Методическая статья

Сбор тканей и извлечение РНК из остеоартритного коленного сустава человека

6.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62718

⸱

22 июля 2021 г.

 ,  ,  , 
1Bone and Joint Center, Henry Ford Health System, 2Department of Orthopedic Surgery, Henry Ford Health System, 3Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University

В этой статье

Краткое содержание

Первичные ткани, полученные от пациентов после тотальной эндопротезирования коленного сустава, обеспечивают экспериментальную модель для исследования остеоартрита с максимальной клинической переводимостью. Этот протокол описывает, как идентифицировать, обрабатывать и изолировать РНК из семи уникальных тканей коленного сустава для поддержки механистического исследования остеоартрита человека.

Аннотация

Остеоартрит (ОА) является хроническим и дегенеративным заболеванием суставов, чаще всего поражающим коленное. Поскольку в настоящее время нет лечения, тотальная эндопротезирование коленного сустава (ТКА) является распространенным хирургическим вмешательством. Эксперименты с использованием первичных тканей ОА человека, полученных из ТКА, дают возможность исследовать механизмы заболевания ex vivo. В то время как ранее считалось, что ОА влияет в основном на хрящ, теперь известно, что он влияет на несколько тканей в суставе. Этот протокол описывает отбор пациента, обработку образцов, гомогенизацию тканей, экстракцию РНК и контроль качества (на основе чистоты, целостности и выхода РНК) из каждой из семи уникальных тканей для поддержки исследования механизма заболевания в коленном суставе. С информированного согласия образцы были получены от пациентов, перенесших ТКА для ОА. Ткани рассекались, промывались и хранились в течение 4 ч после операции путем мгновенного замораживания для фиксации РНК или формалина для гистологии. Собранные ткани включали суставной хрящ, субхондральную кость, мениск, инфрапателларную жировую прокладку, передовую крестообразную связку, синовиальную часть и косую мышцу vastus medialis. Протоколы экстракции РНК были протестированы для каждого типа ткани. Наиболее значительная модификация включала метод распада, используемый для низкоклеточных, высокоматричных, твердых тканей (рассматриваемых как хрящ, кость и мениск) по сравнению с относительно высококлеточными, низкоматриксными, мягкими тканями (рассматриваемыми как жировая подушка, связка, синовий и мышца). Было обнаружено, что измельчение подходит для твердых тканей, а гомогенизация подходит для мягких тканей. Наблюдалась склонность некоторых субъектов давать более высокие значения целостности РНК (RIN), чем у других субъектов, последовательно в нескольких тканях, предполагая, что основные факторы, такие как тяжесть заболевания, могут влиять на качество РНК. Способность выделять высококачественную РНК из первичных тканей ОА человека обеспечивает физиологически релевантную модель для сложных экспериментов по экспрессии генов, включая секвенирование, которые могут привести к клиническим выводам, которые легче транслируются пациентам.

Введение

Колено является самым большим синовиальным суставом в организме человека, состоящим из большеберцового бедренного сустава между большеберцовой и бедренной голенями и надколенника между коленной чашечкой и бедреннойкостью 1. Кости в колене выстрены суставным хрящом и поддерживаются различными соединительными тканями, включая мениски, жир, связки и мышцы, а синовиальная мембрана инкапсулирует весь сустав для создания заполненной синовиальной жидкостью полости1,2,3 (рисунок 1). Здоровое колено функционирует как подвижное шарнирное соединение, которое позволяет беспрепятственно передергиваться в лобной плоскости1,3. При патологических состояниях движение может стать ограниченным и болезненным. Наиболее распространенным дегенеративным заболеванием коленного сустава является остеоартрит (ОА)4. Известно, что различные факторы риска предрасполагают к развитию ОА, включая пожилой возраст, ожирение, женский пол, травму суставов и генетику, среди прочих5,6. В настоящее время, по оценкам, в США с симптоматическим ОА коленного сустава насчитывается 14 миллионов человек, причем распространенность увеличивается из-за роста возраста населения и показателей ожирения7,8. Первоначально считавшийся заболеванием хряща, ОА теперь понимается как заболевание всего сустава9. Обычно наблюдаемые патологические изменения при ОА включают эрозию суставного хряща, образование остеофита, утолщение субхондральной кости и воспаление синовиальнойчасти 9,10. Поскольку не существует известного лечения ОА, лечение в основном сосредоточено на лечении симптомов (например, боли)11,12,и как только ОА прогрессирует до конечной стадии, операция по замене сустава часто указывается13.

