Методическая статья

Эффективный метод направленной индукции гепатоцитоподобных клеток из эмбриональных стволовых клеток человека

DOI:

10.3791/62654

⸱

6 мая 2021 г.

 ,  ,  ,  , 
1Stem Cell Research Center, Shantou University Medical College, 2The Center for Reproductive Medicine, Shantou University Medical College, 3Guangdong Provincial Key Laboratory of Infectious Diseases and Molecular Immunopathology, Shantou University Medical College

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой рукописи описывается подробный протокол дифференцировки эмбриональных стволовых клеток человека (hESCs) в функциональные гепатоцитоподобные клетки (HLC) путем непрерывного дополнения Activin A и CHIR99021 во время дифференцировки hESC в окончательную эндодерму (DE).

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Потенциальные функции гепатоцитоподобных клеток (ГЛК), полученных из эмбриональных стволовых клеток человека (hESCs), имеют большие перспективы для моделирования заболеваний и скрининга лекарств. Здесь приведен эффективный и воспроизводимый метод дифференциации гЭСК на функциональные КВУ. Создание линии эндодермы является ключевым шагом в дифференциации к КВУ. С помощью нашего метода мы регулировали ключевые сигнальные пути, непрерывно дополняя активин А и CHIR99021 во время дифференцировки hESC в окончательную эндодерму (DE), за которой следует генерация печеночных клеток-прогениторов и, наконец, HLC с типичной морфологией гепатоцитов поэтапным методом с полностью определенными реагентами. Полученные из hESC HLC, полученные этим методом, экспрессируют специфические для стадии маркеры (включая альбумин, ядерный рецептор HNF4α и котранспортный полипептид таурохолата натрия (NTCP)) и демонстрируют особые характеристики, связанные со зрелыми и функциональными гепатоцитами (включая зеленое окрашивание индоцианином, хранение гликогена, окрашивание гематоксилин-эозина и активность CYP3), и могут обеспечить платформу для разработки приложений на основе HLC в изучении заболеваний печени.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Печень является высоко метаболическим органом, который играет несколько ролей, включая раскисление, хранение гликогена, а также секрецию и синтез белков1. Различные возбудители, лекарственные препараты и наследственность могут вызывать патологические изменения в печени и влиять на ее функции2,3. Гепатоциты, как основная функциональная единица печени, играют важную роль в искусственных системах поддержки печени и устранении лекарственной токсичности. Однако ресурс первичных гепатоцитов человека ограничен в клеточной терапии, а также в исследованиях заболеваний печени. Поэтому разработка новых источников функциональных гепатоцитов человека является важным направлением исследований в области регенеративной медицины. С 1998 года, когда были установлены4hESCs, hESCs широко рассматривались исследователями из-за их превосходного дифференцировального потенциала (они могут дифференцироваться в различные ткани в подходящей среде) и высокой степени самовозобновляемости, и, таким образом, обеспечивают идеальные исходные клетки для биоискусственной печени, трансплантации гепатоцитов и даже тканевой инженерии печени5.

В настоящее время эффективность дифференцировки печенки может быть значительно увеличена за счет обогащения энтодермы6. При линейной дифференцировке стволовых клеток в эндодерму ключевыми факторами в узле стадии формирования эндодермы являются уровни трансформировки фактора роста β (TGF-β) и сигнальных путей WNT. Активация высокого уровня TGF-β и сигнализации WNT может способствовать развитию эндодермы7,8. Активин А является цитокином, принадлежащим к надсемейству TGF-β. Поэтому Активин А широко используется в индукции эндодермы индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) и hESCs9,10. GSK3 представляет собой серин-треонин протеинкиназу. Исследователи обнаружили, что CHIR99021, специфический ингибитор GSK3β, может стимулировать типичные сигналы WNT и может способствовать дифференцировке стволовых клеток при определенных условиях, предполагая, что CHIR99021 имеет потенциал для индуцирования дифференцировки стволовых клеток в эндодерму 11,12,13.

