Методическая статья

Исследование развития дендритных клеток с помощью короткого шпильки РНК-опосредованного нокдауна гена в кроветворном стволе и клеточной линии-предшественника in vitro

DOI:

10.3791/62730

⸱

7 марта 2022 г.

 ,  , 
1Graduate Institute of Immunology, National Taiwan University College of Medicine, 2Department of Pathology, Division of Microbiology and Immunology, University of Utah

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы предоставляем протокол для скрининга потенциальных факторов транскрипции, участвующих в развитии дендритных клеток (DC), с использованием лентивирусной трансдукции шРНК для получения стабильных нокдаун клеточных линий для дифференцировки dc in vitro .

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дендритные клетки (ДК) являются важными антигенпрезентирующими клетками, которые связывают врожденные и адаптивные иммунные реакции. ДК неоднородны и могут быть разделены на обычные ДК (кДК) и плазмоцитоидные ДК (пДК). cDCs специализируется на представлении антигенов и активации наивных Т-клеток. С другой стороны, pDC могут производить большое количество интерферонов типа I (IFN-I) во время вирусной инфекции. Спецификация ДК происходит на ранней стадии предшественников ДК в костном мозге (БМ) и определяется сетью факторов транскрипции (ТФ). Например, кДК высоко экспрессируют ID2, в то время как pDC высоко экспрессируют E2-2. Поскольку выявляется все больше и больше подмножеств РС, растет интерес к пониманию конкретных ТФ, контролирующих разработку ЦОД. Здесь мы устанавливаем метод скрининга ТФ, критически важных для дифференцировки ДК in vitro , путем доставки лентивируса, несущего короткую шпильку РНК (шРНК), в увековеченную линию гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (iHSPC). После селекции и дифференцировки in vitro с помощью проточной цитометрии анализируются потенциал cDC и pDC стабильных нокдаун клеточных линий. Этот подход обеспечивает платформу для идентификации генов, потенциально управляющих судьбами DC от прародителей in vitro.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

РС являются ключевыми регуляторами врожденного и адаптивного иммунитета1. РС в основном классифицируются на две функционально различные популяции, а именно pDC и cDC. Кроме того, кДК включают два подмножества, а именно кДК типа I и типа II или cDC1 и cDC2, соответственно2. pDCs, экспрессирующие BST2, Siglec-H и промежуточные уровни CD11c у мышей3,4, являются клетками, которые могут секретировать большое количество IFN-I во время воспаления и вирусной инфекции5. Благодаря своей надежной способности производить IFN-I, они также подозреваются в том, что они играют ключевую роль в прогрессировании аутоиммунных заболеваний, включая системную красную волчанку (СКВ)6. cDC1s, определяемые поверхностной экспрессией XCR1, CD8a, CLEC9A и CD103 у мышей7, специализируются на активации и поляризации цитотоксических CD8+ Т-клеток (CTL) через перекрестную презентацию антигена, тем самым инициируя иммунитет типа I в ответ на внутриклеточные патогены и рак8,9. С другой стороны, cDC2s, экспрессирующие CD11b и CD172α (также известные как Sirpα) как у людей, так и у мышей, могут активировать CD4 + Т-клетки и способствовать иммунному ответу типа II против аллергена и паразитов10, а также модулировать иммунитет типа III после распознавания внеклеточных бактерий и микробиоты11,12.

Диверсификация ДК определяется группой ТФ из гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (ГСПЦ) в БМ. Е2-2 (кодируется Tcf4) является главным регулятором дифференцировки и функции пДК13,14. Напротив, ингибитор связывания ДНК 2 (ID2) управляет спецификацией cDC и ингибирует развитие pDC путем блокирования активности белка E15. Кроме того, разработка cDC1 требует IRF8 и BATF3, в то время как дифференциация cDC2 сильно зависит от IRF416. Недавние работы исследовали гетерогенность pDC17 и cDC и их транскрипционное регулирование18. Из-за сложности сети контроллеров домена существует неудовлетворенная потребность в создании платформы для идентификации других TF, контролирующих разработку и функциональность DC.

Здесь мы использовали iHSPC, который был получен путем экспрессии эстроген-регулируемой ядерной транслокации Hoxb8 в клетках BM (также называемых клетками Hoxb8-FL)19. iHSPC могут размножаться и оставаться в недифференцированной стадии в присутствии β-эстрадиола и лиганда Flt3 (FL), тогда как они начинают дифференцироваться на различные типы DC в присутствии FL при отмене β-эстрадиола19. Основываясь на этой особенности, мы можем сбить гены, представляющие интерес на стадии прародителя, с последующим изучением влияния на дифференцировку pDC и cDC in vitro. Таким образом, этот метод является мощным инструментом для обнаружения генов, которые регулируют развитие и функцию DC.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обращение с лентивирусом осуществляется в соответствии с правилами Департамента гигиены и безопасности окружающей среды Медицинского колледжа Национального университета Тайваня.

