поместите рассеченный передний сегмент (AS) в носитель до дальнейшей установки в ASOC в шкафу BSC II No2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все глаза могут быть проведены на этом этапе перед настройкой ASOC, если один пользователь выполняет вскрытие и сборку чашки для культуры органа.

3. Установка передних сегментов в блюдах для культуры органов

  1. Поместите одну AS в чашку Петри с перевернутой AS (чашка вверх). Используя ватный тампон, смочите в среде и аккуратно нанесите на центр роговицы, чтобы удалить любой пигмент. Используя щипцы, чтобы удерживать глаз и тот же тампон, протрите ватный тампон вокруг склеры, чтобы удалить лишний пигмент.
  2. Перевернить АС и поместить сверху нижней части блюда над возвышенной областью, центрируя роговицу над возвышенной областью в блюде. Поместите зажимное кольцо поверх вновь размещенного AS.
  3. Поместите четыре винта в соответствующие отверстия, чтобы удерживать кольцо на месте с AS под кольцом. Аккуратно вручную затяните винты с помощью L-ключа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этап затяжки будет происходить ежедневно на протяжении всего эксперимента, поэтому цель первоначального затяжки здесь заключается в том, чтобы гарантировать, что среда не протекает, избегая при этом разрыва зажимного кольца.
  4. С помощью стерильной чашки Петри поместите верхнюю часть над чашкой и перевертите установку. Прикрепите подставку для посуды. Прикрепите жидкостные соединители с уплотнительными кольцами к резьбовым портам на дне тарелки.
  5. К одному жидкостному разъему прикрепите изогнутую игольчатую ступицу 18 G 90°, трубку длиной, игольчатый концентратор 18 G, фильтр нейлонового шприца, трехсторонний клапан и шприц объемом 20 мл, заполненный средой.
  6. Ко второму жидкостному разъему прикрепите изогнутую игольчатую ступицу 18 G 90° градусов, длину трубки, игольчатую ступицу 18 G, трехсторонний клапан и бочковую часть стерильного шприца 10 мл (это будет действовать как резервуар для улавливания жидкости и пузырьков из ASOC).
  7. С трехходовыми клапанами, соответствующим образом открытыми для шприцев, осторожно проталкивайте жим через систему, используя порт разъема жидкости, определенный на этапе 3.5, для надувания AS, заполнения среды в трубке и, в конечном итоге, резервуара.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если среда просачивается в тарелку ASOC, AS недостаточно плотно закреплена зажимным кольцом.
  8. Удалите пузырьки, осторожно вдавливая жим в посуду и переворачивая блюдо, чтобы вытолкнуть пузырьки в резервуар.
  9. Положите блюдо и встаньте вертикально. Поместите нижнюю часть чашки Петри под ножки подставки, стараясь не зацепить трубку.

4. Начало культуры органов переднего сегмента

  1. ASOC теперь готова к инкубации. Поместите тарелку ASOC в инкубатор клеточных культур (37 °C, 5% CO2). Убедитесь, что высота асокарелки в инкубаторе выше датчиков давления известна и учитывается для точного расчета ВГОД(Дополнительный протокол 4).
  2. Направляйте линии труб через нижнюю часть дверцы инкубатора 37 °C, 5% CO2, чтобы они не мешали открытию и закрытию двери. Прикрепите шприц 20 мл к шприцевой насосной установке со скоростью 2,5 мкл/мин.
  3. Расположите линию НКТ с резервуаром на приборе преобразователя давления. Подключите боковой 3-ходовой клапан к установке датчика давления во время протекания PBS через линию, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха в трубные линии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очистите PBS от резервуаров после настройки системы, чтобы уменьшить вероятность загрязнения резервуара ростом микробов в течение всего периода культуры органов.
  4. Начните сбор данных IOP, предварительно убедив наличие карты microSD для сохранения файлов данных. Затем включите настройку датчика давления, чтобы начать сбор данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация о настройке устройства сбора данных преобразователя давления приведена в Дополнительном протоколе 2.