Здесь мы сообщаем об эффективном и воспроизводимом методе эффективного индуцирования дифференциации hESCs в функциональные HLC. Последовательное добавление активина А и CHIR99021 произвело около 89,7±0,8% SOX17 (DE маркер)-положительных клеток. После дальнейшего созревания in vitroэти клетки экспрессировали печеночные специфические маркеры и проявляли гепатоцитарно-подобную морфологию (основанную на окрашивание гематоксилин-эозином (H & E)) и функции, такие как поглощение индоцианинового зеленого (ICG), хранение гликогена и активность CYP3. Результаты показывают, что hESCs могут быть успешно дифференцированы в зрелые функциональные HLC с помощью этого метода и могут обеспечить основу для исследований, связанных с заболеваниями печени, и скрининга лекарств in vitro.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Поддержание стволовых клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол поддержания клеток, описанный ниже, применяется к клеточной линии hES03, поддерживаемой в адгезивном монослое. Для всех следующих протоколов в этой рукописи клетки должны обрабатываться под шкафом биологической безопасности.

  1. Приготовьте 1x среду для культивирования стволовых клеток mTesR путем разбавления 5x дополнительной среды до основной среды mTesR.
  2. Приготовьте 30-кратную 30-кратную hESC-квалифицированную среду Matrigel, разбавляя 5 мл матричеля, сертифицированного hESC, 5 мл DMEM/F12 на льду. Хранить при -20 °C.
  3. Приготовьте 1 среду Matrigel, сертифицированную hESC, путем разбавления 33,3 мкл 30-кратного Матрикеля, сертифицированного hESC, 1 мл DMEM/F12.
  4. Покрывайте стерильным 6 хорошо, обработанные культурой тканей пластины 1 мл 1x hESC-квалифицированным Матригелем в каждой скважине заранее и храните при 4 °C в течение ночи. Оставить при комнатной температуре (RT) не менее чем на 30 мин перед использованием.
  5. Разморозьте криоконсервированную гЭСК на водяной бане 37 °C в течение 3 мин без встряхивания. Затем немедленно перенесите клетки путем пипетки в 15 мл центрифужной трубки, содержащей 4 мл предварительно выровненной среды 37 °C mTesR, пипеткой вверх и вниз осторожно 2 раза.
  6. Центрифугировать гЭСК при 200 х г в течение 2 мин при РТ.
  7. Аспирировать супернатант и осторожно повторно суспендировать клетки в 1 мл среды mTesR.
  8. Аспирировать среду DMEM/F12 из пластины и засеять клетки в колодец из 6-скважинной пластины с плотностью 1 х10 5 клеток в 2 мл mTesR.
  9. Инкубируют в 5% CO2 инкубаторе и поддерживают клетки, заменяя их предварительно нагретой средой mTesR ежедневно. Прохождение клеток примерно при 70-80% слиянии или когда колонии клеток начинают контактировать.

2. Прохождение и дифференцировка стволовых клеток

  1. Для пассирования клеток аспирируют среду и инкубируют клетки с 1 мл на скважину раствора фермента (например, Аккутазы в течение 5 мин при 37 °C). Затем перенесите ячейки путем пипетки в центрифужную трубку 15 мл, содержащую 4 мл ПРЕДВАРИТЕЛЬНО ВЫЖОГЕННОГО DMEM/F12 до 37 °C.
  2. Центрифугировать ячейки при 200 х г при РТ в течение 2 мин.
  3. Аспирировать среду и осторожно повторно суспендировать клеточную гранулу в 1 мл среды mTesR.
  4. Заранее подготовьте плиты из 24 скважин, покрыв 250 мкл 1-кратной среды Matrigel, сертифицированной hESC. Семенные гЭСК, как описано выше, при плотности 1 - 1,5 х 105 клеток на скважину в 500 мкл среды mTesR.
  5. Дайте клеткам инкубироваться в течение 24 ч при 37 °C в инкубатореCO2.

