Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Производство аденоассоциированных вирусных векторов в клеточных стеках для доклинических исследований на крупных животных моделях

6.6K просмотров

DOI:

10.3791/62727

30 июня 2021 г.

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы предоставляем подробную процедуру крупномасштабного производства векторов AAV исследовательского класса с использованием адгезивных клеток HEK 293, выращенных в клеточных стеках, и аффинной хроматографической очистки. Этот протокол последовательно дает >1 x 1013 векторных геномов / мл, обеспечивая векторные количества, подходящие для исследований на крупных животных.

Аннотация

Векторы аденоассоциированного вируса (AAV) являются одними из наиболее клинически продвинутых векторов генной терапии, причем три генные терапии AAV одобрены для людей. Клиническое продвижение новых приложений для AAV включает переход от моделей мелких животных, таких как мыши, к более крупным животным моделям, включая собак, овец и нечеловеческих приматов. Одним из ограничений введения AAV более крупным животным является потребность в больших количествах вируса с высоким титром. В то время как культура суспензионных клеток является масштабируемым методом для производства векторов AAV, немногие исследовательские лаборатории имеют оборудование (например, биореакторы) или знают, как производить AAV таким образом. Кроме того, титры AAV часто значительно ниже при производстве в клетках суспензии HEK 293 по сравнению с адгезивными клетками HEK293. Здесь описан способ получения больших количеств высокотитерных AAV с использованием клеточных стеков. Также описан подробный протокол титрования AAV, а также методы проверки чистоты векторов. Наконец, представлены репрезентативные результаты экспрессии трансгенов, опосредованной AAV, в модели овец. Этот оптимизированный протокол для крупномасштабного производства векторов AAV в адгезивных клетках позволит лабораториям молекулярной биологии продвигать тестирование своих новых методов AAV-терапии на более крупных животных моделях.

Введение

Генная терапия с использованием векторов аденоассоциированного вируса (AAV) добилась огромных успехов за последние три десятилетия1,2. Продемонстрированные улучшения в различных генетических заболеваниях, включая врожденную слепоту, гемофилию и заболевания опорно-двигательного аппарата и центральной нервной системы, вывели генную терапию AAV на передний план клинических исследований3,4. В 2012 году Европейское агентство по лекарственным средствам (EMA) одобрило Glybera, вектор AAV1, экспрессирующий липопротеинлипазу (LPL) для лечения дефицита LPL, что ....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Двойная плазмидная трансфекция клеток HEK293 в клеточных стеках

  1. Разморозить криоканец клеток HEK293 в бисерной ванне при температуре 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно нагрейте полный DMEM до 37 ° C, пока ячейки оттаивают, чтобы гарантировать, что холодная температура не ударяет ячейки при покрытии. Убедитесь, что ячейки имеют низкое число прохода, в идеале менее 20, чтобы обеспечить оптимальный рост и эффективность трансфекции. Убедитесь, что клетки сертифицированы как не содержащие микоплазмы.
  2. Переложите содержимое крио-флакона по каплям в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую 10 мл предварительно нагретого полного DMEM, и центрифугиру....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Перевод с моделей мелких грызунов на более крупные модели животных и возможное клиническое применение представляет собой значительную проблему из-за большого количества AAV, необходимого для передачи более крупных животных и достижения терапевтических эффектов. Чтобы сравнить эффективность трансдукции рационально разработанного капсида AAV6.2FF, ранее продемонстрированного 101-кратное увеличение эффективности трансдукции в клетках мышиных мышц по сравнению с AAV63,мышам, хомякам и ягнятам вводили .......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Производство рекомбинантных векторов AAV (rAAV), описанных в этой статье, использует общие материалы, реагенты и оборудование, найденные в большинстве исследовательских лабораторий и объектов молекулярной биологии. Эта статья позволяет читателю производить высококачественные rAAV in vitro и in vivo. Прежде всего, этот протокол для производства rAAV, по сравнению с более утомительными протоколами, включающими очистку хлорида цезия, является эффективным и позволяет избежать использования ультрацентрифугир.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Сара К. Вуттон является изобретателем по патенту США US10806802B2 для капсида AAV6.2FF.