5. Ежедневное обслуживание АСОК

  1. После того, как ASOC будет 24 ч, чтобы уравновесить, удалите посуду из инкубатора 37 ° C, 5% CO2 и поместите ее в шкаф BSC II.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При сборе данных о давлении эти периоды времени выглядят как всплески, поскольку ASOC удаляются из инкубатора (изменение высоты) и регулируются в шкафу.
  2. Проверьте наличие утечек под каждой чашкой на тарелке Петри. Если они присутствуют, проверьте наличие плотных жидкостных соединений под блюдом и при необходимости снова затяните. Проверьте наличие утечек в верхней части тарелки с помощью стерильного L-ключа, чтобы затянуть винты в зажимном кольце.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань склеры AS будет сжиматься и уменьшать толщину на 24 ч, а зажимное кольцо нужно будет затянуть.
  3. Хорошо аспирировать СМИ от блюда.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трабекулярная сетка фильтрует жидкость из среды, закачиваемой в ASOC. Поэтому носители будут присутствовать в АСОК тарелке по краям.
  4. Повторите шаги 3.7 и 3.8, чтобы удалить все захваченные пузырьки воздуха.
  5. Заправляйте шприцы на шприцевых насосах, убедитесь, что шприцевые насосы работают, и подтвердите выравнивание клапанов для перфузии в ASOC. Верните посуду ASOC в инкубатор 37 °C, 5% CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимально, чтобы эти шаги выполнялись ежедневно. Тем не менее, использование начального объема среды 20 мл, объема скважины ASOC и скорости насоса 2,5 мкл / мин должно быть достаточным, чтобы система работала в течение нескольких дней без помех.

6. Индукция травмы ОГ с помощью проколотого устройства с пневматическим приводом

ПРИМЕЧАНИЕ: Конструкция пневматического проколотого устройства подробно описана в Дополнительном протоколе 3. Травмы ОГ индуцируются после стабилизации ВГД, что обычно происходит через 3 дня в культуре. Допустимые значения ВГД составляют 5-20 мм рт.ст. на основе физиологического ВГД, которые могут быть определены путем оценки файлов данных ВГД или установки светодиодных индикаторов в системе измерения давления, как описано в Дополнительном протоколе 2.

  1. Подготовьте шкаф BSC II для индукции травмы OG, как описано в шаге 1.10. Подключите проколовую платформу к линии сжатого воздуха. Прикрепите стерильный прокол к патрону.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для питания устройства может использоваться воздушный компрессор, но сжатого воздуха в резервуаре или встроенных лабораторных линий может быть достаточно, если давление превышает 50 фунтов на дюйм.
  2. Установите регулятор давления на проколовой платформе на 50 psi для адекватного прокола на объектах диаметром до 4,5 мм. Расположите тиски поперечного слежения на лабораторном домкрате перед проколотой платформой, чтобы удерживать тарелку ASOC во время индукции травмы.
  3. Снимите установку ASOC с инкубатора 37 °C, 5% CO2 и поместите в крестовые тиски перпендикулярно проколотой платформе(рисунок 2)после снятия крышки и откладывания ее в сторону. Держите передний сегмент перфузным, но закройте 3-образное отверстие клапана к датчику давления, чтобы предотвратить повреждение датчика под избыточным давлением.
  4. Вытяните кронштейн поршня на максимальное расстояние и расположите вершину роговицы в пределах 1 мм от объекта прокола. Втяните кронштейн поршня и поднесите передний сегмент на 1 см ближе к объекту прокола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это расстояние было оптимизировано для высокоэффективной индукции травм без попадания в тарелку ASOC.
  5. Выстрелите проколом, включив его и открыв электромагнитный клапан вторым переключателем на устройстве. Чтобы втянуть устройство, нажмите второй переключатель еще раз, чтобы удалить прокол из глаза. Проверьте правильную индукцию травмы путем визуального осмотра и утечки среды из места травмы.
  6. Снимите с тисков тарелку ASOC; поместите крышку обратно на тарелку в сборе и откройте жидкостную линию к датчику давления. Поместите ASOC обратно в инкубатор 37 °C, 5% CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе терапевтическое средство может быть применено к АС для оценки его эффективности для герметизации травм ОГ.

7. Удаление ASOC из культуры

ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от анализа конечных точек (см. Репрезентативные результаты для возможных методов конечных точек), AS должен оставаться в чашке ASOC раздутым, в то время как другие методы требуют, чтобы ткань AS была изолирована из культуральной камеры. Приведенная ниже методика описывает, как вывести АС из посуды для посева органов и удалить остальную часть установки.

