Методическая статья

Исследования взаимодействия шаперон-кочаперон с использованием гомогенного бисероплетения

DOI:

10.3791/62762

⸱

21 июля 2021 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience Care and Society, Division of Neurogeriatrics, Karolinska Institutet, 2Department of Pharmaceutical Engineering & Technology, Indian Institute of Technology (BHU), 3Theme Inflammation and Aging, Karolinska University Hospital

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол представляет собой метод исследования белково-белковых взаимодействий с использованием глутатион-связанных донорских шариков с GST-сплавленными TPR-мотив-ко-шаперонами и акцепторными шариками в сочетании с пептидом, полученным из Hsp90. Мы использовали этот метод для скрининга небольших молекул для нарушения взаимодействий Hsp90-FKBP51 или Hsp90-FKBP52 и идентифицировали мощные и селективные ингибиторы взаимодействия Hsp90-FKBP51.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нацеливание на взаимодействие белка теплового шока 90 (Hsp90)-кочаперона дает возможность специфически регулировать Hsp90-зависимые внутриклеточные процессы. Законсервированный пентапептид MEEVD на С-конце Hsp90 отвечает за взаимодействие с мотивом тетратрикопептидного повтора (TPR) ко-шаперонов. FK506-связывающий белок (FKBP) 51 и FKBP52 являются двумя аналогичными TPR-мотивными ко-шаперонами, участвующими в стероидных гормонозависимых заболеваниях с различными функциями. Таким образом, идентификация молекул, специфически блокирующих взаимодействия между Hsp90 и FKBP51 или FKBP52, обеспечивает многообещающий терапевтический потенциал для нескольких заболеваний человека. Здесь мы описываем протокол для усиленного люминесцентного равноконтактного однородного анализа для зондирования взаимодействий между Hsp90 и его партнерскими ко-шаперонами FKBP51 и FKBP52. Во-первых, мы очистили TPR-мотив-содержащие белки FKBP51 и FKBP52 в форме, помеченной глутатион S-трансферазой (GST). Используя глутатион-связанные донорские шарики с GST-сплавленными белками TPR-мотива и акцепторными шариками в сочетании с 10-мерным С-концевым пептидом Hsp90, мы исследовали белково-белковые взаимодействия в однородной среде. Мы использовали этот анализ для скрининга небольших молекул для нарушения взаимодействий Hsp90-FKBP51 или Hsp90-FKBP52 и идентифицировали мощные и селективные ингибиторы взаимодействия Hsp90-FKBP51.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Молекулярные шапероны способствуют гомеостазу белка, включая сворачивание белка, транспорт и деградацию. Они регулируют несколько клеточных процессов и связаны с многочисленными заболеваниями, такими как рак и нейродегенеративные заболевания1. Белок теплового шока 90 (Hsp90) является одним из наиболее важных шаперонов, функция которого зависит от конформационных изменений, вызванных гидролизом АТФ и связыванием с клиентскими белками, опосредованными его ко-шаперонами2. Несмотря на очевидный потенциал Hsp90 в качестве терапевтической мишени, тонкая настройка его функции представляет собой большую проблему. Существует несколько ингибиторов Hsp90, нацеленных на N-концевую область связывания АТФ, которые были оценены в клинических испытаниях, но ни один из них не был одобрен для маркетинга3. Из-за отсутствия четко определенного лигандсвязывающегокармана 4,нацеливание на С-концевую область Hsp90 имело ограниченный успех4. В последнее время нарушение взаимодействий Hsp90-кохаперонов малыми молекулами было исследовано в качестве альтернативной стратегии5. Нацеливание на взаимодействия Hsp90-кохаперонов не вызывает общей реакции клеточного стресса и дает возможность специфически регулировать различные внутриклеточные процессы. Законсервированный пентапептид MEEVD на С-конце Hsp90 отвечает за взаимодействие с мотивом тетратрикопептидного повтора (TPR) ко-шаперонов6. Из 736 белков, содержащих мотивы TPR, аннотированных в базе данных белков человека, ~ 20 различных белков взаимодействуют с Hsp90 через этотпептид 7. Молекулы, конкурирующие за пептидное связывание MEEVD, нарушат взаимодействие между Hsp90 и ко-шаперонами, содержащими домен TPR. Сайт связывания пептидов имеет сходную третичную структуру, но общая гомология между различными доменами мотивов TPR относительно низкая7,что дает возможность идентифицировать молекулы, специально способные блокировать взаимодействия между Hsp90 и конкретными TPR-мотивными ко-шаперонами. Среди этих TPR-мотивных ко-шаперонов FK506-связывающий белок (FKBP) 51 и FKBP52 являются регуляторами передачи сигналов рецепторов стероидных гормонов (SHR) и участвуют в нескольких стероидных гормонозависимых заболеваниях, включая рак, связанные со стрессом заболевания, метаболические заболевания и болезнь Альцгеймера8. Хотя FKBP51 и FKBP52 имеют > 80% сходства последовательностей, их функции различаются: FKBP52 является положительным регулятором деятельности SHR, в то время как FKBP51 является отрицательным регулятором в большинстве случаев8. Таким образом, идентификация молекул, специфически блокирующих взаимодействия между Hsp90 и FKBP51 или FKBP52, обеспечивает многообещающий терапевтический потенциал для связанных заболеваний.

