Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Быстрое, доступное и несложное производство бактериального бесклеточного лизата

4.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62753

⸱

29 октября 2021 г.

 ,  ,  , 
1Biocircuits Institute, University of California, San Diego, 2Present address, Kyoto Institute of Technology, 3Present address, Vertex Pharmaceuticals, 4Department of Bioengineering, University of California, San Diego, 5Molecular Biology Section, University of California, San Diego

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает быстрый и простой метод получения бактериального лизата для бесклеточной экспрессии генов, используя инженерный штамм кишечной палочки и требуя только стандартного лабораторного оборудования.

Аннотация

Бесклеточная экспрессия генов предлагает силу биологии без осложнений живого организма. Хотя существует много таких систем экспрессии генов, большинство из них довольно дороги в покупке и / или требуют специального оборудования и тонко отточенного опыта для эффективного производства. Этот протокол описывает способ получения бактериального бесклеточного лизата, который поддерживает высокие уровни экспрессии генов, используя только стандартное лабораторное оборудование и требуя минимальной обработки. В методе используется штамм Escherichia coli, производящий эндолизин, который не влияет на рост, но который эффективно лизирует собранную гранулу клеток после простого цикла замораживания-оттаивания. Единственной дополнительной обработкой, требуемой, является короткая инкубация с последующим центрифугированием для очистки аутолизата от клеточного мусора. Динамические генные цепи могут быть достигнуты путем гетерологичной экспрессии протеазы ClpX в клетках перед сбором. Штамм E. coli, в котором отсутствует ген lacZ, может быть использован для высокочувствительных, бесклеточных биозондирования с использованием колориметрического или флуоресцентного считывания. Весь протокол требует всего 8-9 часов, и только 1-2 часа практического труда от прививки до завершения. Сокращая стоимость и время получения бесклеточного лизата, этот метод должен повысить доступность бесклеточной экспрессии генов для различных применений.

Введение

Экспрессия генов в бесклеточных лизатах имеет ряд преимуществ по сравнению с использованием живых клеток1,2,3,4. Лизаты могут быть легко модифицированы биохимически и использованы в условиях, которые могут быть вредными или невозможными для достижения в живых клетках. Схемы экспрессии генов не должны конкурировать или конкурировать с биологическими процессами хозяина, и тестирование новых генетических схем так же просто, как добавление ДНК. По этим причинам бесклетовая экспрессия генов нашла различные применения, от биосенсоров5,6 до быстрого прототипирования синтетических генных схем7,8 и разработки искусственных клеток9. В большинстве бесклеточных экспрессий генов используются клеточные лизаты, которые были сильно обработаны, как правило, требуя длинных и сложных протоколов, специализированного оборудования и / или чувствительных шагов, которые могут привести к значительным различиям между пользователями и партиями10,11.

В данной работе описывается простой и эффективный способ получения бесклеточного лизата, требующий минимальной обработки и экспертизы(Рисунок 1А)12. Метод основан на клетках E. coli, которые спроектированы для лизирования после простого цикла замораживания-оттаивания. Клетки экспрессируют эндолизин из фаговой лямбды, который разрушает клеточную стенку. По мере роста клеток этот эндолизин остается в цитоплазме, изолированной от клеточной стенки. Однако простой цикл замораживания-оттаивания нарушает цитоплазматическую мембрану, высвобождая эндолизин в периплазму, где он разрушает клеточную стенку, что приводит к быстрому лизису клеток. Протокол может быть завершен всего несколькими часами практической работы и требует только морозильной камеры, центрифуги, способной на 30 000 × г (для достижения оптимальных результатов; более низкие скорости можно использовать с большей осторожностью, чтобы не беспокоить гранулу), вихревой смеситель и простой буферный раствор. Функциональный лизат может быть даже получен путем сублимационной сушки клеток и их регидратации in situ. Однако этот метод производит лизаты с более низкой активностью, предположительно из-за оставшегося клеточного мусора.

Лизаты очень активны для бесклеточной экспрессии генов, и они могут быть усилены различными способами в зависимости от конечного использования. Скорость синтеза белка может быть дополнительно увеличена путем концентрации лизата с использованием стандартных спиновых концентраторов. Линейная ДНК может быть защищена от деградации путем добавления очищенного белка GamS. Деградация белка, необходимая для более сложной динамики схемы, такой как колебания, может быть достигнута путем совместной экспрессии гексамера ClpX в аутолизат-продуцирующей деформации13. Наконец, визуальные показания на основе LacZ включаются с помощью автолизатной деформации, отсутствующей lacZ. В целом, этот метод производит высокоактивный бесклеточный лизат, который подходит для широкого спектра применений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовьте носители и буферы.