  1. Удалите посуду ASOC из инкубатора с 37 °C, 5% CO2. Закройте 3-х точный клапан к шприцевой шприц и резервуару и отсоедините трубку от системы. Выбросьте шприц, резервуар и фильтр. Поместите 3-х хозяйковые клапаны, трубки и игольчатые ступицы в отдельный контейнер для промывки и стерилизации.
  2. Отсоедините ступицы игл от жидкостных соединений на дне тарелки. Отсоединайте жидкостные разъемы и уплотнители. Поместите все предметы в контейнер для мытья и стерилизации.
  3. Снимите четыре винта с зажимного кольца с помощью L-ключа. Осторожно снимите зажимное кольцо.
  4. Используя щипцы, удалите АС из чашки и, в зависимости от анализа конечной точки и изображения, поместите в фиксатор или соответствующие биологические отходы.

8. Анализ данных ВГОД

  1. Подключите карту microSD к компьютеру, чтобы удалить .txt файл, содержащий данные из последнего экспериментального запуска.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Файл назван в коде, управляющем микроконтроллером, и должен обновляться для каждого эксперимента (см. Дополнительный протокол 2).
  2. Импортируйте данные в электронную таблицу.
  3. Организуйте данные в 12 столбцов: время (в мин) и сигнал мВ для каждого из 11 каналов преобразователя давления. Первые десять каналов соответствуют десяти экспериментальным установкам ASOC. Последний сигнал преобразователя предназначен для датчика, открытого для воздуха в качестве канала управления для подтверждения того, что сигнал мВ не изменился из-за изменений во входном сигнале. График канала управления временем для подтверждения того, что сигнал мВ был согласован во всем.
  4. Преобразуйте сигналы мВ для десяти каналов в мм рт.ст., используя уравнения наклона-перехвата, генерируемые начальной калибровкой каждого датчика (см. Дополнительный протокол 4).
  5. Постройте график времени (преобразуйте в дни для упрощения интерпретации данных) по каждому из десяти каналов, чтобы определить, как ВГД колебалась в течение экспериментального времени.
  6. Определите средние значения ВГД в ключевых точках данных, чтобы легче сравнивать значения между каждым из них и то, как они изменяются до и после индукции травмы ОГ. В среднем 2-3 ч данных для каждого 24-ч интервала для определения ВГОД в каждый день АСОК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные результаты ВГД показаны на рисунке 4.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Изображения, полученные с помощью оптической когерентной томографии (OCT), показаны для глаз с травмированным OG, чтобы проиллюстрировать, как выглядит успешная индукция травмы. На рисунке 3 показаны изображения для контроля и OG поврежденной ткани AS сразу после травмы и через 72 ч. Показаны два вида: изображения поперечного сечения через место повреждения и проекция максимальной интенсивности сверху вниз (MMP) для визуализации площади поверхности изображения. Контрольные глаза не показываю...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Существуют критические шаги с платформой asoc OG injury, которые следует выделить, чтобы повысить вероятность успеха при использовании методологии. Во-первых, во время рассечения переднего сегмента сохранение трабекулярной сетки является важным, но сложным для правильного выполнения. Если ТМ нарушена, глаз не будет поддерживать физиологическое давление и не будет соответствовать критериям приемлемости для экспериментального использования. Рекомендуется сначала практиковать процесс рассечения в нормальных условиях, а не в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов. Мнения, выраженные в этой статье, являются мнениями автора (авторов) и не отражают официальную политику или позицию Медицинского департамента армии США, Министерства армии, Министерства обороны или правительства США.