Усыпляемый L-умингесцентный Proximity Homogenous Assay (AlphaScreen) был впервые разработан в 1994 году Ullman EF et al.9. В настоящее время он широко используется для обнаружения различных типов биологических взаимодействий, таких какпептид 10,белок11,ДНК12,РНК13и сахар14. В этой технике существует два вида бусин (диаметр 200 нм), один из них является донорской бусиной, а другой - акцепторной бусиной. Биомолекулы иммобилизуются на эти шарики; их биологические взаимодействия приводят к сближению бусин донора и акцептора. При 680 нм фотосенсибилизатор в донорской бусине освещает и преобразует кислород в синглетный кислород. Поскольку синглетный кислород имеет короткое время жизни, он может диффундировать только до 200 нм. Если шарик акцептора находится в непосредственной близости, его производное тиоксена реагирует с синглетным кислородом, генерируя хемилюминесценцию при 370 нм. Эта энергия дополнительно активирует флуорофоры в том же акцепторном шарике, чтобы излучать свет при 520-620 нм15. Если биологические взаимодействия нарушаются, акцепторная бусина и донорская бусина не могут достичь близости, что приводит к распаду синглетного кислорода и низкому образуемого сигнала.

Здесь мы описываем протокол, использующий этот метод для скрининга малых молекул, ингибируя взаимодействия между Hsp90 и TPR ко-шаперонами, особенно FKBP51 и FKBP52. 10 аминокислот длинных пептидов, соответствующих экстремальному С-конце Hsp90, прикреплены к акцепторным шарикам. Очищенные GST-помеченные ко-шапероны TPR взаимодействуют с донорскими шариками, связанными с глутатионом. Когда взаимодействие между пептидами, полученными из Hsp90, и ко-шаперонами TPR-мотива сближает шарики, образуется усиленный сигнал(рисунок 1A). Если экранированные малые молекулы могут ингибировать взаимодействия между Hsp90 и TPR-мотивными ко-шаперонами, этот усиленный сигнал будет уменьшен(рисунок 1B). Их IC50 может быть рассчитан путем количественного измерения. Этот протокол может быть распространен на любые интересующих взаимодействия шаперона - TPR-мотива и имеет большое значение в разработке новых молекул, в частности блокирующих взаимодействие между Hsp90 и FKBP51 или FKBP52.