  1. Приготовьте 2xYTPG носитель.
    1. Смешайте 62 г порошка 2xYT, 5,99 г фосфата калия моноосновного, 13,93 г фосфата калия двухосновного и деионизированную воду до 2 л.
    2. Автоклав на жидком цикле со временем экспозиции 30 мин14.
    3. К 400 мл среды 2xYTP из 1.1.2 добавляют 7,2 г D-глюкозы (декстрозы) и перемешивают до растворения.
    4. Фильтровать-стерилизовать через фильтр 0,2 мкм.
  2. Подготовьте буфер S30A.
    1. Смешайте Tris-HCl (pH 7,7, конечная концентрация 50 мМ), глутамат калия (финал 60 мМ) и глутамат магния (конечный 14 мМ).
    2. Отрегулируйте pH до 7,7 с помощью 10 М КОН.
  3. Приготовить раствор 1 (см. табл. 1).
    1. Ресуспенд 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетансульфоновая кислота (HEPES) в 2 мл воды.
    2. Отрегулируйте pH до 8,0 с помощью KOH.
    3. Добавьте все остальные компоненты из таблицы 1.
    4. Отрегулируйте pH до 7,6 с помощью 10 M KOH. Фильтр-стерилизация.
  4. Приготовьте 2,5-кратный раствор премикса (см. таблицу 2).
    1. Смешайте все компоненты, указанные в таблице 2.
    2. Отрегулируйте pH до 7,5 с помощью KOH.
    3. Аликвот и замораживают при -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В реакции 20 мкл используется 8,9 мкл премикса.

2. Подготовьте клетки.

  1. Нанесите аутолизатные клетки на агаровые пластины LB, содержащие ампициллин 50 мкг/мл, используя инокуляторную петлю, и вырастут при 37 °C (см. Примечание 1).
  2. Соберите одну колонию в стартерную культуру LB/ampicillin medium с помощью наконечника пипетки и выращивайте при 37 °C в течение ночи.
  3. Инокулируют 400 мл среды 2xYTPG, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, 400 мкл закваски и растут при 37 °C в колбе Эрленмейера объемом 1 л, встряхивая при 300 об/мин.
  4. Периодически измеряйте оптическую плотность культуры при 600 нм (OD600)с помощью спектрофотометра для считывания оптической кюветы с длиной пути 1 см. Когда OD600 превысит 1, начните разбавлять культуру в 5 раз перед измерениями, чтобы убедиться, что измерения остаются в линейном диапазоне типичного лабораторного спектрофотометра. Продолжают выращивать клетки до тех пор, пока 5-кратная разбавленная культура не достигнет OD600 0,3 (что соответствует культуре OD600 1,5).

3. Подготовьте лизат.

  1. Готовят буфер S30A, дополненный 2 мМ дитиотрейтолом (DTT). Смешайте 3 мл буфера S30A с 6 мкл раствора DTT при 1 М. Поместите на лед для использования на этапе 3.7.
  2. Собирают клетки путем центрифугирования при 1800 × г в течение 15 мин при комнатной температуре.
  3. Выбросьте супернатант, вылив его и используя пипетку для удаления оставшейся жидкости.
  4. Повторно суспендировать гранулу в 45 мл холодного (4-10 °C) буфера S30A с помощью вихревого смесителя.
  5. Взвесьте пустую трубку центрифуги объемом 50 мл, перенесите в нее клетки и повторите шаги 3,2-3,3 для промывки клеток.
  6. Взвесьте гранулу, вычитая вес пустой трубки объемом 50 мл. Обязательно тщательно аспирируйте все оставшиеся супернатанты, чтобы обеспечить точное измерение веса гранул.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Типичный выход составляет ~1,3 г клеточной гранулы из 400 мл производственной культуры.
  7. Добавьте 2 объема холодного буфера S30A, дополненного 2 мМ дитиотрейтолом, т.е. 2 мл буфера на каждый 1 г клеточной гранулы, и повторно суспендируйте клетки путем энергичного вихревого перемешивания.
  8. Заморозьте клетки. Поместите трубку объемом 50 мл, содержащую ячейки, в морозильную камеру с температурой -20 °C или -80 °C до тех пор, пока гранула не будет тщательно заморожена.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ступень замерзания является хорошей точкой остановки в течение дня.
  9. Разморозьте ячейки на водяной бане комнатной температуры.
  10. Вихрь энергично в течение 2-3 мин.
  11. Инкубировать при 37 °C в течение 45 мин с встряхиванием при 300 об/мин.
  12. Очистите образец от тяжелого клеточного мусора путем центрифугирования в прозрачных центрифужных трубках при 30 000 × г в течение 45 мин при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если центрифуга, способная выдерживать 30 000 х г, недоступна, центрифуга в течение 45 мин при 21 000 × ги соблюдайте дополнительную осторожность на этапе 3.13, так как гранула будет менее компактной.
  13. Осторожно перенесите супернатант в новую трубку с пипеткой, максимально не нарушая гранулу. Если перенесенный супернатант загрязнен материалом из гранулы, повторите предыдущий этап.
  14. Перенесите супернатант в трубки центрифуги объемом 1,5 мл и центрифугу еще раз при 21 000 × g (или максимальной скорости настольной центрифуги) в течение 5 минут.
  15. Aliquot очищенный автолизат в желаемые объемы, тщательно избегая любых оставшихся гранул, и заморозьте при -80 °C или используйте немедленно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В одной реакции 20 мкл используется 8 мкл автолизата.