1. Подготовка увековеченных гемопоэтических стволовых и клеточных линий-предшественников (iHSPC)

  1. Поддерживать клеточную линию iHSPC в полной среде RPMI 1640, содержащей 100 нг/мл FL и 1 мкМ β-эстрадиола.
  2. Проходят клетки в соотношении 1:10 каждые 3 дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте полную среду RPMI 1640, добавив 10% фетальную бычью сыворотку (FBS), 5 x 10-5 М β-меркаптоэтанола и 10 мкг/мл гентамицина. Рекомбинантный мышиный FL также коммерчески доступен.

2. Лентивирусная трансдукция

  1. Пластинчатые iHSPC при плотности 1 х 105 ячеек/скважина в 12-луночных пластинах в 1 мл полной среды, содержащей 100 нг/мл FL, 1 мкМ β-эстрадиола и 8 мкг/мл полибрена.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация полибрена зависит от типов клеток и обычно находится в пределах 4-8 мкг/мл.
  2. Добавьте шРНК-несущий лентивирус в каждую лунку при множественности инфекции (MOI) 100.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лентивирусным вектором является pLKO.1-Puro с маркером отбора пуромицина (рисунок 1). Целевые последовательности шРНК против LacZ, Tcf4 и Id2 соответственно перечислены в Таблице материалов. MOI определяется количеством вирионов, которые добавляются на клетку во время инфекции.
    figure-protocol-1
  3. Вращайте пластины при 1 100 х г в течение 90 мин при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Спиновое заражение осуществляется с помощью ротора поворотного ковша.
  4. Инкубировать пластину, содержащую инфицированные клетки, на ночь при 37 °C в инкубаторе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки чувствительны к полибрену, то освежите клетки полной средой без полибрена после спин-инфекции.
  5. Освежите клетки полной средой, содержащей 100 нг/мл FL и 1 мкМ β-эстрадиола через 24 ч после заражения.
  6. Добавьте 6 мкг/мл пуромицина в среду, чтобы отобрать инфицированные клетки еще через 24 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трансдуцированному лентивирусному вектору обычно требуется 48 ч для экспрессии генов, включая ген, устойчивый к пуромицину. Убедитесь, что концентрация пуромицина оптимизирована для каждой клеточной линии.
  7. Обновляйте селекционную среду, содержащую 100 нг/мл FL, 1 мкМ β-эстрадиола и 6 мкг/мл пуромицина каждые 3 дня и поддерживайте клетки в течение по меньшей мере одной недели для расширения стабильно трансдуцированных клеток iHSPC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выделение пуромицина обычно вступает в силу через 48 ч, и период отбора зависит от типов клеток.

3. Измерение эффективности нокдауна методом обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР)

  1. Экстрагируйте общую РНК из 1 x 107 shLacZ, shTcf4 и shId2 стабильных нокдаун клеток iHSPC с использованием коммерческого реагента экстракции РНК и осадите РНК из водного слоя изопропанолом с последующим промывкой осадка РНК 75% этанолом.
  2. Растворите РНК (~ 5 мкг) 5 мкл обработанного DEPC H2O и отрегулируйте концентрацию до 1 мкг/мкл.
  3. Взять 1-3 мкг РНК, смешать с обработанным DEPC H2O до конечного объема 17,4 мкл, добавить 1 мкл 1 единицы/мкл ДНКазы без РНКазы I и инкубировать в течение 20 мин при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг заключается в переваривании геномной ДНК в образцах РНК.
  4. Добавьте 1 мкл 20 мМ ЭДТА к образцам РНК, инкубируйте при 65 °C в течение 10 мин для инактивации ДНКазы I и поместите образцы РНК немедленно при 4 °C.
  5. Добавьте к образцам РНК 11,6 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкл олиго (dT) праймеров (45 мкМ), 6 мкл 5x буфера 1-й цепи, 3 мкл dNTP (2 мМ), 0,6 мкл ингибитора РНКазы (50 единиц/мкл) и 1 мкл обратной транскриптазы (200 единиц / мкл) и инкубировать при 40 °C в течение 1 ч.
  6. Остановить реакцию нагреванием при 70 °C в течение 10 мин и разбавить реакционную смесь 30 мкл H2O.
  7. Возьмите 2 мкл разбавленной реакционной смеси ОТ в качестве шаблона ДНК и ПЦР амплируйте ее с помощью праймеров против Tcf4 или Id2 (см. Таблицу 1 для термоциклерных условий).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности грунтовок включены в Таблицу материалов.

