Мышиная модель полной внутривенной анестезии in vivo во время операции по резекции рака

Краткое содержание

В данной работе описывается метод моделирования общей внутривенной анестезии (TIVA) во время операции по резекции рака у мышей. Цель состоит в том, чтобы воспроизвести ключевые особенности доставки анестезии пациентам с раком. Метод позволяет исследовать, как анестезиологическая техника влияет на рецидив рака после операции резекции.

Аннотация

Анестезия является рутинным компонентом лечения рака, который используется для диагностических и терапевтических процедур. Метод анестезии недавно был вовлечен в воздействие на долгосрочные исходы рака, возможно, путем модуляции адренергическо-воспалительных реакций, которые влияют на поведение раковых клеток и функцию иммунных клеток. Новые данные свидетельствуют о том, что полная внутривенная анестезия на основе пропофола (TIVA) может быть полезна для долгосрочных исходов рака по сравнению с ингаляционной летучей анестезией. Однако имеющиеся клинические данные противоречивы. Доклинические исследования, которые идентифицируют основные механизмы, критически необходимы для руководства дизайном клинических исследований, которые ускорят понимание. Большинство доклинических моделей анестезии были экстраполированы из использования анестезии в исследованиях in vivo и не предназначены оптимально для изучения влияния самой анестезии в качестве первичной конечной точки. В этой статье описывается метод доставки пропофол-ТИВА анестезии в мышиной модели резекции рака молочной железы, которая воспроизводит ключевые аспекты клинической доставки у больных раком. Модель может быть использована для изучения механизмов действия анестезии на исходы рака при различных типах рака и может быть экстраполирована на другие нераковые области доклинических исследований анестезии.

Введение

Более 60% больных раком получают анестезию для хирургической резекции¹. В настоящее время нет конкретных клинических рекомендаций, определяющих выбор анестезии, используемой у онкологических больных. Опросы анестезиологов указывают на предпочтение летучей анестезии, в том числе во время онкологических операций ^2,3. Тем не менее, существует все больше доказательств того, что использование тотальной внутривенной анестезии на основе пропофола (TIVA) во время операции по лечению рака может быть связано с улучшением послеоперационных результатов (выживаемость без прогрессирования, общая выживаемость) по сравнению с летучей анестезией⁴. Последующие клинические исследования продолжают сообщать о противоречивых результатах 5,6,7,8. Эти результаты подтверждают необходимость доклинических исследований для лучшего понимания механистического воздействия различных анестетиков на исходы, связанные с раком.

Тем не менее, в исследованиях in vivo , которые моделируют хирургию рака, анестезия часто является побочной частью процедуры. Обоснование выбора анестезии часто не находится в центре внимания экспериментального проекта, и его влияние на конечные точки, связанные с раком, может не оцениваться. Например, в исследованиях in vivo , которые требуют поддержания анестезии для хирургии рака, чаще всего используется ингаляционная летучая анестезия⁹. Там, где пропофол использовался в исследованиях in vivo , он был доставлен путем одноболюсного дозирования с внутрибрюшинной доставкой, что не воспроизводит клинические онкоанестезирующие протоколы¹⁰. Такой подход к введению пропофола вызывает легкую анестезию, которая подходит для быстрых процедур. Тем не менее, это не позволяет поддерживать анестезию, которая необходима для операции резекции рака, которая может быть длительной. Кроме того, кинетика абсорбции внутрибрюшинной доставки отличается от клинических методов введения.

Модель TIVA на основе пропофола для хирургии резекции рака была разработана для удовлетворения этой потребности. Протокол для устойчивого поддержания анестезии с титрованием анестетика, чтобы обеспечить реакцию на хирургический стимул, был разработан для воспроизведения ключевых аспектов доставки анестетика пациентам, перенесшим онкологическую операцию. Полученный протокол используется с мышиной моделью рака для обеспечения TIVA во время операции по резекции рака. Оценивается влияние на краткосрочные и долгосрочные исходы, связанные с раком.

Протокол

Все исследования на животных проводились с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию в Университете Монаша. В этом исследовании использовались самки мышей Balb/c в возрасте 6-8 недель.