Операции по замене сустава могут быть частичной или полной заменой коленного сустава, с полной артропластикой коленного сустава (TKA), включая замену всего тибиофеморального сочленения и пателлофеморального сустава. По состоянию на 2020 год в США ежегодно выполняется около 1 миллиона ТКА14. Во время TKA хирург-ортопед резецирует верхнюю часть плато большеберцовой кости и нижние мыщелки бедренной кости(рисунок 2A,2B),которые должны быть установлены протезными имплантатами. Иногда неправильно интерпретируемые пациентами, в ТКА только 8-10 мм резецируется с конца каждой кости, которая впоследствии укупоривается или всплывается металлом. Вставной полиэтиленовый вкладыш образует несущую поверхность (т.е. прокладку) между двумя металлическими имплантатами. Кроме того, несколько компонентов мягких тканей сустава полностью или частично иссякают для достижения правильного баланса сустава. К числу этих тканей относятся медиал и латеральные мениски(рисунок 2С),инфрапателлярная жироваяподушка (рисунок 2D),передняя крестообразная связка (ПКС; Рисунок 2E),синовиум(Рисунок 2F)и vastus medialis косая мышца (VMO; Рисунок 2G) 15. Хотя ТКА, как правило, успешны для лечения ОА, около 20% пациентов сообщают о повторном возникновении боли после операции16. Наряду с высокой стоимостью и относительной инвазивностью процедуры, эти ограничения указывают на необходимость дальнейших исследований для выявления альтернативных методов лечения для смягчения прогрессирования ОА.

Для изучения механизмов заболевания при ОА, которые могут представлять новые возможности для терапевтического вмешательства, могут быть использованы экспериментальные системы, включая клетки, тканевые экспланты и животные модели. Клетки обычно культивируются в монослое и получают из первичных тканей человека или животных (например, хондроцитов, выделенных из хряща) или увековеченных клеток (например, ATDC517 и CHON-00118). Хотя клетки могут быть полезны для манипулирования экспериментальными переменными в контролируемой среде культуры, они не захватывают условия естественного сустава, которые, как известно, влияют на фенотипы клеток19. Чтобы лучше резюмировать сложный каскад химической, механической и межклеточной коммуникации, лежащей в основе ОА, альтернатива найдена в первичных образцах тканей человека или животных, независимо от того, используются ли они в свежем или культивируемом ex vivo в качестве эксплантов, для сохранения структуры ткани и микроокружения клеток20. Для изучения сустава in vivoтакже полезны маленькие (например, мышь21)и большие (например, лошадь22)животные модели для ОА (например, посредством хирургической индукции, генетического изменения или старения). Однако перевод от этих моделей к заболеваниям человека может быть ограничен анатомическими, физиологическими и метаболическими различиями, среди прочих23. Учитывая преимущества и недостатки экспериментальных систем, ключевые сильные стороны видовой специфики и поддержания внеклеточной ниши, предлагаемой первичными тканями ОА человека, максимизируют трансляционный потенциал результатов исследований.

Первичные ткани ОА человека могут быть легко получены после ТКА, что делает высокую частоту ТКА ценным ресурсом для исследований. Среди потенциальных экспериментальных применений — экспрессия генов и гистологический анализ. Чтобы реализовать потенциал первичных тканей ОА человека для этих исследовательских подходов и других, изложены следующие ключевые соображения. Во-первых, использование образцов пациентов подлежит этическому регулированию, и протоколы должны соответствовать утверждениям Институционального наблюдательного совета (IRB)24. Во-вторых, присущая человеку гетерогенность первичных пораженных тканей и влияние таких переменных, как возраст и пол, среди прочего, создают необходимость тщательного отбора пациентов (т.е. применения критериев приемлемости) и интерпретации данных. В-третьих, уникальные биологические свойства различных тканей в суставе (например, низкая клеточность хряща и мениска25)могут представлять проблемы во время экспериментов (например, выделение высокого качества и количества РНК). В этом отчете рассматриваются эти соображения и представлен протокол для отбора пациентов, обработки образцов, гомогенизации тканей, экстракции РНК и контроля качества (т.е. оценки чистоты и целостности РНК; Рисунок 3) поощрять использование первичных тканей ОА человека в исследовательском сообществе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол исследования был одобрен и следовал институциональным руководящим принципам, установленным Советом по институциональному обзору системы здравоохранения Генри Форда (IRB #13995).