figure-introduction-1
Рисунок 1:Основной принцип этого анализа. (A) Очищенный GST-FKBP51 взаимодействует с глутатион-связанными донорскими шариками. 10 аминокислот длинных пептидов, соответствующих экстремальному С-конце Hsp90, прикреплены к акцепторным шарикам. Взаимодействие между пептидами, полученными из Hsp90, и доменом TPR FKBP51 приближает донорские и акцепторные шарики. При 680 нм фотосенсибилизатор в донорской бусине освещает и преобразует кислород в синглетный кислород. Производное тиоксена на акцепторной бусине реагирует с синглетным кислородом и генерирует хемилюминесценцию при 370 нм. Эта энергия дополнительно активирует флуорофоры в том же акцепторном шарике, чтобы излучать свет при 520-620 нм. (B) Когда малые молекулы ингибируют взаимодействия между Hsp90 и FKBP51, донорские и акцепторные шарики не могут достичь близости. Затем синглетный кислород с коротким сроком службы распадается, и не вырабатывается обнаруживаемый сигнал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор этого протокола показан на рисунке 2.

1. Экспрессия и очистка GST-FKBP51 и GST-FKBP52(рисунок 2A)

  1. Плазмиды
    ПРИМЕЧАНИЕ: Получите клоны кДНК для человека FKBP51 (идентификатор клона: 5723416) и для человека FKBP52 (идентификатор клона: 7474554) от консорциума IMAGE.
    1. Амплифицировать ДНК человека FKBP51 с помощью ПЦР праймерами (вперед; 5'GGATCCATGACTGATGATGAAGGT-3', реверс; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3'), содержащими навесы BamHI и XhoI и клонировать в вектор pGEX6-1 на сайтах ограничения BamHI / XhoI.
    2. Амплифицировать ДНК человека FKBP52 с помощью ПЦР праймерами (вперед; 5'-GAATTCATGACAGCCGAGGAGATG-3', обратно; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3'), содержащими навесы EcoRI и XhoI, и клонировать в вектор pGEX6-2 в местах ограничения EcoRI / XhoI.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка и условия реакции ПЦР приведены в таблице 1 и таблице 2.
    3. Проверьте вставленную последовательность и преобразуйте плазмиды в химически компетентную Кишечной палочкой в соответствии с протоколом изготовления.
  2. Экспрессия и очистка белка
    1. Добавьте 25 г основы бульона Лурия (LB) в 1 л дистиллированной воды, чтобы получить раствор LB. Автоклав при 121 °C в течение 15 мин. После охлаждения добавьте 50 мкг/мл ампициллина.
    2. Возьмите колонию бактерий, экспрессивляющих GST-FKBP51 или GST-FKBP52, и смешайте с 500 мкл раствора LB в пробирке 1,5 мл. Вихрь.
    3. Добавьте смесь "1.2.2" в 1 л раствора LB в колбу Эрленмайера, покрытую алюминиевой фольгой. Высиживание колбы Эрленмейера в шейкере на ночь при 37 °C.
    4. Индуцируют экспрессию белка путем добавления 1 мМ изопропил-β-D-тиогалактозида (IPTG) в колбу Эрленмейера и продолжают инкубацию еще 2 ч.
    5. Чтобы получить гранулы клеток, центрифугируют при 5000 х г в течение 15 мин. Удалите супернатант.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы ячейки могут храниться при -20 °C.
    6. Повторно суспендировать гранулы клеток в 40 мл PBS и процедить 3 х 20 с на льду. Добавьте 1 мМ PMSF, 1 мМ ЭДТА и коктейль ингибитора протеазы (1 таблетка) для предотвращения протеолиза.
    7. Центрифугируют суспензию в течение 30 мин 50 000 х г для удаления остатков клеток и нанесите супернатант на колонку GST-ловушки 5 мл.
    8. После промывки колонны 30 мл ПБС, элюют GST-FKBP51 и GST-FKBP52 5 мл 10 мМ глутатиона в ПБС.
    9. Концентрат белков на центрифугированной установке 15 мл 10.000 MWCO. Чтобы удалить свободный глутатион, пропустите концентраты через колонну PD-10, уравновешиваемую 0,5x PBS, и снова сконцентрируйте на фильтрующем центрифуге.
    10. Собирайте белковые фракции. Проверьте белки в SDS-PAGE и отрегулируйте концентрацию белка до 1 мг/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типичный выход белка составляет 2-5 мг/л культуры. Белок может храниться при -20 °C.