Благодарности

Этот материал основан на работе, поддержанной Министерством обороны Соединенных Штатов в рамках межведомственного соглашения (No 19-1006-IM) с программой приобретения временного ремонта роговицы (Агентство по развитию медицинской техники армии США).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10-32 Прямая вилка из поликарбоната, соединитель трубы с наружной резьбойMcMaster-Carr51525K431
10-32 Винт торцевой крышки, ½ "McMaster-Carr92196A269
10 мл шприцBD302995
20 мл шприцBD302830
Anti-AntiGibco15240-096
Шариковый ключ L McMaster-Carr5020A25
BetadineFisher ScientificNC1696484
BD  Интрамедик  PE 160 ТрубкаFisher Scientific14-170-12E
Ватные палочкиPuritan25-8061WC
DMEM mediaATCC30-2002
FBSATCC30-2020
Тонкие щипцыWorld Precision Instruments15914
МарляCovidien8044
GentamicinGibco15710-064
ГлутамаксGibco35050-061
Уплотнительное кольцо из силикона высокого давления, ширина 2 мм, внутренний диаметр 4мм McMaster-Carr5233T47
Щипцы большиеПрецизионные инструменты World Precision Instruments500365
Большие хирургические ножницыWorld Precision Instruments503261
Щипцы со средними зубьямиWorld Precision Инструменты501217
Гвоздь (предмет для прокола)McMaster-Carr97808A503
Нейлоновые шприцевые фильтрыFisher09-719C
PBSGibco10010-023
Чашка Петри (100 мм)FisherFB0875713
Поликарбонат, трехходовой, запорный кран с наружной резьбой; Луэр  замокFisherNC9593742
Лезвие бритвыFisher12-640
Нержавеющая сталь 18 G  90 градусов  угловая игла дозирующаяMcMaster-Carr75165A81
Нержавеющая сталь 18 G прямая ½ '’ игла для дозированияMcMaster-Carr75165A675
Стерильные стаканы 100 мл с крышкамиVWR15704-092
Vannas  ножницыWorld Precision InstrumentsWP5070