3. Формирование DE

  1. Готовят стоковые растворы 100 мкг/мл Активина А с DPBS, содержащие 0,2% BSA и 3 мМ CHIR99021 с DMSO.
  2. Подготовьте базовую среду дифференциации стадии I, дополнив среду RPMI 1x B27.
  3. Добавьте Активин А к конечной концентрации 100 нг/мл и CHIR99021 к конечной концентрации 3 мкМ в соответствующем объеме предварительно нагретой основной среды дифференцировки стадии I.
  4. Аспиратную среду mTesR из клеток и заменить дифференцировочной средой стадии I, содержащей дополнительные факторы дифференцировки (например, 0,5 мл на скважину 24-скважинной пластины).
  5. Дайте клеткам инкубироваться в течение 3 дней при 37 °C в инкубаторе CO2, ежедневно заменяя жиму стадии I свеженачисляемыми факторами дифференцировки (дни 0-2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: После 3 дней дифференцировки дифференцированные клетки должны экспрессировать маркеры DE-клеток, таких как FOXA2, SOX17, GATA4, CRCR4 и FOXA1 (минимум 80% SOX17, необходимых для продолжения).

4. Дифференцировка печеночных клеток-прогениторов

  1. Подготовка основных сред дифференцировки II стадии путем растворения нокаутирующего сывороточного заменителя (KOSR) до конечной концентрации 20% в Knock Out DMEM.
  2. Готовят дифференцирурую стадии II, содержащую 1% ДМСО, 1x GlutaMAX, 1x раствор незамещающих аминокислот (NEAA), 100 мкМ 2-меркаптоэтанола и 1x пенициллина/стрептомицина (P/S) до соответствующего объема KOSR/нокаутирующего DMEM.
  3. На 3-й день дифференцировки аспирировать среду и заменить средой II стадии (например, 0,5 мл на скважину 24-скважинной пластины). Затем инкубируют в течение 24 ч.
  4. На 4-й день дифференцировки аспирировать среду и заменить средой II стадии (например, 1 мл на скважину плиты из 24 скважин).
  5. Меняйте среду через день (заменяйте среду на 6-й день).
    ПРИМЕЧАНИЕ: После 8 дней дифференцировки дифференцированные клетки должны экспрессировать соответствующие маркеры печеночных клеток-прогениторов, таких как HNF4α, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA (минимум 80% HNF4α, необходимых для продолжения).

5. Дифференцировка гепатоцитов

  1. Готовят 10 мкг/мл фактора роста гепатоцитов (HGF), 20 мкг/мл растворов онкостатина (OSM) с DBPS (содержащим 0,2% BSA) и фильтр с фильтрующей мембраной 0,22 мкм.
  2. Готовят iii стадию дифференцировочной среды (гепатоЗИМ-SFM (HZM) среды, дополненной 10 мкМ гидрокортизон-21-гемисукцината и 1x P/S).
  3. Добавьте HGF к конечной концентрации 10 нг/мл и OSM к конечной концентрации 20 нг/мл к соответствующему объему предварительно нагретой дифференцированной среды стадии III.
  4. На 8-й день дифференцировки аспирируют среду II стадии из клеток и заменяют средой III стадии (например, 1 мл на скважину 24-й скважинной пластины).
  5. Дайте клеткам инкубироваться в течение 10 дней при 37 °C в инкубаторе CO2, изменяя жимы стадии III через день со свежеустановительными факторами дифференцировки (дни 8-18).
    ПРИМЕЧАНИЕ: После 18 дней дифференцировки дифференцированные клетки должны экспрессировать характерные маркеры гепатоцитов, такие как AAT, ALB, TTR, HNF4α, NTCP, ASGR1, CYP3A4. Процент альбумин-положительных клеток обычно составляет более 90%.