1. Подготовьте раковые клетки

1. Культивирование опухолевых клеток в среде. Культивирование 66cl4 клеток рака молочной железы в альфа-MEM, содержащее 10% FBS и 200 мМ глутамина. Клетки должны быть отрицательными для микоплазмы. НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: Используйте клетки, которые стабильно трансдуцированы для экспрессии люциферазы светлячка для визуализации биолюминесценции, чтобы обеспечить мониторинг рецидива рака после резекционной операции¹¹ (см. шаг 4).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная линия и среда, упомянутые выше, были использованы в этом исследовании.
2. Выращивайте клетки при 37 °C с 5% CO₂. Прохождение клеток асептически в капюшон при <80% слиянии. Используйте клетки с низким проходом в логарифмической фазе роста для достижения оптимальных результатов in vivo .
3. Поднимают адгезивные клетки 0,5 мг/мл трипсина в PBS с 10 мМ ЭДТА; 2 мл для колбы T75. При поднятии добавляют среду для инактивации трипсина и промывают клетки в PBS.
4. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Развести клетки в PBS для инъекций. Для 66cl4 клеток рака молочной железы вводят 1 х 10⁵ клеток в 20 мкл PBS на мышь.
5. Поместите клетки на лед перед инъекцией.

2. Сгенерируйте мышиную модель рака молочной железы

1. Используйте 4% изофлуран для обезболивания мыши в индукционной камере. Затем поддерживайте анестезию 2%-3% изофлураном с помощью носового конуса. Подтвердите правильную анестезию отсутствием реакции на защемление пальцев ног.
2. Подготовьте место инъекции, протерев четвертую левую область жировой подушки молочной железы с помощью одноразового спиртового тампона.
3. Стягивайте опухолевые клетки (см. шаг 1.4) в шприц Гамильтона объемом 25 мкл, прикрепленный к стерильной подкожной игле 27 г.
4. Введите клетки в четвертую левую жировую подушку молочной железы. Используйте щипцы, чтобы закрепить и подтянуть кожу. Вводят примерно в 1 мм от соска.
5. НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: Если клетки помечены люциферазой, подтвердите успешную инъекцию опухолевых клеток с помощью биолюминесцентной визуализации. Вводят 100 мкл 150 мг/кг D-люциферина в боковую хвостовую вену обезболенных мышей с помощью инсулинового шприца 0,5 мл с подкожной иглой 30 г.
6. ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Поместите мышь в систему визуализации биолюминесценции с жировой подушкой молочной железы лицом вверх. Подождите 2 мин от инъекции люциферина для оптимального поглощения люциферина тканями, затем изображение в течение 10 с.
7. Поместите мышь в чистую клетку и дайте ей восстановиться после анестезии.
8. Продолжать следить за благополучием животных в соответствии с институциональными руководящими принципами этики животных.

3. Индуцировать стабильную анестезию с внутривенной доставкой пропофола

1. Контролировать рост первичной опухоли с помощью измерения штангенциркуля и рассчитать объем опухоли по уравнению: Объем (мм³) = (длина х (ширина)² ÷ 2).
2. Выполняют операцию резекции опухоли на мышах, когда первичная опухоль достигает необходимого объема (здесь 80-90^мм3).
3. Настройте автоматизированный шприцевой насос с инсулиновым шприцем 30 г 1 мл, содержащим препарат пропофола (2% липуропрофола) (рисунок 1А).
4. Индуцируют анестезию мыши в индукционной камере с 3% севофлураном или изофлураном.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь использовался севофлуран, так как это преобладающий летучий раствор, используемый клинически.
5. Переведите мышь на грелку с температурой 37 °C на время операции. Кратковременно поддерживать анестезию 2%-3% севофлураном с помощью носового конуса.
6. Нанесите водную смазку на глаза, чтобы предотвратить пересыхание.
7. Вводят 0,05 мг/кг бупренорфина подкожно для обезболивания.
8. Чтобы подготовиться к операции, побрейте живот и подготовьте кожу к операции раствором йода-повидона. Протрите кожу спиртом или стерильной салфеткой.
9. Чтобы доставить TIVA на основе пропофола, каннулируйте боковую хвостовую вену с помощью стерильной подкожной иглы 30 г, прикрепленной к стерильному полиуретановому катетеру. Подтвердите правильное помещение путем вспышки крови в катетер (рисунок 1B). Отрегулируйте доставку севофлурана по мере необходимости во время внутривенной канюляции для поддержания стабильной глубины анестезии, демонстрируемой потерей рефлекса роговицы и педали, а частота дыхания < 100 вдохов в минуту.
10. Начинают с пропофола-ТИВЫ введением 2% пропофола в качестве начального болюса 27 мг/кг в течение более 1 мин. Прекратить прием севофлурана.
11. Продолжают инфузию пропофола с поддерживающей скоростью 2,2-4,0 мг/кг/мин для поддержания стабильной глубины анестезии в течение всего периода операции (рисунок 1С).

