В этой статье представлен подробный протокол подготовки сеток для образцов при температурах до 70 °C перед погружением замораживания для крио-ЭМ-экспериментов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Подготовка высокотемпературных сеток для отбора проб для крио-ЭМ
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Сетки образцов для экспериментов криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) обычно готовят при температуре, оптимальной для хранения биологических образцов, в основном при 4 °C и иногда при комнатной температуре. Недавно мы обнаружили, что структура белка, решенная при низкой температуре, может быть функционально неактуальной, особенно для белков из термофильных архей. Была разработана процедура подготовки образцов белка при более высоких температурах (до 70 °C) для крио-ЭМ-анализа. Мы показали, что структуры из образцов, полученных при более высоких температурах, функционально значимы и зависят от температуры. Здесь мы опишем подробный протокол подготовки пробных сеток при высокой температуре, используя в качестве примера 55 °C. В эксперименте использовали витрификационный аппарат, модифицированный с использованием дополнительной центрифужной трубки, и образцы инкубировали при 55 °C. Подробные процедуры были точно настроены, чтобы свести к минимуму конденсацию пара и получить тонкий слой льда на сетке. Приведены примеры успешных и неудачных экспериментов.
Введение
Крио-ЭМ-технология решения структур белковых комплексов продолжала совершенствоваться, особенно в направлении получения структур высокого разрешения 1,2. В то же время ландшафт его применения также был расширен за счет изменения условий отбора проб, таких как рН или лиганды, до процесса витрификации3, который включает в себя подготовку сеток образцов с последующим погружным замораживанием 4,5. Еще одним важным условием является температура. Хотя крио-ЭМ-эксперименты, такие как рентгеновская кристаллография, выполняются при низких температурах, структура, решаемая крио-ЭМ, отражает структуру в состоянии раствора до витрификации. До недавнего времени в большинстве крио-ЭМ-исследований анализа одиночных частиц (SPA) использовались образцы, которые хранятся на льду (т.е. при 4 °C) до витрификации6, хотя в ряде исследований используются образцы при комнатной температуре около 7,8,9,10 или до 42 °C 11. В недавнем отчете мы провели температурно-зависимые исследования фермента кетол-кислотной редуктоизомеразы (KARI) из термофильного археона Sulfolobus solfataricus (Sso) при шести различных температурах от 4 ° C до 70 ° C12. Наши исследования показывают, что важно готовить сетки образцов при функционально значимых температурах и что крио-ЭМ является единственным структурным методом, который практически осуществим для решения структуры одного и того же белкового комплекса при нескольких температурах.
Основная трудность для витрификации при высоких температурах заключается в минимизации конденсации пара и достижении тонкого льда. Здесь мы сообщаем о подробном протоколе, используемом для подготовки сеток образцов при высоких температурах в нашем предыдущем исследовании Sso-KARI 12. Мы предполагаем, что читатели или зрители уже имеют опыт в общих процедурах подготовки образцов и обработки данных для крио-ЭМ-экспериментов, и подчеркиваем аспекты, относящиеся к высокой температуре.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол направлен на использование модифицированного коммерческого витрификационного аппарата для подготовки образцов криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) при определенных температурах, особенно выше 37 °C. Общая экспериментальная установка показана на рисунке 1. В качестве примера протокол использует 55 °C. Конкретные условия при других температурах см. в Дополнительной таблице 2 в ссылке12.
1. Подготовка витрификационного аппарата
- Сделайте отверстие размером 1 см в трубке центрифуги объемом 50 мл на ее закрытом конце.
- Поместите трубку в камеру витрификационного аппарата на выходе ультразвуковой воды, как показано на рисунке 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы свести к минимуму конденсацию воды, направляя водяной пар в теплообменник через трубку, прежде чем достичь всей камеры. - Установите температуру витрификационного аппарата на указанную температуру (например, 55 °C, как показано на фиг.3) и позвольте камере устройства витрификации достичь 55 °C и 100% относительной влажности. Дайте ему постоять не менее получаса, чтобы стабилизировать условия перед началом эксперимента.
2. Разогрев образца и инструментов
- Поставьте водяную баню на конфорку и установите конфорку на нужную температуру (здесь 55 °C). Проверьте с помощью термометра, чтобы убедиться, что вода достигает 55 °C.
- Высиживайте образец на водяной бане и разогрейте наконечник пипетки на краю конфорки в течение 2 мин или дольше перед экспериментом по промоканию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Самая высокая температура для камеры витрификационного аппарата составляет 60 °C. Для подготовки высокотемпературных решеток для эксперимента с циро-ЭМ (например, 70°С) образец инкубируют на водяной бане при 80°С, и среднее значение между температурой образца и температурой витрификационного аппарата оценивается как фактическая температура образца на сетке (в данном случае 70°С). Смотрите раздел Обсуждение для получения более подробной информации и ограничений на эту оценку.
3. Подготовка к эксперименту по блоттингу
- Тлеющий разряд представляет собой дырявую углеродную сетку при 25 мА в течение 30 с, или альтернативную значениям в зависимости от используемого устройства.