1. Подбор пациента

  1. Определите пациентов из числа тех, кто должен пройти TKA с хирургом-ортопедом.
  2. Отбирайте пациентов на основе критериев приемлемости, определенных протоколом исследования. Примеры критериев включения включают в себя возраст 18 лет или старше и наличие подтвержденного диагноза остеоартрита коленного сустава. Примеры критериев исключения включают частичную замену коленного сустава или наличие подтвержденного диагноза ревматоидного артрита.
  3. Свяжитесь с пациентами, чтобы получить информированное согласие до операции.

2. Обработка образцов (для РНК)

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте всю обработку тканей в шкафу биобезопасности класса II и следуйте стерильным методам. Всегда надевайте соответствующие СИЗ (нитриловые перчатки, лабораторное пальто, защитные очки) при обработке образцов человека. Во время TKA образуется несколько фрагментов кости, большое количество кости / хряща потенциально будет доступно для рассечения. Из-за прогрессирования заболевания дегенерация суставного хряща может быть более серьезной на некоторых участках кости, что может быть учтено в экспериментальном дизайне. Только ткани, которые требуют электрокоагрекции для резекции, имеют тепловое повреждение края, и предпринимаются согласованные хирургические усилия для получения большинства тканей скальпелем, чтобы свести к минимуму повреждение. Резекционные ткани должны быть гидратированы в любое время с стерильным PBS.

  1. Дезинфицируйте все рабочие поверхности и оборудование 70% этанолом, обеззараживающенным РНКазой, водой, обработанной DEPC, и снова 70% этанолом. Протрите остаточную жидкость чистыми, безворсовые ткани. Щипцы, костянки и скальпели либо автоклавируют, либо вымачивают в 70% этаноле в течение не менее 10 минут перед использованием. Держите оборудование погруженным в 70% этанол, когда он не используется в непосредственной близости.
  2. Предварительно маркировать по меньшей мере три криовиала с деидентифицированным названием образца и номером аликвоты для каждой ткани (например, Хрящ 1 ТКА-1).
    1. Определите каждый тип ткани из образца на основе различий в размере, форме, цвете и текстуре, как показано и описано на рисунке 2. Определите хрящ(стрелка на рисунке 2A), кость (стрелкана рисунке 2B), мениск(рисунок 2C),подфрапателляжную жировую подушку(рисунок 2D),переднюю крестообразную связку(рисунок 2E),синовий(рисунок 2F)и косую мышцу vastus medialis(рисунок 2G).
  3. Выделяют суставной хрящ.
    1. Выберите участок кости с минимальной деградацией хряща.
    2. Используя скальпель No 10, прорежьте глубину хряща как можно дальше, чтобы рассечь всю толщину хрящевого слоя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скальпель No 10 проникает только в хрящ, а не в кость.
    3. Используя полную толщину хряща, рассекли три кубика по 5 мм.
  4. Выделяют субхондральную кость.
    1. Используйте тот же участок кости, из которого был собран хрящ.
    2. Используя скальпель No 10, соскоблите оставшиеся хрящи и остаточные ткани с поверхности кости.
    3. Держите костную часть, чтобы разрезать щипцами, и используйте костянки, чтобы разрезать три кубика по 5 мм.
  5. Изолируют мениск.
    1. Определите относительно неповрежденный участок медиаального или бокового мениска.
    2. Используя скальпель No10 и щипцы, рассекают три кубика по 5 мм.
  6. Выделяют инфрапателларную жировую подушку.
    1. Используя скальпель No 10 и щипцы, разрежьте желтую часть ткани на три одинаковые по размеру и однородные части (~ 500 мг каждая).
  7. Выделяют переднюю крестообразную связку (ACL).
    1. Используя скальпель No10 и щипцы, рассекают три кубика по 5 мм.
  8. Выделяют синовиум.
    1. Используя скальпель No10 и щипцы, максимально изолируйте розовую клеточную часть мембраны, соскоблив жировую ткань.
    2. Рассекте три равные по размеру и однородные порции (~200 мг каждая).
  9. Выделяют косую мышцу vastus medialis (VMO).
    1. Используя скальпель No 10 и щипцы, удалите из образца любую жировую ткань, оставив только красную мышечную ткань.
    2. Рассекте три кубика по 5 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начальный размер ткани ограничивает размер порций.
  10. Промойте части ткани стерильным PBS, чтобы удалить остатки или мусор.
  11. Чтобы выполнить гистологию, зафиксируйте каждый участок ткани, как описано в части 3.
  12. Чтобы выполнить экстракцию РНК, разрежьте каждую из трех частей ткани на более мелкие кусочки (~ 1-2 мм   кубиков).
    1. Переложите более мелкие кусочки в криовиальный, плотно закрепленный колпачок объемом 2 мл, заморозьте вспышкой, погружая в жидкий азот на 30 с, а затем переложите в морозильную камеру с температурой -80 °C для длительного хранения (до 4 месяцев, протестированных в текущем протоколе). Повторите это для всех аликвот всех тканей.
    2. Продолжить гомогенизацию тканей, как описано в Части 4.

