Здесь мы предоставляем подробную процедуру крупномасштабного производства векторов AAV исследовательского класса с использованием адгезивных клеток HEK 293, выращенных в клеточных стеках, и аффинной хроматографической очистки. Этот протокол последовательно дает >1 x 1013 векторных геномов / мл, обеспечивая векторные количества, подходящие для исследований на крупных животных.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Производство аденоассоциированных вирусных векторов в клеточных стеках для доклинических исследований на крупных животных моделях
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Векторы аденоассоциированного вируса (AAV) являются одними из наиболее клинически продвинутых векторов генной терапии, причем три генные терапии AAV одобрены для людей. Клиническое продвижение новых приложений для AAV включает переход от моделей мелких животных, таких как мыши, к более крупным животным моделям, включая собак, овец и нечеловеческих приматов. Одним из ограничений введения AAV более крупным животным является потребность в больших количествах вируса с высоким титром. В то время как культура суспензионных клеток является масштабируемым методом для производства векторов AAV, немногие исследовательские лаборатории имеют оборудование (например, биореакторы) или знают, как производить AAV таким образом. Кроме того, титры AAV часто значительно ниже при производстве в клетках суспензии HEK 293 по сравнению с адгезивными клетками HEK293. Здесь описан способ получения больших количеств высокотитерных AAV с использованием клеточных стеков. Также описан подробный протокол титрования AAV, а также методы проверки чистоты векторов. Наконец, представлены репрезентативные результаты экспрессии трансгенов, опосредованной AAV, в модели овец. Этот оптимизированный протокол для крупномасштабного производства векторов AAV в адгезивных клетках позволит лабораториям молекулярной биологии продвигать тестирование своих новых методов AAV-терапии на более крупных животных моделях.
Введение
Генная терапия с использованием векторов аденоассоциированного вируса (AAV) добилась огромных успехов за последние три десятилетия1,2. Продемонстрированные улучшения в различных генетических заболеваниях, включая врожденную слепоту, гемофилию и заболевания опорно-двигательного аппарата и центральной нервной системы, вывели генную терапию AAV на передний план клинических исследований3,4. В 2012 году Европейское агентство по лекарственным средствам (EMA) одобрило Glybera, вектор AAV1, экспрессирующий липопротеинлипазу (LPL) для лечения дефицита LPL, что ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Двойная плазмидная трансфекция клеток HEK293 в клеточных стеках
- Разморозить криоканец клеток HEK293 в бисерной ванне при температуре 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно нагрейте полный DMEM до 37 ° C, пока ячейки оттаивают, чтобы гарантировать, что холодная температура не ударяет ячейки при покрытии. Убедитесь, что ячейки имеют низкое число прохода, в идеале менее 20, чтобы обеспечить оптимальный рост и эффективность трансфекции. Убедитесь, что клетки сертифицированы как не содержащие микоплазмы. - Переложите содержимое крио-флакона по каплям в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую 10 мл предварительно нагретого полного DMEM, и центрифугиру....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Перевод с моделей мелких грызунов на более крупные модели животных и возможное клиническое применение представляет собой значительную проблему из-за большого количества AAV, необходимого для передачи более крупных животных и достижения терапевтических эффектов. Чтобы сравнить эффективность трансдукции рационально разработанного капсида AAV6.2FF, ранее продемонстрированного 101-кратное увеличение эффективности трансдукции в клетках мышиных мышц по сравнению с AAV63,мышам, хомякам и ягнятам вводили .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Производство рекомбинантных векторов AAV (rAAV), описанных в этой статье, использует общие материалы, реагенты и оборудование, найденные в большинстве исследовательских лабораторий и объектов молекулярной биологии. Эта статья позволяет читателю производить высококачественные rAAV in vitro и in vivo. Прежде всего, этот протокол для производства rAAV, по сравнению с более утомительными протоколами, включающими очистку хлорида цезия, является эффективным и позволяет избежать использования ультрацентрифугир.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Сара К. Вуттон является изобретателем по патенту США US10806802B2 для капсида AAV6.2FF.