Благодарности

Амира Д. Ргей, Бренна А. Й. Стивенс, Сильвия. Томас и Джейкоб Г. Э. Йейтс были получателями стипендий для студентов ветеринарного колледжа Онтарио, а также стипендий для выпускников Онтарио. Амира Д. Ргей была удостоена премии Mitacs Accelerate Studentship. Эта работа финансировалась грантом Проекта Канадских институтов исследований в области здравоохранения (CIHR) (#66009) и грантом совместных исследовательских проектов в области здравоохранения (NSERC partnered) (#433339) для SKW.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,22 μ m фильтрMillipore SigmaS2GPU05RE
0,25% трипсинаFisher ScientificSM2001C
1-бутанолThermo Fisher ScientificA399-4ВНИМАНИЕ. Используйте под вытяжкой с ламинарным потоком. Носите перчатки
10-камерный сотовый стекCorning3271
1л бутылка PETGThermo Fisher Scientific2019-1000
30% Акриламид/Бис РастворBio-Rad1610158
96-луночная юбкапластина FroggaBioFS-96
Клейкая пластина уплотнительThermo Fisher Scientific08-408-240
Персульфат аммония (APS)Bio-Rad161-0700ВНИМАНИЕ. Используйте под вытяжкой с ламинарным потоком. Надевайте перчатки
Набор для очистки крови и тканейQiagen69506Используйте для очистки ДНК в разделе 4.6 протокола
Бромфенол синийFisher ScientificB392-5ВНИМАНИЕ. Используйте под вытяжкой с ламинарным потоком. Носите перчатки
Тарелки для клеточных культурGreiner bio-one700023215 см пластины
Культура коническая трубкаThermo Fisher Scientific33965015 мл коническая трубка
Культура коническая трубкаFisher Scientific1495524050 мл коническая трубка
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) с 1000 мг/л D-глюкозы, L-глутаминаCytiva Life SciencesSH30022.01
ECL Western Blotting SubstrateThermo Fisher Scientific32209
ЭтанолGreenfieldP016EA95Разбавить этиловый спирт (95% об.) до 20% для раздела 3.7.4 и 70% для раздела 6.1.1.1
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Thermo Fisher ScientificSH30396.03
Ледяная уксусная кислотаFisherScientific A38-500ОСТОРОЖНОСТЬ. Используйте под вытяжкой с ламинарным потоком. Носить перчатки
ГлицеринFisher ScientificBP229-1
ГлицинFisher ScientificBP381-500
HBSS с Mg2+ и Ca2+Thermo Fisher ScientificSH302268.02
HBSS без Mg2+ и Ca2+Thermo Fisher ScientificSH30588.02
HEK293клетки American Tissue Culture CollectionCRL-1573После получения разморозьте клетки и культуру, как описано в инструкции производителя протокола. После того, как клетки прошли минимально и хорошо растут, заморозьте субфракцию на будущее в аликвотах и храните в жидком азоте. Всегда используйте ячейки ниже прохода No 30. После того, как культивируемые клетки были пассированы более 30 раз, рекомендуется возобновить посев из сохраненных аликвот
HEK293 белка клетки-хозяина ИФА наборCygnus TechnologiesF650SFollow s инструкции
Колонка сульфата гепаринаCytiva Life Sciences17040703
KimwipeThermo Fisher ScientificKC34120
  L-глутамин (200 мМ)Thermo Fisher ScientificSH30034.02
Опорная подушка для центрифужной пробирки большого объемаCorningCLS431124Опорная подушка должна использоваться с центрифужными пробирками большого объема, если ротор центрифуги не имеет соответствующих пробирок с V-образным дном
Центрифужные пробирки большого объемаCorningCLS431123-6EA500 мл центрифужные пробирки
MgClThermo Fisher Scientific7791-18-6
Микроцентрифужная пробиркаFisher Scientific05-408-129Микроцентрифужная пробирка объемом 1,5 мл, стерилизовать перед использованием