4. Дифференцировка in vitro стабильных нокдаун клеточных линий iHSPC

  1. Поддерживать стабильный одиночный нокдаун LacZ (shLacZ), Tcf4 (shTcf4) или Id2 (shId2) в iHSPC в полной среде, содержащей 100 нг/мл FL и 1 мкМ β-эстрадиола.
  2. Соберите недифференцированные iHSPC shLacZ, shTcf4 и shId2 в трубку объемом 15 мл и центрифугу в течение 5 мин при 500 х г , чтобы гранулировать клетки.
  3. Выбросьте супернатант и добавьте 10 мл PBS для промывки клеток. Повторите этот шаг дважды.
  4. Повторно суспендировать и засеять клетки iHSPC с плотностью 2 х 105 клеток/мл в 12-луночную пластину в 1 мл полной среды, содержащей только 100 нг/мл FL.
  5. Добавьте 1 мл свежей полной среды, содержащей 100 нг/мл FL через три дня.
  6. Анализ дифференцированных клеток (shLacZ, shTcf4 и shId2 iHSPCs) методом проточной цитометрии через два дня.

5. Проточный цитометрический анализ дифференцированных ДК

  1. Соберите ячейки в трубки по 1,5 мл, пипетируя ячейки вверх и вниз 2-3 раза в пластине, и центрифугу в течение 5 мин при 500 х г при комнатной температуре (RT).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дифференцированные IN VITRO DC будут слегка прикрепляться к пластинам. Бережное пипетирование поможет восстановить DC с пластин.
  2. Отбросьте супернатант и повторно суспендируйте клетки в 50 мкл буфера FACS. Затем добавляют 50 мкл супернатанта против CD16/32 гибридомы и инкубируют в течение 5-10 мин на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Fc-блокирующее антитело предотвращает неспецифическое связывание антител с Fc-рецепторами, экспрессирующимися на некоторых миелоидных клетках и В-клетках, и коммерчески доступно через различных поставщиков.
  3. Добавляйте флуоресцентные краситель-конъюгированные антитела (0,04 мкг на каждое антитело) непосредственно в клетки и инкубируйте в течение 15 мин на льду в темноте. Используются антитела APC/cy7 против мыши CD11c, FITC против мыши CD11b и PE против мыши B220.
    ПРИМЕЧАНИЕ: pDC определяются как CD11c+CD11b-B220+, а cDC определяются как CD11c+CD11b+B220-.
  4. Промывайте ячейки 1 мл буфера FACS и центрифуги в течение 5 мин при 500 х г при RT.
  5. Повторное суспендирование клеток в 100 мкл буфера FACS и анализ с помощью проточной цитометрии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Показана карта лентивирусного вектора pLKO.1-Puro (рисунок 1). После доставки лентивируса, экспрессирующего шРНК против LacZ (нецелевой контроль), Tcf4 и Id2 в iHSPC, эффективность нокдауна, подтвержденная RT-qPCR, показала, что экспрессия Tcf4 была снижена в shTcf4 iHSPC по сравнению с shLacZ iHSPC (рисунок 2A). С другой стороны, снижение экспрессии Id2 также наблюдалось в shId2 iHSPC по ср...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Векторы шРНК на основе лентивируса часто используются для глушения генов путем вирусной трансдукции в клетки и обеспечивают стабильную интеграцию в геном хозяина. Тем не менее, необходимо учитывать различную эффективность трансдукции в разных типах клеток, и для преодоления этой проблемы был принят ряд подходов.

Полибрен представляет собой поликатионный полимер, который может нейтрализовать заряды на клеточной мембране, тем самым усиливая связывание вириона с клетками во время