4. Резекция первичной опухоли

1. Сделайте прямой разрез на 1 см, уступающий опухоли в области левой четвертой жировой подушки молочной железы. Тщательно резецируйте опухоль и левый паховый лимфатический узел с помощью рассечения тупыми щипцами.
2. НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: При использовании опухолевых клеток, помеченных люциферазой, используйте биолюминесцентную визуализацию для подтверждения четких хирургических полей. Введите 150 мг/кг D-люциферина в боковую хвостовую вену, подождите 2 мин, а затем нанесите изображение в течение 60 с с помощью системы визуализации биолюминесценции. Если остаточная опухоль идентифицирована, резекция дополнительной ткани из жировой подушечки молочной железы и повторное изображение для достижения четких краев.
3. Обеспечьте гемостаз в месте операции и закройте кожу с помощью 5-0 нейлоновых швов. Убедитесь, что мех не попадает в место операции.
4. По завершении резекционной операции прекращают анестезию. Поместите мышь в чистую клетку на грелку с температурой 37 °C и дайте ей восстановиться после анестезии.
5. Контролируйте каждые 15 минут после анестезии, пока мышь не вернется к нормальной бдительности. Затем контролируйте мышь каждые 12 ч в течение 48 ч после операции.
6. Вводят 0,05 мг/кг бупренорфина подкожно каждые 12 ч в течение 48 ч после операции.
7. Через 7-10 дней снимают швы с помощью стерильных изогнутых резаков под кратковременным севофлураном или изофлурановой анестезией.

5. Отслеживание рецидива рака с помощью визуализации in vivo

1. Используйте биолюминесцентную визуализацию для отслеживания рецидива рака после операции резекции неинвазивно. Используйте систему визуализации биолюминесценции для мониторинга мышей один раз в неделю на предмет признаков первичного рецидива опухоли или отдаленного рецидива, начиная с недели после операции.
2. Индуцировать анестезию мыши в индукционной камере с 4% изофлураном. Затем переведите мышь на грелку с температурой 37 °C на время анестезии и поддерживайте анестезию 2%-4% изофлураном с помощью носового конуса.
3. Нанесите водную смазку на глаза, чтобы предотвратить пересыхание.
4. Вводят D-люциферин 150 мг/кг в боковую хвостовую вену. Подождите 2 мин, затем измерьте биолюминесценцию в течение 60 с экспозиции, чтобы обнаружить рецидив первичной опухоли или отдаленные метастазы.
5. Если первичная опухоль рецидивирует и становится пальпируемой, начните мониторинг роста опухоли с помощью измерений суппорта.
6. В конце эксперимента гуманно убивают мышей согласно утвержденному протоколу. Здесь использовался_СО2 , за которым следовал вывих шейки матки.

Результаты

Этот метод описывает модель тотальной внутривенной анестезии (TIVA) с пропофолом во время операции резекции рака у мышей. Пропофол доставляется в этой мышиной модели через внутривенный катетер с использованием шприцевого насоса (рисунок 1A, B) для воспроизведения доставки TIVA в клинических условиях анестезии для хирургии рака. Использование шприцевого насоса сводит к минимуму воздействие летучей анестезии, позволяя быстро переходить от первоначальной индукции ингаляционной ...

Обсуждение

В этом исследовании сообщается о протоколе введения тотальной внутривенной анестезии (TIVA) с пропофолом в мышиной модели рака молочной железы, которая воспроизводит ключевые аспекты клинической практики для TIVA у пациентов, нуждающихся в хирургии рака. Протокол позволяет исследовать как краткосрочные, так и долгосрочные клинически значимые исходы после операции по удалению рака на мышиной модели прогрессирования рака, включая измерение уровня цитокинов и рецидива рака (рисунок 2 и

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,9% физиологический раствор	Fresnius Kabi	AUST R 197198
Щипцы для артерий	Proscitech	TS1322-140
Бупренорфин	Temgesic	TEMG I
Хирургический коврик с подогревом	Индивидуальная	игла
для подкожных инъекций (30 г, 1 мл инсулиновый шприц)	Terumo	NN3013R
IVIS Lumina	PerkinElmer
Люциферин	Promega	P1041/2/3
Полиуретановый катетер	Intramedic	427401
Повидон Йод	Бетадин	AUST R 29562
Пропофол Липуро, 2%	Braun	3521490
Севофлуран	Бакстер	ANZ2L9117
Севофлуран Вапорайзер	Vetquip	VQ1334
Стерильная марля	Multigate Medical Products	11-600A
Хирургические ножницы	Proscitech	TS1044
Шовные материалы, 5-0 нейлон	Dynek	V504
Шприцевая помпа	Harvard Apparatus	70-4500
Шприцы (1 мл)	Terumo	SS+01T

126274