Использование гипербарического кислорода для повышения радиочувствительности клеток глиомы U251 человека

Краткое содержание

Этот протокол показывает, что гипербарическая оксигенация может усиливать пролиферацию, ингибирование и апоптоз клеток глиомы U251, обработанных рентгеновским облучением, путем блокирования клеток в фазе G2/M. Это улучшает радиочувствительность клеточных линий глиомы человека.

Аннотация

Целью данного исследования было изучение использования гипербарического кислорода для повышения радиочувствительности клеток глиомы человека. Субкультивируемые клетки глиомы человека U251 были случайным образом разделены на четыре группы: необработанная контрольная группа, клетки, обработанные только гипербарическим кислородом (ГБО), клетки, обработанные только рентгеновским облучением (рентгеновским излучением), и клетки, обработанные как ГБО, так и рентгеновским излучением. В этих группах наблюдались клеточная морфология, клеточная пролиферативная активность, распределение клеточного цикла и апоптоз для оценки роли ГБО в повышении радиочувствительности клеток глиомы. С увеличением доз рентгеновского излучения (0 Гр, 2 Гр, 4 Гр, 6 Гр, 8 Гр) фракция выживаемости (СФ) клеток глиомы постепенно снижалась.

Достоверно более низкий SF наблюдался для клеток, обработанных HBO и рентгеном вместе, чем в рентгенологической группе для каждой дозы (все P < 0,05). Ингибирование пролиферации было достоверно выше в группе ГБО в сочетании с рентгенологической группой, чем в рентгенологической группе для каждой дозы (все P < 0,05) для клеточной линии U251. Процент G2/M фазовых клеток был достоверно выше в группе ГБО в сочетании с группой рентгенографии (2 Гр) (26,70% ± 2,46%) и группой ГБО (22,36% ± 0,91%), чем в контрольной группе (11,56% ± 2,01%) и группе рентгенографии (2 Гр) (10,35% ± 2,69%) (все группы P < 0,05). Апоптоз клеток U251 был достоверно выше в группе ГБО в сочетании с рентгенологией (2 Гр), чем в группе ГБО, группе рентгенографии (2 Гр) и контрольной группе (все P < 0,05). Мы пришли к выводу, что ГБО может усиливать ингибирование пролиферации и апоптоз клеток глиомы U251 путем блокирования клеток глиомы в фазе G2/M и улучшать радиочувствительность клеток глиомы U251.

Введение

Глиома является первичной внутричерепной опухолью, которая происходит из глиальных клеток центральной нервной системы¹. В настоящее время стратегия лечения глиомы заключается в хирургическом вмешательстве в сочетании с лучевой терапией и химиотерапией. Послеоперационная лучевая терапия глиомы может обеспечить преимущества в выживаемости (доказательства I степени), а ранняя послеоперационная лучевая терапия может эффективно продлить выживаемость пациента (доказательства II степени)². При глиомах высокой степени злокачественности (III или IV степени), особенно высокозлокачественной и инвазивной глиобластоме (доказательства III степени)³, послеоперационная лучевая терапия должна быть проведена как можно раньше (<6 недели). Однако, несмотря на раннее вмешательство, глиома все еще имеет высокую частоту рецидивов и плохой прогноз после комплексного лечения. Эти исходы в основном связаны с низкой радиочувствительностью глиомы. Факторы, связанные с радиочувствительностью опухоли, включают присущую опухолевым клеткам радиочувствительность, гипоксические или негипоксические опухолевые клетки, долю гипоксических опухолевых клеток и способность периопухолевой ткани восстанавливать радиационные повреждения⁴.

Среди этих факторов важное влияние на радиочувствительность опухоли оказывают гипоксические или негипоксические опухолевые клетки и доля гипоксических опухолевых клеток. Гипербарическая оксигенация (ГБО) может улучшить накопление кислорода в тканях за счет увеличения напряжения кислорода в тканях и диффузии кислорода в крови. ГБО также может оказывать ряд полезных биохимических, цитологических и физиологических эффектов⁵. Например, ГБО оказывает выраженное репаративное действие на радиационные повреждения, вызванные лучевой терапией. Несмотря на то, что ГБО в сочетании с лучевой терапией или химиотерапией повышает клиническую эффективность лучевой терапии или химиотерапии при глиоме^{6-го уровня}, ведутся значительные споры о том, как ГБО сам по себе влияет на рост злокачественной глиомы. Ding et ^al.7 и Wang et ^al.8 продемонстрировали, что HBO способствует росту глиомы in situ у мышей с помощью механизмов, которые включают ингибирование апоптоза и стимулирование ангиогенеза опухоли. Сообщается, что в физиологических условиях ГБО способствует ангиогенезу опухолей, вызывая окислительный стресс⁹.