3. Обработка образцов (для гистологии)

ВНИМАНИЕ: Формалин является опасным химическим веществом, используется только в химическом вытяжном вытяжке.

  1. Заполните предварительно маркированные конические пробирки 15 мл 10% раствором формалина.
  2. С помощью щипцов перенесите участок ткани в заполненные формалином трубки.
  3. Зафиксируйте ткани в формалине в течение 1 недели при комнатной температуре, встряхивая/перемешивая, если это возможно.
  4. Через 1 неделю выбрасывают формалин в надлежащую утилизацию химических отходов, промывают ткани PBS, а затем переносят в свежую коническую трубку объемом 15 мл, содержащую 70% этанола, для длительного хранения при 4 °C до тех пор, пока образцы не будут внедрены для секционирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Только для костей/хрящей выполните декальциацию следующим образом.
  5. Через 1 неделю выбрасывайте формалин в надлежащую утилизацию химических отходов и промывайте ткани PBS.
  6. Переложить ткань в коническую трубку 50 мл с 45 мл 10% раствора ЭДТА (рН 7,4).
  7. Если встряхивание/перемешивание невозможно, переворачивают трубки 10-15 раз в день.
  8. Выбрасывайте и заменяйте раствор ЭДТА один раз в неделю.
    1. Два раза в неделю проверяйте текстуру с помощью инструмента (т. Е. Шпателя) или пальца в перчатке, чтобы подтвердить декальценцию, наблюдая деформацию при давлении. Время, необходимое для декальциации костной ткани, будет варьироваться между образцами от 4 до 6 недель.
  9. После декальцинирования промойте ткань PBS и переложите в свежую коническую трубку объемом 15 мл, содержащую 70% этанола, для длительного хранения при 4 °C до тех пор, пока образцы не будут внедрены для секционирования.

4. Гомогенизация тканей

ВНИМАНИЕ: В протоколе используется опасный химический фенол. Работа с фенолом должна выполняться в химическом вытяжном вытяжке.

ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно очистите все оборудование и поверхности, которые будут использоваться с 70% этанолом (замочите не менее 10 минут), затем обеззараживайте РНКазой (замочите не менее 10 минут), промойте водой, обработанной DEPC, протрите чистым бумажным полотенцем без ворса, а затем повторно распылите или замочите 70% этанолом.