- Инкубировать пинцет сеткой в витрификационном аппарате в течение 2 мин или дольше.
- Наполните контейнер с этаном этаном в соответствии со стандартными процедурами. Не допускайте переполнения этана.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг занимает около 10 минут и должен немедленно сопровождаться экспериментом по промоканию, чтобы избежать замерзания. - Поместите фильтровальную бумагу для витрификации в камеру витрификационного аппарата не ранее, чем за 5 минут до эксперимента по промоканию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Помещение фильтровальной бумаги в камеру слишком рано приведет к тому, что она станет слишком влажной.
4. Эксперимент с блоттингом
ПРИМЕЧАНИЕ: При удержании сетки убедитесь, что сетка стабильна и имеет минимальную площадь контакта с пинцетом (рисунок 4). Это делается для поддержания наилучшей эффективности охлаждения этана и избегания нестекретного льда.
- Используйте наконечник пипетки, чтобы нанести 7-9 мкл образца на сетку. Затем подождите 1-2 с, промокните 1-1,5 с и быстро окуните образец в жидкий этан.
- Перенесите сетку из жидкого этана в криокроб, который хранится в жидком азоте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен очень осторожно, потому что пинцет все еще горячий, поэтому весь охлаждающий бак в это время полон пара.
5. Проверка качества сеток
- Обрежьте сетки и загрузите их на крио-ЭМ-инструмент.
- Используйте экран дисплея крио-ЭМ-прибора и функцию низкой дозы программного обеспечения для скрининга состояния льда на сетке и распределения образца по сетке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Часто сетки очень сухие, или слой льда слишком толстый. Успешность сеток, приготовленных при высоких температурах, значительно ниже, чем при комнатной температуре или 4 °C. Репрезентативные результаты хороших и неудовлетворительных сеток показаны в следующем разделе. - Если качество полученной сетки не очень хорошее, повторите процесс подготовки сетки с различными условиями (такими как время ожидания, время промокания и т. Д.). Если качество полученной сетки хорошее, повторите те же шаги, чтобы сделать сетки при другой температуре.
6. Сбор данных
- Перенесите сетки хорошего качества на крио-ЭМ-прибор высокого разрешения.
- Осуществлять сбор и анализ данных в соответствии с установленными процедурами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как показано в нашей предыдущей публикации, разрешение конструкции не зависит от высокой температуры12.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Обзор низкого увеличения показан на рисунке 5A,B. Панель A является примером успешной сетки. Есть градиент льда сверху слева (толще) до нижнего правого (тоньше или пустее). Такая сетка облегчает поиск подходящей толщины ледяного слоя в средней области, подходящей для сбора данных, такой как синие и зеленые квадраты. Сетка B слишком сухая. Квадраты в сетке имеют яркий контраст, что означает, что слой льда слишком тонкий или его вообще нет. Только два квадрата, обозначенные кр...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
На шаге 1 протокола убедитесь, что трубка центрифуги установлена хорошо и не падает во время эксперимента. В связи с накоплением в камере большого количества капель воды, которые могли изменить адсорбционную способность фильтровальной бумаги, рекомендуется, чтобы общее время эксперимента не превышало 30 мин после того, как камера витрификационного аппарата достигла температуры равновесия. Если время работы превышает 30 мин, оператору необходимо заменить фильтровальную бумагу и подождать, пока в салоне снова сбалансируют ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Авторы благодарят доктора Эрве Ремиджи из Thermo Fisher Scientific за полезные советы. Крио-ЭМ-эксперименты проводились в Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). ASCEM поддерживается Academia Sinica (Грант No. AS-CFII-108-110) и Тайваньский протеиновый проект (грант No. AS-KPQ-109-TPP2). Авторы также благодарят г-жу Хуэй-Цзюй Хуан за помощь в подготовке проб.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Трубка Falcon | 352070 | размер: 50 мл | |
| Фильтровальная бумага | Ted Pella | 47000-100 | Ø 55/20 мм, Grade 595 |
| HI1210 | Leica | водяная баня | |
| K100X | Электронная микроскопия Sciences | ||
| Quantifoil, 1,2/1,3 200 меш Cu сетка | Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | низкой дозой визуализации |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Пинцет Vitrobot | Ted Pella | 47000-500 |
Ссылки
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587, 157-161 (2020).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
- Chen, C. Y., et al. Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase. Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).
- Cabra, V., Samsó, M. Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction. Journal of Visualized Experiments. (95), e52311(2015).
- Klebl, D. P., et al. Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales. Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).
- Passmore, L. A., Russo, C. Specimen preparation for high resolution cryo-EM. J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
- Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -F., Savage, D. F., Davies, K. M. Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis. Nature. 566, 411-414 (2019).
- Gao, Y., et al. Structures and operating principles of the replisome. Science. 363, (2019).
- Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364, 355-362 (2019).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23, 1097-1105 (2015).
- Singh, A. K., et al. Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3. Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).
- Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions. Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