2. Соединение С-концевого пептида Hsp90 с бусинами акцептора(рисунок 2B)

  1. Пептидный препарат Hsp90
    1. Синтез десяти аминокислот пептида NH 2-EDASRMEEVD-COOH, соответствующего аминокислотам 714-724 человеческой бета-изоформы Hsp90 (UniProt ID: P08238) с помощью службы синтеза пептидов.
    2. Развести пептид Hsp90 в PBS до концентрации 1 мг/мл.
  2. Приготовление акцепторных бусин
    1. Разбавляют неконъюгированные акцепторные шарики в PBS до концентрации 1 мг/мл и переносят в пробирку 1,5 мл.
    2. Выполните промывку центрифугированием при 16 000 х г в течение 15 мин. Осторожно удалите супернатант.
  3. Спряжение
    1. Установите соотношение между шариками и пептидом как 10:1. В пробирку 1,5 мл, содержащую 1 мг гранул акцепторного шарика (приготовленных так, как описано выше), добавляют 1 мл PBS (рН 7,4), 0,1 мг разбавленного пептида, 1,25 мкл Tween-20, 10 мкл раствора цианоборогидрида натрия 400 мМ (NaBH3CN).
      ВНИМАНИЕ: NaBH3CN токсичен; использовать вытяжной капюшон и перчатки. Раствор NaBH3CN должен быть свежеприготовлен.
    2. Инкубировать в течение 24 ч при 37 °C с сквозным перемешиванием (10-20 об/мин) на ротационном шейкере.
  4. Реакционная закалка и промывка бусин
    1. Добавляют 20 мкл 1 М Трис-HCl (рН 8,0) раствора в реакцию с целью блокирования непрореагиированных участков. Инкубировать в течение 1 ч при 37 °C.
    2. Центрифуга при 16 000 x g (или максимальной скорости) в течение 15 мин при 4 °C. Удалите супернатант и повторно суспендируем гранулу шарика в 1 мл раствора Tris-HCl (100 мМ, рН 8,0).
    3. Повторите шаг стирки три раза.
    4. После последней центрифугирования повторно суспендировать шарики по 1 мг/мл в буфере хранения (1 мл 0,5 × PBS с 0,01% азида натрия в качестве консерванта). Храните сопряженный раствор акцепторного шарика при 4 °C, защищенном от света.
      ВНИМАНИЕ: Азид натрия токсичен; использовать вытяжной капюшон и перчатки.

3. Анализ, прощупывающий взаимодействие между GST-FKBP51 или GST-FKBP52 и Hsp90 C-концевым пептидом и ингибирование соединениями малой молекулярной массы(рисунок 2C)