Тем не менее, одно исследование показало, что кратковременное воздействие ГБО способствует пролиферации опухолевых клеток, в то время как длительное воздействие ГБО способствует апоптозу и ингибирует пролиферацию^. Таким образом, необходимы дальнейшие исследования, чтобы выяснить, способствует ли ГБО росту глиомы или подавляет его, и как ГБО в сочетании с лучевой терапией или химиотерапией может вызвать терапевтическую сенсибилизацию. В частности, необходимы механистические подробности о том, как ГБО улучшает радиочувствительность глиомы. Чтобы изучить, как ГБО улучшает радиочувствительность клеток глиомы U251 человека в этом исследовании, мы использовали ГБО в сочетании с рентгеновским облучением на пролиферацию клеток глиомы и наблюдали влияние на распределение клеточного цикла и апоптоз.

Протокол

Все методы исследования были одобрены Институциональным наблюдательным советом и Комитетом по этике Второй больницы, аффилированной с Университетом Ланьчжоу, и проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами.

1. Лечение клеток глиомы

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте использовалась клеточная линия глиомы U251.

1. Культура клеток U251
   1. Семена клеток U251 в нескольких чашках с DMEM, содержащим 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), и культивируют их при 37 °C с 5%_CO2.
   2. При достижении 50%-60% конфлюенции диссоциируйте клетки с помощью раствора трипсина-ЭДТА (0,25%, без фенолового красного) и затем дайте им вырасти до 80% конфлюенции.
2. Рентгеновское облучение
   1. Накройте планшеты или колбы эквивалентным тканевым компенсатором толщиной до 1 см. Затем подвергните клетки рентгеновскому облучению, подаваемому из линейного ускорителя мощностью 6 МВ с расстоянием между источником и ячейкой 100 см, регулируемым нажатием кнопки вращения на плате дистанционного управления.
   2. Попросите физика измерить дозу облучения и сделать поправку на затухание. В качестве контроля поместите колбы с фильтрующими средами в детектор перед рентгеновским облучением.
3. Гипербарическая оксигенация (ГБО)
   1. Продезинфицируйте камеру ГБО, включив ультрафиолетовое излучение на 15 минут, а затем залите ее 0,02 МПа чистого кислорода на 5 минут.
   2. После помещения клеток в планшеты или колбы с культуральными культурами в камеру нажмите на кнопку регулятора давления на плате управления снаружи камеры, чтобы увеличить давление ГБО в камере до 0,2 МПа (2,0 АТА) в течение 30 мин облучения.
   3. Через тридцать минут нажмите на кнопку регулятора давления , чтобы снизить давление HBO до прежнего уровня давления (0,1 МПпа). Затем обрабатывайте флаконы или планшеты с бактериологией ГБО 1 раз в день в течение 3 дней подряд.

2. Клетки глиомы U251 в разных группах

1. Установите контрольную группу, рентгеновскую (2 Гр) группу и ГБО в сочетании с рентгеновской (2 Гр) группой для расчета кривых роста клеток.
2. Приготовьте одноклеточные суспензии из клеток глиомы U251, показывающих максимальные темпы роста (см. шаг 1.1.2). Отрегулируйте плотность клеток до 1 × 10⁶/мл, подсчитав клетки с помощью предметного стекла гемоцитометра. Затем добавьте 1 мл клеточной суспензии в культивальный флакон (плотность клеток: 1 × 10⁶ / флакон) с тремя отдельными флаконами для каждой группы.
3. Оцените морфологию клеток при 100-кратном увеличении с помощью светлопольного микроскопа, чтобы подсчитать адгезивные клетки через 24, 48 и 72 часа культивирования.