Благодарности
Амира Д. Ргей, Бренна А. Й. Стивенс, Сильвия. Томас и Джейкоб Г. Э. Йейтс были получателями стипендий для студентов ветеринарного колледжа Онтарио, а также стипендий для выпускников Онтарио. Амира Д. Ргей была удостоена премии Mitacs Accelerate Studentship. Эта работа финансировалась грантом Проекта Канадских институтов исследований в области здравоохранения (CIHR) (#66009) и грантом совместных исследовательских проектов в области здравоохранения (NSERC partnered) (#433339) для SKW.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,22 μ m фильтр | Millipore Sigma | S2GPU05RE | |
| 0,25% трипсина | Fisher Scientific | SM2001C | |
| 1-бутанол | Thermo Fisher Scientific | A399-4 | ВНИМАНИЕ. Используйте под вытяжкой с ламинарным потоком. Носите перчатки |
| 10-камерный сотовый стек | Corning | 3271 | |
| 1л бутылка PETG | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | |
| 30% Акриламид/Бис Раствор | Bio-Rad | 1610158 | |
| 96-луночная юбка | пластина FroggaBio | FS-96 | |
| Клейкая пластина уплотнитель | Thermo Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| Персульфат аммония (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | ВНИМАНИЕ. Используйте под вытяжкой с ламинарным потоком. Надевайте перчатки |
| Набор для очистки крови и тканей | Qiagen | 69506 | Используйте для очистки ДНК в разделе 4.6 протокола |
| Бромфенол синий | Fisher Scientific | B392-5 | ВНИМАНИЕ. Используйте под вытяжкой с ламинарным потоком. Носите перчатки |
| Тарелки для клеточных культур | Greiner bio-one | 7000232 | 15 см пластины |
| Культура коническая трубка | Thermo Fisher Scientific | 339650 | 15 мл коническая трубка |
| Культура коническая трубка | Fisher Scientific | 14955240 | 50 мл коническая трубка |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) с 1000 мг/л D-глюкозы, L-глутамина | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Thermo Fisher Scientific | 32209 | |
| Этанол | Greenfield | P016EA95 | Разбавить этиловый спирт (95% об.) до 20% для раздела 3.7.4 и 70% для раздела 6.1.1.1 |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30396.03 | |
| Ледяная уксусная кислота | Fisher | Scientific A38-500 | ОСТОРОЖНОСТЬ. Используйте под вытяжкой с ламинарным потоком. Носить перчатки |
| Глицерин | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Глицин | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| HBSS с Mg2+ и Ca2+ | Thermo Fisher Scientific | SH302268.02 | |
| HBSS без Mg2+ и Ca2+ | Thermo Fisher Scientific | SH30588.02 | |
| HEK293 | клетки American Tissue Culture Collection | CRL-1573 | После получения разморозьте клетки и культуру, как описано в инструкции производителя протокола. После того, как клетки прошли минимально и хорошо растут, заморозьте субфракцию на будущее в аликвотах и храните в жидком азоте. Всегда используйте ячейки ниже прохода No 30. После того, как культивируемые клетки были пассированы более 30 раз, рекомендуется возобновить посев из сохраненных аликвот |
| HEK293 белка клетки-хозяина ИФА набор | Cygnus Technologies | F650S | Follow s инструкции |
| Колонка сульфата гепарина | Cytiva Life Sciences | 17040703 | |
| Kimwipe | Thermo Fisher Scientific | KC34120 | |
| L-глутамин (200 мМ) | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | |
| Опорная подушка для центрифужной пробирки большого объема | Corning | CLS431124 | Опорная подушка должна использоваться с центрифужными пробирками большого объема, если ротор центрифуги не имеет соответствующих пробирок с V-образным дном |
| Центрифужные пробирки большого объема | Corning | CLS431123-6EA | 500 мл центрифужные пробирки |
| MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| Микроцентрифужная пробирка | Fisher Scientific | 05-408-129 | Микроцентрифужная пробирка объемом 1,5 мл, стерилизовать перед использованием |
| Молекулярная вода | Cytiva Life Sciences | SH30538,03 | |
| N-лауроилсаркозина натриевая соль | Sigma Aldrich | L5125 | ВНИМАНИЕ. Надеть перчатки |
| NaCl | Thermo Fisher Scientific | BP35810 | |
| Optimem, уменьшенная сывороточная среда | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| пипетки Пастера | Fisher | Scientific 13-678-20D | Стерилизовать перед использованием |
| PBS (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | разбавить до 1x для использования на клетках |
| Раствор пенициллин-стрептомицина | Cytiva Life Sciences | SV30010 | |
| pHelper плазмида | De novo дизайн или полученная из плазмидного хранилища | NA | |
| Бассейн Пипет | Thermo Fisher Scientific | 13-681-502 | Купить стерильные тазы для пипеток |
| Полиэтиленгликоль трет-октилфениловый эфир (Triton X-100) | Thermo Fisher Scientific | 9002-93-1 | ВНИМАНИЕ. Носить перчатки |
| Полиэтиленимин (ПЭИ) | Polyscience | 24765-1 | Следовать указаниям производителя инструкции по производству раствора объемом 1 л. 0,22μ m фильтровать и хранить при температуре 4°С; C |
| Полипропиленовая полуюбка для ПЦР Планшет | FroggaBio | WS-96 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Thermo Fisher Scientific | BP337-100 | ВНИМАНИЕ. Надевайте перчатки |
| поливинилидендифторида (PVDF) мембраны | Cytiva Life Sciences | 10600023 | Используйте щипцы для манипуляций. Надевайте перчатки. |
| Первичное антитело | Progen | 65158 | |
| Protein Ladder | FroggaBio | PM008-0500 | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
| pTrangene плазмида | De novo дизайн или получено из плазмидного репозитория | NA | Должно содержать SV40 polyA в геноме, чтобы быть совместимым с титрованием AAV в разделе 5.0 |
| Насосная трубка | Cole-Parmer | RK-96440-14 | Оптимизация длины трубки и сдерживание вируса во фракциях E1-E5 |
| RQ1 Dnase 10 Реакционный буфер | Promega | M6101 | Использование в 10-кратной концентрации в протоколе из раздела 4.0 |
| RQ1 Рназы без ДНК | Promega | M6101 | |
| Разбавитель образца | Cygnus Technologies | I700 | Необходимо приобретать отдельно для использования с набором |
| ИФА для белка клетки-хозяина HEK293Вторичное антитело, HRP | Thermo Fisher Scientific | G-21040 | |
| Сухое обезжиренное молоко | Оксоид | LP0033B | |
| додецилсульфат натрия (SDS) | Thermo Fisher Scientific | 28312 | ВНИМАНИЕ. Используйте под вытяжкой с ламинарным потоком. Надевайте перчатки |
| Гидроксид натрия (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | SS266-4 | |
| SV40 полиА праймер-зонд | IDT | Используйте последовательность в таблице X для цитаты из IDT для синтеза | |
| тетраметилэтилендиамин (TEMED) | Thermo Fisher Scientific | 15524010 | ВНИМАНИЕ. Используйте под вытяжкой с ламинарным потоком. Необходимо использовать перчатки |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 1450021 | |
| Ultra-Filter | Millipore Sigma | UFC810024 | Ultra-4 Centrifugal 10K, так как он имеет отсечку 10000 молекулярной массы |
| Универсальная нуклеаза для лизиса клеток | Thermo Fisher Scientific | 88702 | |
| Универсальная мастер-смесь для количественной ПЦР | NEB | M3003L | |
| ватман бумажный | миллипор сигма | WHA1001325 | |
| &бета;-меркаптоэтанол | Fisher Scientific | 21985023 | ОСТОРОЖНО. Используйте под вытяжкой с ламинарным потоком. Носите перчатки |
| ВНИМАНИЕ: Обратитесь к Таблице материалов для получения рекомендаций по использованию опасных химических веществ. |
Ссылки
- Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: A golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success-a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