  1. Гомогенизация твердых тканей (суставной хрящ, субхондральная кость, мениск)
    1. Перед гомогенизацией охладите ступку, пестик и шпатель, используя жидкий азот. Они должны храниться как можно холоднее, чтобы предотвратить оттаивания образцов.
    2. Обрабатывайте образцы по одному, сохраняя остальные образцы при -80 °C до тех пор, пока они не будут использованы.
    3. Перенесите образец ткани в раствор с помощью охлажденного шпателя; налейте дополнительный жидкий азот поверх ткани и дайте ей испариться. Раздавите ткань с помощью пестикла. Многократно добавляйте больше жидкого азота в образец ткани, дайте ему испариться, а затем продолжайте измельчение с пестиком, чтобы получить мелкий порошок.
    4. После порошкообразной ткани как можно больше переложить в предварительно охлажденный микроцентрифужный пробирку 1,5 мл.
      1. Предварительно охлаждают трубки путем погружения в жидкий азот на 30 с перед переносом ткани.
    5. Добавьте 1 мл раствора кислоты-гуанидиний-фенола в каждый пробирку и держите его на льду.
    6. Повторите шаги 4.1.3-4.1.5 для каждого образца твердой ткани.
    7. После каждой ткани очистите раствор, пестик и шпатель 70% этанолом, обеззараживателем РНКазы, водой, обработанной DEPC, и дополнительным замачинием в 70% этаноле. Протрите любую остаточную жидкость чистой, безворсовой тканью.
    8. Инкубировать образцы на льду еще 20 минут.
  2. Гомогенизация мягких тканей (инфрапателляжная жировая прокладка, ACL, синовиальная, VMO)
    1. Дезинфицируйте гомогенизатор с помощью прогона из 70% этанола, обеззараживающего РНКазы, воды, обработанной DEPC, и дополнительной промывки 70% этанола, каждая в течение 30 с. Протрите любую остаточную жидкость чистой, безворсовой тканью. Повторите это между каждым примером.
    2. Предварительно маркировать 5 мл круглых донных трубок для каждого образца. Добавьте 1 мл раствора кислоты-гуанидиний-фенола в каждую пробирку.
      1. Работайте с одним образцом за раз, сохраняя другие образцы для обработки при -80 °C до использования.
    3. Переложите ткань в предварительно маркированную пробирку 5 мл с кислотой-гуанидиниум-фенолом.
    4. Гомогенизируют ткани в импульсах 30 с, удерживая на льду во время и между импульсами. Повторяйте до тех пор, пока ткань не растворится визуально или максимум пять импульсов по 30 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые фиброзные ткани (т.е. мышцы) могут не полностью гомогенизироваться.
    5. Инкубируют растворенные ткани на льду и переходят к следующему образцу.
      1. Очистите гомогенизатор, как описано на этапе 4.2.1. Следите за тем, чтобы куски тканей не оставались в зубах зонда; при необходимости удалить стерильными щипцами.
    6. После гомогенизации всех образцов инкубируют на льду в кислоте-гуанидиниум-феноле еще 20 мин.
    7. Перенесите образцы из трубок с круглым дном в предварительно маркированные и предварительно охлажденные микроцентрифужные трубки 1,5 мл.

5. Извлечение РНК из тканей

ВНИМАНИЕ: В этом протоколе используются опасные химические вещества, такие как фенол, хлороформ и изопропанол. Выполняйте всю работу в химическом вытяжном вытяжке.

ПРИМЕЧАНИЕ: Оборудование и реагенты зарезервированы только для работы с РНК и должны иметь надлежащий химический класс для молекулярных применений (т.е. стерильные, без нуклеаз). Этот протокол является преемником протоколов гомогенизации тканей в частях 4.1 и 4.2. Тщательно очистите все оборудование и поверхности, которые будут использоваться с 70% этанолом (замочите не менее 10 минут), а затем обеззаражительным средством РНКазы (замочите не менее 10 минут). Смойте водой, обработанной DEPC, протрите остаточную жидкость чистым бумажным полотенцем без ворса, а затем распылить или замочить 70% этанолом.