6. Выделение РНК, синтез кДНК и анализ RT-qPCR

  1. Аспирировать среду из клеток и добавить необходимое количество реагента РНКайсо Плюс (например, 0,3 мл на скважину 24-скважинной пластины). Соберите супернатант в пробирку 1,5 мл и останьтесь на RT в течение 5 мин.
  2. Добавьте 60 мкл хлороформного реагента и оставьте его при РТ в течение 5 мин. Затем центрифугу при 12 000 х г в течение 15 мин.
  3. Соберите супернатант 125 мкл и перенесите его в другую трубку центрифуги. Добавьте 160 мкл изопропанола, хорошо перемешайте и постойте на RT в течение 10 минут.
  4. Центрифуга при 12 000 х г в течение 10 мин.
  5. Удалите супернатант, добавьте 75% этанола в осажденный и центрифугировать при 7 500 х г в течение 5 мин.
  6. После сушки на RT добавьте 40 мкл воды, обработанной DEPC, для растворения. Для qPCR реверсивная транскрибирование 2 мкг общей РНК с помощью набора обратной транскрипции в соответствии с протоколом производителя.
  7. Выполняйте RT-qPCR с помощью коммерческого комплекта по протоколу производителя.
  8. Нормализовать экспрессию генов относительно неиндуцированных стволовых клеток и определить вариацию складок после нормализации до GAPDH.

7. Иммунофлуоресцентная валидация дифференцировки

  1. Подготовьте 1 буфер для промывки PBST, добавив в PBS 0,1% Tween-20.
  2. Аспирировать среду из адгезивных клеток и ненадолго промыть PBS в RT на шейкере.
  3. Аспират PBS и инкубировать клетки с 500 мкл ледяного метанола на скважину 24-скважинной пластины для фиксации клеток при -20 °C в течение ночи.
  4. Удалите метанол и промывайте клетки 3 раза PBS на шейкере в течение 10 мин каждый раз при RT.
  5. Блокируют клетки с 500 мкл 5% BSA, приготовленные в PBS в течение 1-2 ч при RT на шейкере.
  6. Развести первичные антитела в 1:200 в том же растворе, который используется для блокировки.
  7. Инкубируют фиксированные клетки в растворе первичного антитела 300 мкл в течение ночи при 4 °C на шейкере.
  8. После ночной инкубации промыть клетки 3 раза ПБСТ в течение 10 мин каждый раз при РТ на шейкере.
  9. Готовят раствор вторичных антител в блокирующем растворе в 1:1000.
  10. Инкубировать в 300 мкл раствора вторичного антитела, защищенного от света в течение 1 ч при РТ на шейкере.
  11. Аспират раствора вторичных антител и промывки клеток 3 раза ПБСТ в течение 10 мин каждый раз при РТ на шейкере.
  12. Инкубировать клетки с 300 мкл 1 мкг/мл DAPI в течение 3-5 мин, а затем дважды промыть ПБСТ.
  13. После аспирации PBST добавьте соответствующее количество PBS для съемки под флуоресцентным микроскопом.

8. Анализ вестерн-блот

  1. Подготовьте 1-кратный буфер промывки TBST, добавив 0,1% Tween-20 в физиологический раствор с трис-буферной буферизацией (TBS).
  2. Подготовьте буфер электрофореза SDS-PAGE и буфер западной передачи с помощью коммерческого комплекта в соответствии с протоколом производителя.
  3. Растворяют общий клеточный белок (40 мкг) на 10% полиакриламидном геле додецилсульфата натрия и запускают в буфере электрофореза SDS-PAGE при постоянном токе 15 мА в течение примерно 2 ч.
  4. Перенесите гель на мембрану поливинилидендифторида (PVDF) при постоянном токе 300 мА в течение 2 ч при низкой температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время работы и время передачи могут варьироваться в зависимости от используемого оборудования, а также типа и процента геля.
  5. Блокируют мембрану с 3% BSA, приготовленным в TBST в течение 1 ч при RT на шейкере.
  6. Инкубировать в растворе первичных антител (разведение 1:1000) в течение ночи при 4 °C на шейкере.
  7. После ночной инкубации промыть промокательную мембрану 3 раза ТБСТ в течение 15 мин в раз при РТ на шейкере.
  8. Инкубировать во вторичном растворе антител (разведение 1:2000) в течение 2 ч при РТ на шейкере.
  9. Откажитесь от раствора вторичных антител и промыть мембрану 3 раза с TBST, в течение 15 мин каждый раз, в RT на шейкере.
  10. Визуализируйте иммунореактивные полосы с помощью хемилюминесцентного реагента с последующей ауторадиографией. Используйте β-актин в качестве элемента управления нагрузкой.