Молекулярная водаCytiva Life SciencesSH30538,03
N-лауроилсаркозина натриевая сольSigma AldrichL5125ВНИМАНИЕ. Надеть перчатки
NaClThermo Fisher ScientificBP35810
Optimem, уменьшенная сывороточная средаThermo Fisher Scientific31985070
пипетки ПастераFisherScientific 13-678-20DСтерилизовать перед использованием
PBS (10x)Thermo Fisher Scientific70011044разбавить до 1x для использования на клетках
Раствор пенициллин-стрептомицинаCytiva Life SciencesSV30010
pHelper плазмидаDe novo дизайн или полученная из плазмидного хранилищаNA
Бассейн ПипетThermo Fisher Scientific13-681-502Купить стерильные тазы для пипеток
Полиэтиленгликоль трет-октилфениловый эфир (Triton X-100)Thermo Fisher Scientific9002-93-1ВНИМАНИЕ. Носить перчатки
Полиэтиленимин (ПЭИ)Polyscience24765-1Следовать указаниям производителя инструкции по производству раствора объемом 1 л. 0,22μ m фильтровать и хранить при температуре 4°С; C
Полипропиленовая полуюбка для ПЦР ПланшетFroggaBioWS-96
Polysorbate 20 (Tween 20)Thermo Fisher ScientificBP337-100ВНИМАНИЕ. Надевайте перчатки
поливинилидендифторида (PVDF) мембраныCytiva Life Sciences10600023Используйте щипцы для манипуляций. Надевайте перчатки.
Первичное антителоProgen65158
Protein LadderFroggaBioPM008-0500
Proteinase KThermo Fisher ScientificAM2546
pTrangene плазмидаDe novo дизайн или получено из плазмидного репозиторияNAДолжно содержать SV40 polyA в геноме, чтобы быть совместимым с титрованием AAV в разделе 5.0
Насосная трубкаCole-ParmerRK-96440-14Оптимизация длины трубки и сдерживание вируса во фракциях E1-E5
RQ1 Dnase 10 Реакционный буферPromegaM6101Использование в 10-кратной концентрации в протоколе из раздела 4.0
RQ1 Рназы без ДНКPromegaM6101
Разбавитель образцаCygnus TechnologiesI700Необходимо приобретать отдельно для использования с набором
ИФА для белка клетки-хозяина HEK293Вторичное антитело, HRPThermo Fisher ScientificG-21040
Сухое обезжиренное молокоОксоидLP0033B
додецилсульфат натрия (SDS)Thermo Fisher Scientific28312ВНИМАНИЕ. Используйте под вытяжкой с ламинарным потоком. Надевайте перчатки
Гидроксид натрия (NaOH)Thermo Fisher ScientificSS266-4
SV40 полиА праймер-зондIDTИспользуйте последовательность в таблице X для цитаты из IDT для синтеза
тетраметилэтилендиамин (TEMED)Thermo Fisher Scientific15524010ВНИМАНИЕ. Используйте под вытяжкой с ламинарным потоком. Необходимо использовать перчатки
Tris BaseFisher ScientificBP152-5
Trypan blueBio-Rad1450021
Ultra-FilterMillipore SigmaUFC810024Ultra-4 Centrifugal 10K, так как он имеет отсечку 10000 молекулярной массы
Универсальная нуклеаза для лизиса клетокThermo Fisher Scientific88702
Универсальная мастер-смесь для количественной ПЦРNEBM3003L
ватман бумажныймиллипор сигмаWHA1001325
&бета;-меркаптоэтанолFisher Scientific21985023ОСТОРОЖНО. Используйте под вытяжкой с ламинарным потоком. Носите перчатки
ВНИМАНИЕ:  Обратитесь к Таблице материалов для получения рекомендаций по использованию опасных химических веществ.
из

Ссылки

  1. Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: A golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success-a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
  2. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Производство векторов AAVкультивирование в клеточных стекахвысокий титр AAVадгезивные клетки HEK293очистка на гепарин-сефарозечистота вирусного вектораэкспрессия трансгенадоклиническая генная терапиятрансдукция скелетных мышц