4. Бесклеточная экспрессия генов

ПРИМЕЧАНИЕ: Автолизат теперь готов к любому желаемому конечному использованию. Ниже приведен пример стандартного протокола для бесклеточной экспрессии генов.

  1. Для реакции 20 мкл смешайте на льду 8 мкл автолизата и 8,9 мкл премикса. См. ПРИМЕЧАНИЕ в конце раздела протокола относительно оптимизации концентраций глутамата магния и ПЭГ 8000.
  2. Добавьте ДНК (например, pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 до конечной концентрации 8 нМ), любые другие реагенты и воду до 20 мкл.
  3. Поместите реакцию в 384-луночную микропластину и измерьте ход флуоресценции и/или конечные точки с помощью пластинчатого считывателя. Для зеленого флуоресцентного белка (GFP) используют длину волны возбуждения 485 нм и длину волны излучения 520 нм.

5. Изменения протокола

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие модификации протокола позволяют ему обслуживать другие приложения.

  1. Бесклеточная экспрессия генов с использованием линейных шаблонов ДНК
    1. Выполняют этапы в разделе 4, дополняя реакцию 2,2 мкМ очищенным белком GamS (экспрессируемым и очищенным, как описано12)перед добавлением линейной ДНК.
  2. Бесклеточная экспрессия генов, включающая деградацию белка
    1. На шаге 2.1 используйте автолизатные клетки, содержащие плазмиду pACYC-FLAG-dN6-His (см. Таблицу материалов). Во все питательные среды дополнительно включают 34 мкг/мл хлорамфеникола.
    2. На стадии 2.3 включите 40 мкМ изопропил β-D-1-тиогалакопиранозид (IPTG) в питательную среду, чтобы индуцировать экспрессию из плазмиды.
    3. Повторите шаги 3.2-3.4 (промывка) еще два раза (в общей сложности три промывки), чтобы обеспечить полное удаление хлорамфеникола, который является ингибитором трансляции. Для первых двух промывок (этап 3.4) замените буфер S30A фосфатно-буферным физиологическим раствором (рН 7,4).
    4. На этапе 4.2 добавляли дополнительные 3 мМ АТФ (добавляли из исходного раствора 100 мМ АТФ в воде, рН 7,2) и 4,5 мМ глутамата магния (используя 1 М раствора в воде) (конечные концентрации) для компенсации высокого уровня АТФ при clpXP, а также хелатирования магния дополнительным АТФ.
  3. Бесклеточная экспрессия генов с использованием показаний на основе LacZ (включая колориметрические)
    1. На шаге 2.1 используйте автоматические ячейки, которые изначально не экспрессируют LacZ (см. Таблицу материалов).
  4. Альтернативно, готовят лизат непосредственно из лиофилизированных клеток.
    1. Выполните все шаги от 1.1 до 3.7.
    2. Смешайте 8 мкл клеточной суспензии с 8,9 мкл премикса.
    3. Добавьте плазмидную ДНК (при желании), другие пользовательские реагенты и воду, чтобы достичь конечного объема 20 мкл.
    4. Перенесите реакцию на 384-луночную микропластину и высушите ее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сублимированные образцы могут храниться до недели и, возможно, дольше.
    5. Чтобы начать реакцию, регидратируйте ее 18 мкл деионизированной воды, дополненной любой желаемой ДНК или другими реагентами.
    6. Следите за динамикой флуоресценции в проигрывателе.

ПРИМЕЧАНИЕ 1: Автолизатные ячейки предназначены для лизирования в цикле замораживания-оттаивания, поэтому особенно важно использовать криопротектор при изготовлении замороженных запасов. Мы замораживали запасы в 24% мас./об.глицерина и хранили при -80 °C.