Ссылки

  1. Hilber, D., Mitchener, T. A., Stout, J., Hatch, B., Canham-Chervak, M. Eye injury surveillance in the US Department of Defense, 1996-2005. American Journal of Preventive Medicine. 38, 1 Suppl 78-85 (2010).
  2. Linde, A. S., McGinnis, L. J., Thompson, D. M. Multi-Battle domain-perspective in military medical simulation trauma training. Journal of Trauma & Treatment. 06 (04), (2017).
  3. Riesberg, J., Powell, D., Loos, P. The loss of the golden hour. Special Warfare. , 49-51 (2017).
  4. Townsend, S., Lasher, W. The US Army in Multi-Domain Operations 2028. (525-3-1), US Army. (2018).
  5. Blanch, R. J., Bishop, J., Javidi, H., Murray, P. I. Effect of time to primary repair on final visual outcome after open globe injury. The British Journal of Ophthalmology. 103 (10), 1491-1494 (2019).
  6. Lesniak, S. P., et al. Characteristics and outcomes of delayed open globe repair. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (14), 4954(2012).
  7. Loporchio, D., Mukkamala, L., Gorukanti, K., Zarbin, M., Langer, P., Bhagat, N. Intraocular foreign bodies: A review. Survey of Ophthalmology. 61 (5), 582-596 (2016).
  8. Jonas, J. B., Budde, W. M. Early versus late removal of retained intraocular foreign bodies. Retina. 19 (3), Philadelphia, Pa. 193-197 (1999).
  9. Watson, P. G., Jovanovik-Pandova, L. Prolonged ocular hypotension: would ciliary tissue transplantation help. Eye. 23 (10), 1916-1925 (2009).
  10. Snider, E. J., et al. Development and characterization of a benchtop corneal puncture injury model. Scientific Reports. 10 (1), 4218(2020).
  11. Snider, E. J., et al. An open-globe porcine injury platform for assessing therapeutics and characterizing biological effects. Current Protocols in Toxicology. 86 (1), 98(2020).
  12. Snider, E. J., Cornell, L. E., Gross, B., Zamora, D. O., Boice, E. N. Assessment of commercial off-the-shelf tissue adhesives for sealing military relevant corneal perforation injuries. Military Medicine. , (2021).
  13. Snider, E. J., Boice, E. N., Butler, J. J., Gross, B., Zamora, D. O. Characterization of an anterior segment organ culture model for open globe injuries. Scientific Reports. 11 (1), 8546(2021).
  14. Erickson-Lamy, K., Rohen, J. W., Grant, W. M. Outflow facility studies in the perfused human ocular anterior segment. Experimental Eye Research. 52 (6), 723-731 (1991).
  15. Johnson, D. H., Tschumper, R. C. The effect of organ culture on human trabecular meshwork. Experimental Eye Research. 49 (1), 113-127 (1989).
  16. Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
  17. Snider, E. J., et al. Improving stem cell delivery to the trabecular meshwork using magnetic nanoparticles. Scientific Reports. 8 (1), 12251(2018).
  18. Llobet, A., Gasull, X., Gual, A. Understanding trabecular meshwork physiology: a key to the control of intraocular pressure. Physiology. 18 (5), 205-209 (2003).
  19. Goel, M., Picciani, R. G., Lee, R. K., Bhattacharya, S. K. Aqueous humor dynamics: A review. The Open Ophthalmology Journal. 4, 52-59 (2010).
  20. Snider, E. J., et al. Development of a porcine organ-culture glaucoma model mimicking trabecular meshwork damage. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (3), 18(2021).
  21. Ren, H., Wilson, G. Apoptosis in the corneal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (6), 1017-1025 (1996).
  22. Komuro, A., Hodge, D. O., Gores, G. J., Bourne, W. M. Cell death during corneal storage at 4°C. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2827-2832 (1999).
  23. Crespo-Moral, M., García-Posadas, L., López-García, A., Diebold, Y. Histological and immunohistochemical characterization of the porcine ocular surface. PLOS One. 15 (1), e0227732(2020).
  24. Wilson, S. E., Medeiros, C. S., Santhiago, M. R. Pathophysiology of corneal scarring in persistent epithelial defects after prk and other corneal injuries. Journal of Refractive Surgery. 34 (1), Thorofare, NJ. 59-64 (2018).
  25. Auw-Haedrich, C., et al. Immunohistochemical expression of epithelial cell markers in corneas with congenital aniridia and ocular cicatrizing pemphigoid. Acta Ophthalmologica. 89 (1), 47-53 (2011).
  26. Lyngholm, M., et al. Immunohistochemical markers for corneal stem cells in the early developing human eye. Experimental Eye Research. 87 (2), 115-121 (2008).
  27. Bandamwar, K. L., Papas, E. B., Garrett, Q. Fluorescein staining and physiological state of corneal epithelial cells. Contact Lens & Anterior Eye: The Journal of the British Contact Lens Association. 37 (3), 213-223 (2014).
  28. Bandamwar, K. L., Garrett, Q., Papas, E. B. Sodium fluorescein staining of the corneal epithelium: What does it mean at a cellular level. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (14), 6496(2011).
  29. Sherwood, J. M., Reina-Torres, E., Bertrand, J. A., Rowe, B., Overby, D. R. Measurement of outflow facility using iPerfusion. PLoS One. 11 (3), (2016).
  30. Weichel, E. D., Colyer, M. H., Ludlow, S. E., Bower, K. S., Eiseman, A. S. Combat ocular trauma visual outcomes during operations iraqi and enduring freedom. Ophthalmology. 115 (12), 2235-2245 (2008).
  31. Colyer, M. H., et al. Delayed intraocular foreign body removal without endophthalmitis during Operations Iraqi Freedom and Enduring Freedom. Ophthalmology. 114 (8), 1439-1447 (2007).
  32. Geggel, H. S., Maza, C. E. Anterior stromal puncture with the Nd:YAG laser. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 31 (8), 1555-1559 (1990).
  33. Matthews, A., et al. Indentation and needle insertion properties of the human eye. Eye. 28 (7), 880-887 (2014).
  34. Rau, A., et al. The mechanics of corneal deformation and rupture for penetrating injury in the human eye. Injury. 49 (2), 230-235 (2018).
  35. Agrawal, R., Ho, S. W., Teoh, S. Pre-operative variables affecting final vision outcome with a critical review of ocular trauma classification for posterior open globe (zone III) injury. Indian Journal of Ophthalmology. 61 (10), 541(2013).
  36. Knyazer, B., et al. Prognostic factors in posterior open globe injuries (zone-III injuries). Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (9), 836-841 (2008).
  37. Tan, J., et al. C3 Transferase-Expressing scAAV2 Transduces Ocular Anterior Segment Tissues and Lowers Intraocular Pressure in Mouse and Monkey. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 17, 143-155 (2020).
  38. Bhattacharya, S. K., Gabelt, B. T., Ruiz, J., Picciani, R., Kaufman, P. L. Cochlin Expression in Anterior Segment Organ Culture Models after TGFβ2 Treatment. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (2), 551-559 (2009).
  39. Zhu, W., Godwin, C. R., Cheng, L., Scheetz, T. E., Kuehn, M. H. Transplantation of iPSC-TM stimulates division of trabecular meshwork cells in human eyes. Scientific Reports. 10 (1), 2905(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Платформа культуры органов переднего сегмента для отслеживания травм открытого глобуса и терапевтической эффективности
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.