  1. Центрифугировать микроцентрифужные трубки при 10000 х г в течение 10 мин при 4 °C для гранулирования мусора.
  2. Перенесите супернатант в свежую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для жировых тканей липидный слой иногда будет присутствовать сверху. Избегайте переноса этого, прокалывая слой на боковой стороне трубки наконечником пипетки.
  3. Добавьте 200 мкл хлороформа на 1 мл раствора кислоты-гуанидиний-фенола к каждому образцу. Энергично встряхните трубки вручную в течение 30 с, чтобы перемешать. Затем высиживают на льду в течение 2 мин.
  4. Центрифужные образцы при 10000 х г в течение 12 мин при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования образуются три слоя: водный, содержащий РНК, белая интерфаза ДНК и фаза розового белка внизу.
  5. Перенесите ~500 мкл верхней водной фазы в свежую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не нарушайте межфазную и белковую фракции. Храните эти фазы при -80 °C для будущего выделения ДНК или белка.
  6. Добавьте равный объем раствора кислоты-гуанидиний-фенола в перенесенную водный фазу, перемешайте путем переворачивания трубки 8-10 раз. Высиживать трубку на льду в течение 20 мин.
  7. Добавьте 200 мкл хлороформа на 1 мл раствора кислоты-гуанидиний-фенола к каждому образцу. Энергично встряхните вручную в течение 30 с, чтобы перемешать, а затем инкубировать на льду в течение 2 минут.
  8. Центрифужные образцы при 10000 х г в течение 12 мин при 4 °C.
  9. Перенесите <500 мкл водной фазы в свежую микроцентрифужную трубку, стараясь не загрязнить образец другими фазами.
    ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: Откажитесь от остальных этапов с использованием соответствующих методов удаления опасных материалов.
  10. Добавьте равный объем (в виде водной фазы) 100% изопропанола в каждый образец. Перемешать, перевернутый тюбик 8-10 раз. Насиживать на льду в течение 5 мин.
    1. Добавьте 1 мкл копреципитатора гликогена к каждому образцу, чтобы помочь в обнаружении гранул РНК после центрифугирования.
  11. Центрифугировать образцы при 12000 х г в течение 25 мин при 4 °C.
  12. Распоставь гранулу в пробирке (если использовать копреципитант, она будет выглядеть синей). Осторожно вылейте супернатант.
  13. Промыть гранулу, добавив 1 мл ледяного 75% этанола к каждому образцу, вихрь, чтобы выбить гранулу со дна трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте 75% этанола, используя чистый этанол молекулярного класса и воду без нуклеазы.
  14. Центрифуга при 7000 х г в течение 5 мин при 4 °C. Осторожно вылейте супернатант.
  15. Повторите шаги 5.13 и 5.14 еще два раза.
  16. Быстрое отжим (<2000 х г в течение 5 с) для приведения любой остаточной жидкости на дно трубки. Используйте пипетку P20, чтобы удалить любой остаточный этанол из нижней части трубок.
    1. Избегайте прикосновения к грануле РНК наконечником пипетки. Меняйте подсказки между образцами.
  17. С открытыми крышками трубок, сухие на воздухе образцы при комнатной температуре в течение 10 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы могут стать полупрозрачными по мере высыхания. Обеспечение того, чтобы весь остаточный этанол испарился, улучшит чистоту РНК.
  18. Добавьте 25 мкл воды без нуклеазы в каждую трубку, чтобы растворить гранулу.
  19. Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин.
  20. Аккуратно пипетку вверх и вниз, чтобы смешать РНК.
  21. Аликвота 5 мкл образца в свежую пробирку для анализа контроля качества(Часть 6). Хранить оставшиеся 20 мкл при -80 °C для анализа экспрессии генов.