3. Радиочувствительность клеток глиомы U251 (анализ клонообразования) в течение 30 мин после ГБО

1. Одноклеточную суспензию U251 засевать во все лунки в концентрации 5 × 10² клеток/мл в 6-луночные планшеты, а затем подвергнуть их воздействию указанной дозы рентгеновского облучения (0 Гр, 2 Гр, 4 Гр, 6 Гр и 8 Гр), исследуя три параллельных образца для каждой дозы рентгеновского излучения.
2. Для ГБО в сочетании с группой рентгеновского излучения (2 Гр) подвергнуть клетки рентгеновскому облучению в течение 30 минут после лечения ГБО. После обработки культивируют клетки при 37 °C с 5%_CO2 в течение 14 дней.
3. После того, как клоны станут видны, удалите среду и промойте клоны 2 раза PBS.
4. Зафиксируйте клетки в 1 мл 10% метанола на 15 минут перед окрашиванием 1 мл 0,1% кристаллического фиолетового на 20 минут.
5. После окрашивания промойте клетки 6 мл дистиллированной воды с помощью пипетки, а затем отсадите кристаллический фиолетовый раствор. Дайте клеткам высохнуть на воздухе.
6. Подсчитайте под микроскопом клоны диаметром от 0,3 мм до 1,0 мм, чтобы убедиться, что в одном клоне содержится >50 клеток.
7. Рассчитайте фракцию выживаемости (SF) с помощью уравнения (1):
   SF = × 100% (1)
8. Используя статистическое программное обеспечение, построить кривую доза облучения-выживаемость на основе модели множественной мишени одиночного поражения (SHMT) с помощью уравнения (2):
   S = 1 - (1 - )^N (2)
   где S = вероятность выживания; k = средняя смертельная доза (доза, вызывающая в среднем одно попадание на клетку); x = количество попаданий в ячейку; N = количество целей (количество попаданий для гибели клетки).
9. Для оценки влияния HBO на радиочувствительность клеток глиомы U251 необходимо рассчитать радиобиологические параметры, включая среднюю смертельную дозу (D₀), квазипороговую дозу (Dq), число экстраполяции (N), фракцию выживаемости при дозе облучения 2 Гр (SF₂), коэффициент усиления сенсибилизации (D₀) (SER = D₀ в контрольной группе/D₀ в опытной группе) и SER (Dq) (SER = Dq в контрольной группе/Dq в экспериментальной группе).
   где D₀ = величина, обратная наклону линейной части кривой выживаемости (доза, снижающая выживаемость на 63%)
   N = значение точки пересечения, образованное экстраполяцией линейной части на соответствие ординате (отражая способность клетки восстанавливать повреждения, вызванные радиацией)
   Dq = значение проективной точки пересечения на абсциссе и пересечения, образованного проведением линии через 1,0 по ординате и параллельно абсциссе для пересечения с линией экстраполяции.

4. Анализ подсчета клеток для оценки пролиферации клеток глиомы U251

1. Определите контрольную группу, группу ГБО и группы, получавшие рентгеновское излучение (0 Гр, 2 Гр, 4 Гр, 6 Гр, 8 Гр) отдельно или в сочетании с ГБО.
2. Отрегулируйте плотность клеток до 1 ×^{10 4} клеток/мл с помощью клеток U251 в одноклеточных суспензиях.
3. Посев клеточных суспензий (100 μл, плотность: 1 × 10³/лунка) в 96-луночные планшеты (по пять лунок в группе). Проведите анализ подсчета клеток (см. Таблицу материалов), а затем определите оптическую плотность (OD) на длине волны 450 нм с помощью считывателя микропланшетов после 48 ч культивирования реагентом.
4. Рассчитаем скорость ингибирования пролиферации клеток (IR) в соответствии с уравнением (3):
   IR = × 100% (3)

5. Выявление апоптоза клеток глиомы U251

1. Набор контрольных, ГБО, рентгеновских (2 Гр) и ГБО в сочетании с рентгеновскими (2 Гр) группами.
2. Удалите среду после посева и промойте клетки 1x PBS.
3. Отделите клетки с помощью трипсина, а затем деактивируйте трипсин путем добавления DMEM, когда под микроскопом будет наблюдаться округлая морфология клеток.
4. Переложите ячейки в центрифужную пробирку и центрифугуйте на 5 мин при давлении 200 × г.
5. Выбросьте надосадочную жидкость, добавьте 3 мл 1x PBS в гранулу и аккуратно пипеткой, чтобы восстановить суспендию клеток.
6. Снова центрифугируйте клетки при 200 × г в течение 5 минут. Затем аспирируйте надосадочную жидкость PBS и промойте клетки 2 раза, прежде чем повторно суспендировать их с помощью щадящего пипетирования в 50 мкл связывающего буфера.
7. Добавьте 5 мкл аннексина V-FITC в клетки при 4 °C и инкубируйте клетки в темноте при 4 °C в течение 15 мин перед добавлением 400 мкл связывающего буфера. Переложите смесь в проточную цитометрическую пробирку, содержащую 5 мкл раствора красителя пропидия йодида (PI) (10 мг/мл). Обнаружить апоптотические клетки через 5 мин с помощью проточной цитометрии¹¹.
8. Запишите красную флуоресценцию на волне возбуждения 488 нм, введите их в компьютер для анализа процента каждого клеточного цикла в 5000 клетках, а затем распечатайте пики апоптотических клеток.
9. Соберите красную и зеленую флуоресценцию с помощью двойной маркировки аннексина V и PI, введите их в компьютер для анализа, а затем распечатайте точечную диаграмму.