ПРИМЕЧАНИЕ 2: Ионы магния и ПЭГ 8000 имеют решающее значение для производительности лизата. Базовый 2,5-кратный премикс, основанный на ранее опубликованных данных, содержит 6 мМ глутамата магния и 4,8% мас./об.ПЭГ 8000, которые в конечной реакции становятся 2,4 мМ и 1,9%, соответственно. Автолизат, приготовленный по протоколу здесь, обычно лучше всего работает с дополнительными 5 мМ Mg-глутаматом и 1,5% ПЭГ 8000 в конечной реакции. Однако это может быть оптимизировано в диапазоне дополнительных 0-10 мМ Mg глутамата и дополнительных 0-3% PEG 8000 (по сравнению с базовым премиксом). Для приготовления премикса с рекомендуемыми дополнительными 5 мМ Mg-глутамата и 1,5% ПЭГ 8000 (конечные концентрации) смешайте 380 мкл премикса с 4,75 мкл глутамата магния при 1 М и 36,1 мкл ПЭГ 8000 при массе/объеме 40%.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Репрезентативные результаты можно наблюдать с помощью автолизата для экспрессии GFP из конститутивно экспрессирующей плазмиды, здесь pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, и записи временного хода флуоресценции GFP в пластинчатом считывателе(рисунок 1B). Серия разбавления плазмидной ДНК обнаружила сильную экспрессию даже при 1 нМ ДНК. По сравнению с коммерчески доступным лизатом, автолизат может давать больший общий выход и достигать большей максимальной скорости производства, рассчитанной как пр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протокол, описанный здесь, дает высокоактивный бактериальный лизат для бесклеточной экспрессии генов. Ключ заключается в использовании клеток, несущих плазмиду pAD-LyseR, которая экспрессирует цитозольный цитозинов лямбда-фаг эндолизин. Эти клетки потенцируются для лизирования при пермеабилизации внутренней мембраны, что позволяет эндолизину получить доступ к клеточной стенке, что метод достигает посредством простого цикла замораживания-оттаивания. Поскольку клетки эффективно лизируются, продукт называют аутолизатом. Пос...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

J.H. является соучредителем GenCirq Inc, которая специализируется на терапии рака. Он входит в Совет директоров и имеет долю в GenCirq.

Благодарности

Авторы благодарят Закари Сан и Ричарда Мюррея (Калифорнийский технологический институт) за любезное предоставление плазмидного P_araBAD-gamS, а также Каэко Камэй (Технологический институт Киото) за любезное предоставление высокоскоростной охлаждающей центрифуги. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения и программы ARO MURI и частично поддержана Ведущей инициативой для отличных молодых исследователей, MEXT, Япония.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2xYT mediaEMD Millipore4.85008или эквивалент
3-PGASigma AldrichP8877или эквивалентный
центробежный фильтрующий блок Amicon Ultra-15, отсечка 3 кДаMillipore SigmaUFC900308опционально, может использоваться для концентрации лизата, выбрать производительность концентратора, соответствующую объему концентрируемого
ампициллинаSigma AldrichA0166-5Gили карбенициллин, более стабильный вариант
АТФSigma AldrichA8937или эквивалент
цАМФSigma AldrichA9501или эквивалент
CoASigma AldrichC4282или эквивалент
CTPUnited States Biosciences14121или эквивалент
D-глюкозы (декстрозы)Fisher ScientificAAA1749603или эквивалент
дитиотреитола (DTT)Sigma AldrichD0632-1Gили эквивалент
E. coli BL21-Gold (DE3), несущий pAD-LyseRAddgene99244
E. coli BL21-Gold (DE3) & lacZ, несущий pAD-LyseRAddgene99245
Фолиевая кислотаSigma AldrichF7878или эквивалент
GTPUnited States Biosciences16800или эквивалент
HEPESSigma AldrichH3375-25Gили эквивалент
LB средыFisher ScientificDF0446075или эквивалент
глутаматамагнияSigma Aldrich49605-250Gили эквивалент
NADSigma AldrichN6522или эквивалент
глутамата калияSigma AldrichG1501-100Gили эквивалент
гидроксида калия (KOH)Sigma Aldrich221473-25Gдля регулировки pH
двухосновного фосфатакалия Fisher ScientificBP363-500или эквивалент
фосфат калия одноосновнойFisher ScientificBP362-500или эквивалент
спермидинаSigma Aldrich85558или эквивалент
Tris-HClFisher Scientific9310500GMили эквивалент
смеси тРНКRoche10109541001или эквивалент
UTPUnited States Biosciences23160или эквивалент

Ссылки

  1. Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
  2. Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
  3. Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
  4. He, M. Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology. New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).
  5. Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  6. Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  7. Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
  8. Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free "breadboard". ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).
  9. Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027(2018).
  10. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762(2013).
  11. Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  12. Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
  13. Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. Artificial cell on a chip integrated with protein degradation. 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).
  14. Garibaldi, B., et al. Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases. Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).
  15. Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
  16. Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 0154614(2016).
  17. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8(2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Escherichia coliClpX
Быстрое, доступное и несложное производство бактериального бесклеточного лизата
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.