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарны за техническую поддержку д-ру Ц-Лин Чену. Мы благодарим Национальный основной фонд RNAi (Academia Sinica, Тайвань) за предоставление дРНК-лентивируса (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw). Эта работа была поддержана Министерством науки и технологий Тайваня (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 и MOST 109-2320-B-002-054-MY3).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Antibodies
APC/Cy7 anti-mouse CD11c AntibodyBiolegend117324(Клон: N418)
FITC anti-mouse/human CD11b AntibodyBiolegend101206(Клон: M1/70)
PE anti-mouse/human B220 Antibody Biolegend103208(Клон: RA3-6B2)
Клеточная культура
1,5 мл микропробирки  ExtraGeneTUBE-170-C
12-луночная тканевая культуральная пластинаFalcon353043
фетальная бычья сыворотка (FBS)Corning35-010-CV
RPMI 1640 mediumgibco11875-085
Reagent
β-эстрадиолSigma-AldrichE2758-250MG
β-меркаптоэтанол (β-ME)Sigma-AldrichM6250
FACS буфердомашнего приготовленияФормула: 1xPBS+0,5 %FBS+0,1%NaN3
Flt3 лиганд (FL)домашний
полибренSigma-AldrichTR-1003-G
PuromycinInvivogenant-pr-1
TRIsureBIOLINEBIO-38032
shRNA (последовательность Taregt/ID клона)Компания
shId2  (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390)Консорциум РНК-интерференции (TRC)
shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224)Консорциум РНК-интерференции (TRC)
shTcf4 (GCTGAGTGATTTATTACTGGATTT/TRCN0000012094)Консорциум РНК-интерференции (TRC)

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steinman, R. M., Witmer, M. D. Lymphoid dendritic cells are potent stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (10), 5132-5136 (1978).
  2. Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature Reviews Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
  3. Blasius, A. L., Cella, M., Maldonado, J., Takai, T., Colonna, M. Siglec-H is an IPC-specific receptor that modulates type I IFN secretion through DAP12. Blood. 107 (6), 2474-2476 (2006).
  4. Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunology Reviews. 234 (1), 142-162 (2010).
  5. Liu, Y. -J. IPC: Professional Type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annual Review of Immunology. 23 (1), 275-306 (2005).
  6. Panda, S. K., Kolbeck, R., Sanjuan, M. A. Plasmacytoid dendritic cells in autoimmunity. Current Opinion in Immunology. 44, 20-25 (2017).
  7. Durai, V., Murphy, K. M. Functions of murine dendritic cells. Immunity. 45 (4), 719-736 (2016).
  8. Mashayekhi, M., et al. CD8α(+) dendritic cells are the critical source of interleukin-12 that controls acute infection by Toxoplasma gondii tachyzoites. Immunity. 35 (2), 249-259 (2011).
  9. Anderson, D. A., Dutertre, C. -A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).
  10. Plantinga, M., et al. Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen. Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).
  11. Persson, E. K., et al. IRF4 transcription-factor-dependent CD103(+)CD11b(+) dendritic cells drive mucosal T helper 17 cell differentiation. Immunity. 38 (5), 958-969 (2013).
  12. Kumamoto, Y., et al. CD301b+ dermal dendritic cells drive T helper 2 cell-mediated immunity. Immunity. 39 (4), 733-743 (2013).
  13. Cisse, B., et al. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development. Cell. 135 (1), 37-48 (2008).
  14. Grajkowska, L. T., et al. Isoform-specific expression and feedback regulation of E protein TCF4 control dendritic cell lineage specification. Immunity. 46 (1), 65-77 (2017).
  15. Jackson, J. T., et al. Id2 expression delineates differential checkpoints in the genetic program of CD8α+ and CD103+ dendritic cell lineages. The EMBO Journal. 30 (13), 2690-2704 (2011).
  16. Suzuki, S., et al. Critical roles of interferon regulatory factor 4 in CD11bhighCD8alpha- dendritic cell development. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 101 (24), 8981-8986 (2004).
  17. Rodrigues, P. F., et al. Distinct progenitor lineages contribute to the heterogeneity of plasmacytoid dendritic cells. Nature Immunology. 19 (7), 711-722 (2018).
  18. Brown, C. C., et al. Transcriptional basis of mouse and human dendritic cell heterogeneity. Cell. 179 (4), 846-863 (2019).
  19. Redecke, V., et al. Hematopoietic progenitor cell lines with myeloid and lymphoid potential. Nature Methods. 10 (8), 795-803 (2013).
  20. Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Polybrene increases the efficiency of gene transfer by lipofection. Gene Therapy. 5 (5), 708-711 (1998).
  21. Sorgi, F. L., Bhattacharya, S., Huang, L. Protamine sulfate enhances lipid-mediated gene transfer. Gene Therapy. 4 (9), 961-968 (1997).
  22. Kirkling, M. E., et al. Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells. Cell Reports. 23 (12), 3658-3672 (2018).
  23. Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nature Reviews. Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).
  24. Wculek, S. K., Khouili, S. C., Priego, E., Heras-Murillo, I., Sancho, D. Metabolic Control of Dendritic Cell Functions: Digesting Information. Frontiers in Immunology. 10 (775), (2019).
  25. Saxton, R. A., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 168 (6), 960-976 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vitro

Похожие статьи