  1. Белки, помеченные GST, взаимодействующие с бусинами донора глутатиона
    1. Настройте реакции в 384-скважинных пластинах.
    2. Готовят раствор, содержащий 10 мкг/мл шариков донора глутатиона в 0,5x PBS, рН 7,4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После длительного хранения бусины оседают и должны быть вихревыми.
    3. Добавьте GST-FKBP51 или GST-FKBP52 к конечной концентрации 10 мкг/мл.
    4. Инкубировать в темноте при 25 °C в течение 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе белки, помеченные GST, будут взаимодействовать с глутатионом, прикрепленным к бусинам. Для каждой скважины будет использовано 22,5 мкл этой смеси. Концентрация связывающих партнеров должна определяться эмпирически. Титруйте GST-FKBP51 и GST-FKBP52 и выберите концентрацию, которая дает наилучший сигнал.
  2. Добавление соединений
    1. Производят серийные разведения исследуемых соединений в ДМСО.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые концентрации обычно составляют 10, 30, 100, 300, 1000 и 3000 мкМ.
    2. Добавьте 0,25 мкл DMSO (отрицательный контроль) или Hsp90 C-концевой пептид (положительный контроль, 30 мкМ) или соединений в DMSO в угол каждой скважины пластины. Используйте трипликаты для каждой концентрации соединения.
    3. Добавьте в каждую скважину 22,5 мкл раствора, содержащего донорские шарики глутатиона с белками, помеченными GST.
    4. Аккуратно встряхните тарелку рукой, но тщательно. Инкубировать в темноте при 25 °C в течение 15 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В течение этого времени соединения будут взаимодействовать с доменом TPR на сайте связывания С-концевого пептида Hsp90.
  3. Добавление бусин акцептора
    1. Разбавить бусины акцептора с присоединенным С-концевым пептидом Hsp90 до 100 мкг/мл в 0,5x PBS.
    2. Добавьте 2,25 мкл разбавленных акцепторных шариков в каждую скважину.
    3. Перемешать аккуратно, но тщательно. Инкубировать в темноте при 25 °C в течение 15 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе донорские и акцепторные шарики сблизиваются в результате белково-пептидных взаимодействий. Конечный объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Поэтому конечные концентрации соединений находятся в диапазоне от 0,1 до 30 мкМ.
  4. Чтение пластин
    ПРИМЕЧАНИЕ: Считывание пластины с помощью считывателя пластин, установленного в соответствующем режиме.
    1. Включите прибор и откройте программное обеспечение
    2. Выберите соответствующий протокол.
    3. Нажмите Редактировать карту пластины и выберите колодец, используемый в пластине для измерения.
    4. Нажмите кнопку Далее, чтобы продолжить и запустить выбранный протокол.
    5. После измерения нажмите кнопку Показать результаты, чтобы просмотреть результаты.
    6. Экспортируйте данные.

4. Анализ данных

  1. Z' коэффициент и отношение сигнал/фон (S/B)
    1. Рассчитайте Z' множим и отношение S/B для анализа, используя следующее уравнение:
      Z'=1-(3σpos+3σneg)/│μpos-μneg│16
      S/B=μneg/μpos
      где σ и μ представляют собой стандартные отклонения и средние значения положительного (Hsp90 C-концевой пептид, 30 мкМ) и отрицательного (DMSO) контрольных элементов соответственно. Коэффициент Z' > 0,5 гарантирует, что анализ достаточно надежен для скрининга. Для контроля чувствительности анализа также было рассчитано соотношение S/B.
  2. Кривая "доза-реакция" и IC 50
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте нелинейный регрессионный анализ для соответствия данным ингибиторов Hsp90-кохаперонов PPI программным обеспечением.
    1. Создайте таблицу данных XY в диалоговом окне приветствия и выберите X Numbers, а Y Enter 3 (если трипликаты) реплицирует значения в параллельных столбцах.
    2. Нормализовать сигнальные данные образцов к отрицательной контрольной группе. Импортируйте значения концентрации в столбец X и значения сигнала в столбец Y.
    3. Нажмите «Анализировать» и выберите «Преобразовать концентрацию (X)» в разделе «Преобразовать | Нормализовать. Выберите Преобразовать в логарифмы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это преобразует концентрацию в логарифмической шкале. Если начальная концентрация равна нулю, установите для нее очень маленькое число, которое фактически равно нулю (например, 0,1 нМ), чтобы не потерять эти значения, поскольку логарифм нуля не определен.
    4. Нажмите «Анализировать» и выберите «Нелинейная регрессия (соответствие кривой)» в разделе Анализ XY,откройте «Доза-Реакция-Ингибирование» и выберите «Log(ингибитор) vs. response - Переменный наклон».
    5. Нажмите кнопку ОК, чтобы просмотреть Результаты (содержащие значение IC50) и Графики.