9. Поглощение индоцианина зеленым

  1. Приготовьте 200 мг/мл индоцианина зеленого раствора в ДМСО.
  2. Готовят рабочий раствор, дополняя среду дифференцировки III стадии зеленым раствором индоцианина до конечной концентрации 1 мг/мл.
  3. Инкубировать в инкубаторе 37 °C, 5% CO2 в течение 1-2 ч.
  4. Аспирировать среду и промыть клетки 3 раза PBS.
  5. Фотография под микроскопом.

10. Периодическое окрашивание кислотой Шиффа (PAS) и окрашивание гематоксилин-эозин (H&E)

  1. Аспирировать среду из адгезивных клеток и ненадолго промыть дважды PBS.
  2. Для фиксации клеток аспирируют PBS и инкубируют клетки ледяным метанолом при -20 °C в течение ночи.
  3. Визуализируйте хранение гликогена путем окрашивания PAS и наблюдайте за бинуклеированными клетками путем окрашивания H & E с помощью комплекта, следуя инструкциям производителя.
  4. Снимайте снимки с помощью флуоресцентного микроскопа.

11. Анализ деятельности CYP

  1. Измерьте активность CYP450 с помощью коммерчески доступных клеточных анализов (P450-Glo Assays) в соответствии с инструкциями производителя.
  2. Используйте три независимых повтора для тестирования. Данные представляются в виде среднего ± УР.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Принципиальная схема индукции ГЛК от гЭСК и репрезентативные изображения яркого поля каждой ступени дифференциации показаны на рисунке 1. На стадии I активин А и CHIR99021 добавляли в течение 3 дней, чтобы индуцировать стволовые клетки к образованию клеток эндодермы. На стадии II клетки эндодермы дифференцировались в печеночные клетки-прогениторы после обработки дифференцировочной средой в течение 5 дней. На стадии III ранние гепатоциты созревали и дифференцировались в HLC через 10 дней в HG...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем пошаговый метод, который индуцирует HLC из hESCs в три этапа. На первом этапе Activin A и CHIR99021 использовались для дифференциации hESCs в DE. На втором этапе KO-DMEM и DMSO использовали для дифференцировки DE в печеночные клетки-прогениторы. На третьем этапе HZM плюс HGF, OSM и гидрокортизон 21-гемисукцинатная натриевая соль использовались для продолжения дифференцировки печеночных клеток-прогениторов в HLC.