6. Определение распределения клеточного цикла глиомы U251

1. Промойте вышеупомянутые клетки 2 раза 1 мл PBS перед обработкой их трипсином.
2. Когда с помощью световой микроскопии обнаружена округлая морфология клеток, добавьте DMEM, содержащий 10% FBS.
3. Центрифугируйте клетки в течение 5 мин при 200 × г при комнатной температуре.
4. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте эти элементы в 1 мл PBS перед добавлением предварительно охлажденного 75% раствора этанола.
5. Смесь выдерживают не менее 4 ч или в течение ночи при температуре −20 °C.
6. Промойте клетки 2 раза ледяным PBS и 180 μл ЭДТА (0,1 мМ, 3,7 мг ЭДТА + 100 мл PBS), 20 μл РНКазы А (10 мг/мл), 35 μл Triton X-100 (2%, 2 мл Triton + 98 мл FBS) и 96,5 μл PBS. Затем добавьте 17,5 мкл раствора PI (1 мг/мл).
7. Выдержать смесь при температуре 4 °C в темноте в течение 10 минут.
8. Промойте клетки в 200 мкл PBS, а затем поместите их в проточный цитометр для оценки распределения клеточного цикла, как описано ранее¹².
9. Работа с проточным цитометром в двойном лазере, трехмерном пространстве, в режиме возбуждения с размером пятна 22 мкм x 66 мкм и размером пятна 13 мкм x 66 мкм. Используйте проточную комнату размером 430 мкм x 180 мкм, спектром 300-1 100 нм, обнаруживаемостью ≤100 MESF и разрешением CV <2%. Затем подвергните клетки воздействию возбуждающего света с длиной волны 488 нм, а также обнаруживите и измерьте сигналы флуоресценции с помощью программного обеспечения прибора для определения распределения клеточного цикла¹³.
10. Определите содержание ДНК, а затем по содержанию ДНК проанализируйте клеточный цикл.

7. Статистический анализ

1. Выполнение статистического анализа.
2. Представьте данные в виде среднего значения ± стандартного отклонения.
3. Используйте t-критерий Стьюдента для сравнения групп со статистической значимостью, установленной как P < 0,05.

Результаты

Посев клеток глиомы U251
Клетки глиомы U251 имели веретеновидную форму через 24–48 ч после культивирования в DMEM и были адгезированы. Эти клетки были использованы для дальнейшего изучения (рис. 1).

Морфология и количество клеток глиомы
Количество клеток глиомы U251 в группе ГБО в сочетании с группой рентгенографии (2 Гр) было значительно ниже, чем в группе рентгенографии (2 Гр) после 24 ч, 48 ч и 72 ч культивирования клеток...

Обсуждение

Клеточная линия глиомы U251 является одной из самых классических клеточных линий глиомы человека и широко используется в качестве модели глиомы во многих исследованиях.

Влияние ГБО на пролиферацию клеток глиомы U251
ГБО обычно относится к вдыханию чистого кислорода (100% концентрация кислорода) в герметичной камере с давлением, в 1,5-3 раза превышающим обычное атмосферное давление, что может увеличить содержание кислорода в микрососудистой ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Буфер привязки	Dickinson and Company	RH10 9RR
CCK-8 тестовый набор	DOJINDO		NJ Анализ подсчета клеток
CELL FIT			анализ клеточного цикла (содержание ДНК)
CELLQUEST			анализ апоптотических клеток
DMEM и Annexin V-FITC	Gibco BRL
проточная цитометра	Dickinson
Glioma U251 и U87	Шанхайский институт клеточной биологии
гипербарическая кислородная камера	Институт		Хонюэн
медицинский линейный ускоритель	Elekta Limited Company
считыватель
MOD FITLT formac v1.01			клеточный анализ--фаза клеточного цикла
трипсин	Hyclone Laboratories