figure-protocol-1
Рисунок 2:Схема этого протокола. (A) Экспрессия и очистка GST-FKBP51 и GST-FKBP52. (B) Соединение С-концевого пептида Hsp90 с бусинами акцептора. (C) Анализ, прощупствующий взаимодействие между GST-FKBP51 или GST-FKBP52 и Hsp90 C-концевым пептидом. Ингибирование соединениями малых молекулярных масс. Создано с помощью BioRender.com Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В нашем анализе Z'-фактор и отношение S/B составляют 0,82 и 13,35 соответственно(рисунок 3A),демонстрируя, что наш анализ является надежным и надежным для высокопроизводительного скрининга. Затем мы использовали его для скрининга соединений с малой молекулярной массой. На рисунке 3B представлено дозозависимое ингибирование взаимодействий шаперон-кохаперон с выбранной малой молекулой (D10). Кривые доза-реакция для D10 генерируются методом нелинейного регрессионно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем протокол, использующий анализ для скрининга малых молекул, ингибируя взаимодействия между Hsp90 и TPR-мотивными ко-шаперонами, особенно FKBP51 и FKBP52. Его высокий балл Z' (>0,8) демонстрирует надежность и надежность для формата с высокой пропускной способностью. Результаты могут быть получены в течение одного часа, и требуется небольшое количество шариков, белка и соединений. Более того, этот протокол может быть легко распространен на любые интересуемые взаимодействия Hsp90/Hsp70 - TPR-мотива. Нескол...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано грантами Шведского исследовательского совета (2018-02843), Фонда мозга (Fo 2019-0140), Фонда гериатрических заболеваний в Каролинском институте, Фонда Гунвора и Йозефа Анерса, Фонда Магнуса Бергваллса, Фонда Гана и Бертиля Стонеса, Фонда медицинских исследований Торе Нильссона, Фонда Маргареты аф Угглас и Фонда старых слуг.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
384-луночные планшетыPerkin Elmer6008350Объем анализа 25 мл
Amicon 10.000 MWCO ЦентрифугаторMilliporeUFC901008Концентрат белка
АмпициллинSigmaA0166Антибиотики
Шейкер бактерий Unimax 1010ХейдольфаКлоны
кДНК бактерий для человека FKBP51Источник BioScienceидентификатор клона: 5723416pCMV-SPORT6
векторные клоны кДНК для человека FKBP52Источник BioScienceидентификатор клона: 7474554вектор pCMV-SPORT6
Химически компетентный E. coliInvitrogenC602003One Shot BL21 Star (DE3)
Программное обеспечение для анализа данныхGraphPad Prism9.0.0Анализ данных и создание цифр
Программное обеспечение для анализа данныхExcelДанные анализа
DMSOSupelco1.02952.1000Разбавленные соединения
DPBSGibco14190-144Готовый раствор
EDTACalbiochem344504Предотвратить протеолиз при ультразвуковой обработке
ГлутатионSigmaG-4251Элюй Белки с тегом GST
Донорские бусины глутатионаPerkin Elmer6765300Донорские бусины
Колонка с ловушкой GSTCytiva (GE Healthcare)17528201Очистка белков с мечкой GST
Изопропил-&бета;-D-тиогалактозидThermo Fisher ScientificR0392Индуцирование экспрессии белка
LB Бульон (Miller)SigmaL3522Микробная среда
для выращивания ПЦР инструментBIO-RADS1000 Термоамплификация/ПЦР
PD-10 колонкаCytiva (GE Healthcare)17085101Обмен растворами
pGEX-6P-1 векторCytiva (GE Healthcare)28954648Плазмида
pGEX-6P-2 векторCytiva (GE Healthcare)28954650Считыватель плазмидных
пластинPerkin ElmerEnSpire 2300 Multilabel ReaderСчитывание альфа-пластины
Программное обеспечение для чтения пластинPerkin ElmerEnSpire ManagerПрограммное обеспечение для чтения пластин
Программное обеспечение для чтения пластинPerkin ElmerAlpha 384-well Малый объемИспользуйте этот протокол для чтения пластины
PMSFSigmaP7626Предотвратите протеолиз во время
коктейля ингибиторов протеазыультразвуком SigmaS8830Предотвратите протеолиз во время ультразвуковой обработки
Азид натрияSigmaS2002В качестве консерванта
Цианоборогидрид натрия (NaBH3CN)Sigma156159Активирует матрицу для сопряжения
Десять аминокислотных пептидов NH2-EDASRMEEVD-COOH, соответствующих аминокислотам 714-724 человека Hsp90 бета-изоформаПептид 2.0 incСинтез Hsp90 C-концевой пептид
Тест-Пробирка РотаторLABINCOСделать концевое перемешивание
Tris-HClSigma10708976001Блокировка непрореагировавших участков акцепторных гранул
Tween-20SigmaP1379Предотвращение агрегации гранул
Ультрацентрифуга Avanti J-20 XPBeckman CoulterЦентрифуга для получения гранул бактериальных клеток
Ультразвуковой клеточный разрушительMicrosonSonicate клетки для высвобождения белка
Неконъюгированные акцепторные бусиныPerkin Elmer6762003Acceptor бусины
XCell SureLock Mini-Cell и XCell II Blot ModuleInvitrogenEI0002SDS-PAGE
Культура

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Muchowski, P. J., Wacker, J. L. Modulation of neurodegeneration by molecular chaperones. Nature Reviews Neuroscience. 6 (1), 11-22 (2005).
  2. Eckl, J. M., Richter, K. Functions of the Hsp90 chaperone system: lifting client proteins to new heights. International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 4 (4), 157-165 (2013).
  3. Yuno, A. Clinical evaluation and biomarker profiling of Hsp90 inhibitors. Methods in Molecular Biology. 1709, 426-441 (2018).
  4. Dutta Gupta, S., Bommaka, M. K., Banerjee, A. Inhibiting protein-protein interactions of Hsp90 as a novel approach for targeting cancer. European Journal of Medicinal Chemistry. 178, 48-63 (2019).
  5. Pavlov, P. F., Hutter-Paier, B., Havas, D., Windisch, M., Winblad, B. Development of GMP-1 a molecular chaperone network modulator protecting mitochondrial function and its assessment in fly and mice models of Alzheimer's disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3464-3474 (2018).
  6. Young, J. C., Obermann, W. M., Hartl, F. U. Specific binding of tetratricopeptide repeat proteins to the C-terminal 12-kDa domain of hsp90. Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18007-18010 (1998).
  7. Scheufler, C., et al. Structure of TPR domain-peptide complexes: critical elements in the assembly of the Hsp70-Hsp90 multichaperone machine. Cell. 101 (2), 199-210 (2000).
  8. Storer, C. L., Dickey, C. A., Galigniana, M. D., Rein, T., Cox, M. B. FKBP51 and FKBP52 in signaling and disease. Trends in Endocrinology & Metabolism. 22 (12), 481-490 (2011).
  9. Ullman, E. F., et al. Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5426-5430 (1994).
  10. Wigle, T. J., et al. Screening for inhibitors of low-affinity epigenetic peptide-protein interactions: an AlphaScreen-based assay for antagonists of methyl-lysine binding proteins. Journal of Biomolecular Screening. 15 (1), 62-71 (2010).
  11. Guenat, S., et al. Homogeneous and nonradioactive high-throughput screening platform for the characterization of kinase inhibitors in cell lysates. Journal of Biomolecular Screening. 11 (8), 1015-1026 (2006).
  12. Sabatucci, A., et al. A new methodological approach for in vitro determination of the role of DNA methylation on transcription factor binding using AlphaScreen(R) analysis: Focus on CREB1 binding at hBDNF promoter IV. Journal of Neuroscience Methods. 341, 108720(2020).
  13. Mills, N. L., Shelat, A. A., Guy, R. K. Assay Optimization and Screening of RNA-Protein Interactions by AlphaScreen. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 946-955 (2007).
  14. Huang, X., et al. A competitive alphascreen assay for detection of hyaluronan. Glycobiology. 28 (3), 137-147 (2018).
  15. Roger Bosse, C. I., Chelsky, D. Principles of alphascreen amplified luinescent proximmity homogenous assay. PerkinElmer Life Sciences. , Available from: https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf (2021).
  16. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Chaperone Cochaperone InteractionsHsp90 InteractionsFKBP51 InhibitionFKBP52 InhibitionBead Based AssayHigh Throughput ScreeningProtein Protein InteractionTPR MotifSmall Molecule ScreeningIC50 Determination

Похожие статьи