6. Контроль качества

  1. Определить концентрацию и чистоту РНК можно с помощью спектрофотометра согласно инструкции производителя.
  2. Определить целостность РНК с помощью устройства электрофореза согласно инструкции производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавляем РНК, чтобы она была в пределах диапазона пределов обнаружения чипа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Семь уникальных тканей коленного сустава человека доступны для сбора у пациентов, проходящих TKA для ОА(рисунок 1). В этом протоколе каждая из этих тканей была идентифицирована и обработана в течение 4 ч после хирургического удаления(рисунок 2). Следуя шагам, описанным на рисунке 3,части каждой ткани были закреплены формалином для гистологической оценки(рисунок 4),в то время как другие части были заморо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Представленный протокол оказался успешным для сбора семи первичных тканей ОА человека для экстракции РНК(таблица 1)и гистологической обработки(рисунок 4). Перед сбором образцов пациента необходимо установить протокол, одобренный IRB, в идеале в сотрудничестве с хирургом или хирургической командой. Применение стандартизированного протокола для сбора образцов (например, резекция из последовательных мест in situ) имеет важное значение для максимизации экспериментальной...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Авторы благодарят участников исследования, которые сделали это исследование возможным, и посвящают этот отчет новым ученым в области остеоартрита.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 млEppendorf05 402Стерильные, без нуклеаз. Зарезервировано только для работы с РНК.
10% формалинCardinal HealthC4320-101Хранить в химическом шкафу, когда он не используется.
100% хлороформ (класс молекулярной биологии)НаучныйICN19400290Fisher стерильный, не содержит нуклеаз. Предназначен только для работы с РНК, хранить в химическом шкафу, когда он не используется.
100% этанол (класс молекулярной биологии)Fisher ScientificBP2818500стерильный, без нуклеаз. Зарезервировано только для работы с РНК, при разбавлении используйте воду без DEPC/нуклеазы.
100% изопропанол (класс молекулярной биологии)Fisher ScientificAC327272500стерильный, не содержит нуклеаз. Предназначен только для работы с РНК, хранить в химическом шкафу, когда он не используется.
100% реагент спиртCardinal HealthC4305разбавлен до 70% dH2O в целях очистки.
15 см стерильные чашки для культурыThermo Scientific12-556-003Стерильные, без нуклеаз.
15 мл полипропиленовые (Falcon) пробиркиFisher Scientific14 959 53AСтерильные, без нуклеаз.
2 мл криовиальных аппаратов (с наружной резьбой)Fisher Scientific10 500 26Стерильный, без нуклеаз.
5 мл трубок с круглым дномCorning352052стерильные, без нуклеаз. Зарезервировано только для работы с РНК.
50 мл полипропиленовые (Falcon) пробиркиFisher Scientific12 565 271Стерильные, без нуклеаз.
БиоанализаторAgilentG2939BAДля измерения целостности РНК.
Шкаф биобезопасностиОбщее лабораторное оборудование
КосторезыFisher Scientific08 990Стерилизованный 70% EtOH.
Химический вытяжной шкафОбщее лабораторное оборудование
Одноразовые скальпели (No10)Thermo Scientific3120032Стерильный, без нуклеаз.
ЭДТАЛайф Технолоджис15-576-02810% раствор с dH2O.
Щипцылюбого производителястерилизованы 70% EtOH.
Гликосиний копреципитантFisher ScientificAM9516Зарезервирован только для работы с РНК, хранить при температуре -20 °C.
KimwipesFisher Scientific06-666
Жидкий азотЛюбой поставщик
Жидкий азот ДьюарОбщее лабораторное оборудование
Ступка и пестикЛюбой поставщикЗарезервировано только для работы с РНК, стерилизовано по протоколу.
Нанокапельный спектрофотометрThermo ScientificND-2000Для измерения чистоты и выхода РНК.
Вода без нуклеазы/обработанная DEPCFisher ScientificSterile, без нуклеаз. Зарезервировано только для работы с РНК.
PBS (Стерильный)Gibco20 012 050Стерильный, без нуклеаз.
Пипетки (2 & микро; L, 20 и микро; L, 200 & микро; L, 1000 & микро; L) & СоветыЛюбой поставщикСтерильный, без нуклеаз.
Набор микроРНК для плазмы/сывороткиQiagen217204
Охлаждаемая центрифуга 5810REppendorf22625101
RNAlaterThermo Scientific50 197 8158Стерильная, без нуклеаз.
RNAse Away/RNAseZapFisher Scientific
7002
Шпатель (полумикроразмер)Любой поставщикЗарезервировано только для работы с РНК.
Тканевый гомогенизаторPro Scientific01-01200Зарезервирован только для работы с РНК, стерилизован по протоколу.
Реагент тризолаFisher Scientific15 596 026Стерильный, без нуклеаз. Зарезервировано только для работы с РНК.