При использовании протокола необходимо учитывать следующие к...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (No 81870432 и 81570567 X.L.Z.), (No 81571994 P.N.S.); Фонд естественных наук провинции Гуандун, Китай (No 2020A1515010054 для P.N.S.), Фонд Университета Ли Ка Шин Шаньтоу (No. L1111 2008 в P.N.S.). Мы хотели бы поблагодарить профессора Стэнли Лина из Медицинского колледжа Университета Шаньтоу за полезные советы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-меркаптоэтанолSigmaM7522Для дифференцировки печеночных предшественников
488 меченый козий против мышей IgGZSGB-BIOZF-0512Для ИФ, второе антитело
488 меченое козье против кролика IgGZSGB-BIOZF-0516Для ИФ, второе антитело
АккутазыСтволовые клеточные технологии7920Для прохождения клеток
Активин АpeproTech120-14EДля окончательного формирования энтодермы
Anti - Albumin (ALB)Sigma-AldrichA6684For IF и WB, первичное антитело
Anti - Human Oct4AbcamAb19587For IF, первичное антитело
Anti - α-Fetoprotein (AFP)Sigma-AldrichA8452For IF и WB, первичное антитело
Anti -SOX17Abcamab224637Для IF, первичного антитела
против гепатоцитарного ядерного фактора 4 альфа (HNF4α)Sigma-AldrichSAB1412164Для IF, первичного антитела
B-27 SupplementGibco17504-044Для окончательного формирования эндодермы
BSABeyotimeST023-200gДля блокирования клеток
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046Для окончательного формирования эндодермы
DAPIBeyotimeC1006Для ядерного окрашивания
DEPC-водаBeyotimeR0021Для растворения РНК
DM3189MCEHY-12071Для окончательного формирования эндодермы
DMEM/F12Gibco11320-033Для клеточной культуры
DMSOSigma-AldrichD5879Для дифференцировки печеночных предшественников
DPBSGibco14190-144Для клеточной культуры
GlutaMAXGibco35050-061Для дифференцировки печеночных предшественников
H& Набор для окрашивания EBeyotimeC0105Sдля H& E окрашивание
Гепатоцитарный фактор роста (HGF)peproTech100-39Для дифференцировки гепатоцитов
HepatoZYME-SFM (HZM)Gibco17705-021Для дифференцировки гепатоцитов
Hydrocortisoone-21-hemisuccinateSigma-AldrichH4881Для дифференцировки гепатоцитов
IndocyanineSangon BiotechA606326Для окрашивания индоцианином
Knock Out DMEMGibco10829-018Для дифференцировки печеночных предшественников
Knock Out SR Multi-SpeciesGibcoA31815-02Для дифференцировки печеночных предшественников
Matrigel hESC-qualifiedCorning354277Для клеточной культуры
MEM NeAAGibco11140-050Для дифференцировки печеночных предшественников
mTesR 5X ДобавкаТехнологии стволовых клеток85852Для клеточных культур
mTesR Базальная средаТехнологии стволовых клеток85851Для клеточных культур
Онкостатин (OSM)peproTech300-10Для дифференцировки гепатоцитов
P450 - CYP3A4 (Люциферин - PFBE)PromegaV8901Для активности CYP450
Набор для окрашивания PAS SolarbioG1281Для окрашивания PAS
Pen/StrepGibco15140-122Для дифференцировки
клеток Пероксидаза-конъюгированный козий антимышиный IgGZSGB-BIOZB-2305Для WB,второе антитело
Первичный буфер для разведения антител для  Western BlotBeyotimeP0256Для разведения первичных антител
ReverTraAce qPCR RT KitTOYOBOFSQ-101Для синтеза кДНК
RNAiso PlusTaKaRa9109Для выделения РНК
RPMI 1640Gibco11875093Для окончательного формирования эндодермы
Обезжиренное молокоSangon BiotechA600669Для получения второго антитела
SYBR Green Master MixThermo Fisher ScientificA25742Для анализа ОТ-ПЦР
Torin2MCEHY-13002Для окончательного формирования эндодермы
TweenSigma-AldrichWXBB7485VДля приготовления промывочного буфера

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).
  2. Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19. Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).
  3. Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B. Antidepressants- and antipsychotics-induced hepatotoxicity. Archives of Toxicology. , (2021).
  4. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  5. Li, Z., et al. Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Cell Death & Disease. 10, 763(2019).
  6. Rassouli, H., et al. Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems. Cell Journal. 21, 290-299 (2019).
  7. Loh, K. M., et al. Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
  8. Mukherjee, S., et al. Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network. Elife. 9, (2020).
  9. Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
  10. Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).
  11. Gomez, G. A., et al. Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation. Developmental Biology. 449, 99-106 (2019).
  12. Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells. Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).
  13. Matsuno, K., et al. Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells. Differentiation. 92, 281-290 (2016).
  14. Mathapati, S., et al. Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).
  15. Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).
  16. Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).
  17. Yu, J. S., et al. PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation. Nature Communications. 6, 7212(2015).
  18. Borowiak, M., et al. Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).
  19. Tahamtani, Y., et al. Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm. Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).
  20. Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).
  21. Sullivan, G. J., et al. Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 329-335 (2010).
  22. Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
  23. Li, S., et al. Derivation and applications of human hepatocyte-like cells. World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).
  24. Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
  25. Kim, D. E., et al. Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells. Toxicology. 387, 1-9 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Hepatocyte Like CellsHuman Embryonic Stem CellsDirected DifferentiationDefinitive EndodermHepatic Progenitor CellsActivin ACHIR99021Stagewise DifferentiationCYP3A4 ActivityDisease Modeling

Похожие статьи