Ссылки

  1. Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , StatPearls. Treasure Island, FL. (2020).
  2. Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 75 (3), 237-248 (2005).
  3. Gupton, M., Munjal, A., Terreberry, R. R. Anatomy, Hinge Joints. , StatPearls. Treasure Island, FL. (2020).
  4. Chen, D., et al. Osteoarthritis: Toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044(2017).
  5. Murphy, L., et al. Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis. Arthritis & Rheumatism. 59 (9), 1207-1213 (2008).
  6. O'Neill, T. W., McCabe, P. S., McBeth, J. Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis. Best Practice & Research: Clinical Anaesthesiology. 32 (2), 312-326 (2018).
  7. Nguyen, U. S., et al. Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis: survey and cohort data. Annals of Internal Medicine. 155 (11), 725-732 (2011).
  8. Deshpande, B. R., et al. Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity. Arthritis Care & Research. 68 (12), 1743-1750 (2016).
  9. Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).
  10. McGonagle, D., Tan, A. L., Carey, J., Benjamin, M. The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders. Journal of Anatomy. 216 (3), 279-291 (2010).
  11. Bannuru, R. R., et al. OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 27 (11), 1578-1589 (2019).
  12. Kolasinski, S. L., et al. American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and knee. Arthritis Care & Research. 72 (2), 220-233 (2020).
  13. Michael, J. W., Schluter-Brust, K. U., Eysel, P. The epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment of osteoarthritis of the knee. Deutsches Ärzteblatt International. 107 (9), 152-162 (2010).
  14. Singh, J. A., Yu, S., Chen, L., Cleveland, J. D. Rates of total joint replacement in the United States: Future projections to 2020-2040 using the national inpatient sample. Journal of Rheumatology. 46 (9), 1134-1140 (2019).
  15. Gemayel, A. C., Varacallo, M. Total Knee Replacement Techniques. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2020).
  16. Shan, L., Shan, B., Suzuki, A., Nouh, F., Saxena, A. Intermediate and long-term quality of life after total knee replacement: a systematic review and meta-analysis. Journal of Bone and Joint Surgery (American Volume). 97 (2), 156-168 (2015).
  17. Newton, P. T., et al. Chondrogenic Atdc5 cells: an optimised model for rapid and physiological matrix mineralisation. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1187-1193 (2012).
  18. Chuang, Y. W., et al. Lysophosphatidic acid enhanced the angiogenic capability of human chondrocytes by regulating Gi/Nf-Kb-dependent angiogenic factor expression. PLoS One. 9 (5), 95180(2014).
  19. Johnson, C. I., Argyle, D. J., Clements, D. N. In vitro models for the study of osteoarthritis. Veterinary Journal. 209, 40-49 (2016).
  20. Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature Protocols. 4 (2), 256-269 (2009).
  21. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (dmm) model of osteoarthritis in the 129/Svev mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  22. McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis. Bone & Joint Research. 1 (11), 297-309 (2012).
  23. Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. Models of Osteoarthritis: The good, the bad and the promising. Osteoarthritis Cartilage. 27 (2), 230-239 (2019).
  24. Goldenberg, A. J., et al. IRB practices and policies regarding the secondary research use of biospecimens. Bmc Medical Ethics. 16, 32(2015).
  25. Ruettger, A., Neumann, S., Wiederanders, B., Huber, R. Comparison of different methods for preparation and characterization of total rna from cartilage samples to uncover osteoarthritis in vivo. BMC Research Notes. 3, 7(2010).
  26. Anatomy & Physiology, Connexions. OpenStax College. , Available from: http://cnx.org/content/col11496/1.6/ (2021).
  27. Reno, C., Marchuk, L., Sciore, P., Frank, C. B., Hart, D. A. Rapid isolation of total RNA from small samples of hypocellular, dense connective tissues. BioTechniques. 22 (6), 1082-1086 (1997).
  28. Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function. Sports Health. 4 (4), 340-351 (2012).
  29. Carballo, C. B., Nakagawa, Y., Sekiya, I., Rodeo, S. A. Basic science of articular cartilage. Clinics in Sports Medicine. 36 (3), 413-425 (2017).
  30. Le Bleu, H. K., et al. Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage. Analytical Biochemistry. 518, 134-138 (2017).
  31. Ali, S. A., Alman, B. RNA extraction from human articular cartilage by chondrocyte isolation. Analytical Biochemistry. 429 (1), 39-41 (2012).
  32. Schroeder, A., et al. The Rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to rna measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3(2006).
  33. Li, S., et al. Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the abrf next-generation sequencing study. Nature Biotechnology. 32 (9), 915-925 (2014).
  34. Nazarov, P. V., et al. RNA sequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results for alternative splicing in patient derived samples. BMC Genomics. 18 (1), 443(2017).
  35. Madissoon, E., et al. scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation. Genome Biology. 21 (1), (2019).
  36. Scholes, A. N., Lewis, J. A. Comparison of RNA isolation methods on RNA-seq: implications for differential expression and meta-analyses. BMC Genomics. 21 (1), 249(2020).
  37. Smith, M. D. The normal synovium. Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).
  38. Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. RNA sequencing and analysis. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11), 951-969 (2015).
  39. Mobasheri, A., Kapoor, M., Ali, S. A., Lang, A., Madry, H. The future of deep phenotyping in osteoarthritis: how can high throughput omics technologies advance our understanding of the cellular and molecular taxonomy of the disease. Osteoarthritis and Cartilage Open. 3 (2), 100144(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи