Методическая статья

Количественный анализ скорости роста Aspergillus nidulans с использованием живой микроскопии и программного обеспечения с открытым исходным кодом

DOI:

10.3791/62778

⸱

24 июля 2021 г.

 ,  ,  , 
1Microbial Molecular Genetics Laboratory, Institute of Biosciences and Applications, National Centre for Scientific Research, Demokritos (NCSRD), 2Light Microscopy Unit, Institute of Biosciences and Applications, National Centre for Scientific Research, Demokritos (NCSRD)

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем протокол визуализации в реальном времени без меток, использующий методы микроскопии пропускаемого света для захвата изображений, анализа и количественной оценки кинетики роста нитевидного гриба A. nidulans как в погруженных культурах, так и в твердых средах. Этот протокол может использоваться в сочетании с флуоресцентной микроскопией.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хорошо известно, что рост колонии нитевидных грибов, в основном зависящий от изменений скорости роста гиф/мицелия, макроскопически оценивается на затверделых средах путем сравнения размеров колоний. Однако количественно измерить скорость роста генетически различных грибковых штаммов или штаммов в различных условиях окружающей среды / роста (рН, температура, источники углерода и азота, антибиотики и т. Д.) Является сложной задачей. Таким образом, стремление к комплементарным подходам к количественной оценке кинетики роста становится обязательным, чтобы лучше понять рост грибковых клеток. Кроме того, хорошо известно, что нитевидные грибы, включая Aspergillus spp., имеют различные способы роста и дифференциации в субвоздушных условиях на твердых средах или погруженных культурах. Здесь мы подробно описываем количественный микроскопический метод анализа кинетики роста модельного гриба Aspergillus nidulans,используя живую визуализацию как в погруженных культурах, так и в твердых средах. Мы захватываем изображения, анализируем и количественно определяем темпы роста различных штаммов грибов воспроизводимым и надежным способом, используя бесплатное программное обеспечение с открытым исходным кодом для биоизобликов (например, Фиджи), таким образом, чтобы не требовал от пользователя какого-либо предварительного опыта анализа изображений.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нитевидные грибы имеют большое социально-экономическое и экологическое значение, будучи как промышленными/сельскохозяйственными инструментами для производства ферментов иантибиотиков 1,2, так и патогенами сельскохозяйственных растений3,насекомых-вредителей4 и человека3. Кроме того, нитевидные грибы, такие как Aspergillus nidulans, широко используются в качестве модельных организмов для фундаментальных исследований, таких как исследования в области генетики, клеточной и эволюционной биологии, а также для изучения гифального расширения5. Нитевидные грибы представляют собой высокополяризованные организмы, которые удлиняются за счет непрерывного снабжения мембранных липидов/белков и de novo синтеза клеточной стенки на расширяющейся кончике6. Центральную роль в росте и поддержании полярности гифального кончика играет специализированная структура под названием «Шпитценкорпер» (SPK), высокоупорядоченная структура, состоящая в основном из цитоскелетных компонентов и поляризованного распределения Гольджи6,7,8.

Стимулы/сигналы окружающей среды, такие как водно-воздушный интерфейс, свет, концентрация CO2 и состояние питания, отвечают за решения развития, принимаемые этими формами9. В погруженных (жидких) культурах дифференциация A. nidulans подавляется и рост происходит путем удлинения гифального кончика6. Во время вегетативного роста беспощадные споры (конидии) прорастают апикальным расширением, образуя недифференцированную сеть взаимосвязанных гифальных клеток, мицелий, который может продолжать расти бесконечно, пока доступны питательные вещества и пространство. С другой стороны, на твердых носителях гифальные кончики удлиняются и после определенного периода вегетативного роста (развития компетентности) инициируется бесполое размножение и воздушные конидиофорные стебли простираются от специализированных клеток стопы мицелия6. Они порождают специализированные многоклеточные структуры развития, называемые конидиофорами, которые производят длинные цепи гаплоидных конидий10, которые могут возобновить рост при благоприятных условиях окружающей среды.

Широко используемым методом измерения роста нитевидных грибов является инокуляция спор на питательный агар, содержащийся в чашке Петри, и макроскопическое измерение диаметра колонии через несколькодней 11. Диаметр/площадь колонии, наиболее зависящая от изменений скорости роста мицелиала и меньше от плотности конидиофора12,затем используется в качестве значения роста. Хотя измерение размера грибковой популяции (колонии), растущей на твердых поверхностях, вполне адекватно, это ни в коем случае не самая точная мера роста. По сравнению со средними показателями популяционного уровня (средними значениями размера грибковой колонии), измерения одной клетки могут фиксировать гетерогенность клеточной популяции и позволяют идентифицировать новые субпопудрения клеток, состояния13,динамику, пути, а также биологические механизмы, с помощью которых клетки реагируют на эндогенные и экологические изменения14,15. Мониторинг роста и фенотипа грибковых клеток с помощью покадровой микроскопии, возможно, является наиболее широко используемым количественным подходом к наблюдению за одной клеткой.

Здесь мы подробно описываем протокол визуализации в реальном времени без меток с использованием методов микроскопии пропускаемого света (таких как фазовый контраст, дифференциальный интерференционный контраст (DIC) и поляризованная микроскопия) для захвата изображений, которые независимо от совместного использования флуоресцентной микроскопии могут быть использованы для анализа и количественной оценки полярного роста штаммов A. nidulans как в погруженных культурах, так и в твердых средах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Приготовление инокулятов

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы должны выполняться под ламинарной проточной шкафом.

  1. Вывод интересующих грибкового штамма из запаса глицерина (-80 °C) с использованием стерильной петли инокуляции на пластины с минимальной средой (MM), дополненной соответствующими требованиями к питанию, относящимися к исследуемому штамму [MM: 10,0 г / л глюкозы, 20 мл / л раствора соли (раствор соли: 26 г / л KCl, 26 г / л MgSO4· 7H2O, 76 г/л KH2PO4, 2,0 мл/л хлороформа) и 1 мл/л микроэлементов (микроэлементы: 40 мг/л Na2B4O7· H2O,400 мг/л CuSO4,8 г/л ZnSO4,800 мг/л MnSO4,800 мг/л FePO4),отрегулировать рН до 6,8 с 1 M NaOH, добавить 1 % (мас./об.) агара и необходимые добавки, как описано в16 и автоклаве](рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор соли, раствор микроэлементов и добавки являются автоклавными.
  2. Инкубировать в течение 2-3 дней при 37 °C.
  3. Используйте стерильную зубочистку (или петлю прививки), перенесите небольшое количество конидий, осторожно коснувшись одной колонии, на пластины полной среды (CM) [CM: 10,0 г / л глюкозы, 2,0 г / л пептона, 1,0 г / л дрожжевого экстракта, 1,0 г / л казаминозацидов, 20 мл / л солевого раствора, 1 мл / л микроэлементов, 5 мл / л витаминного раствора (витаминный раствор: 0,1 г/л рибофлавина, 0,1 г/л никотинамида, 0,01 г/л п-аминобензойной кислоты, 0,05 г/л пиридоксина HCl, 1,0 мг/л биотина), довести рН до 6,8 с 1 М NaOH, добавить 1 % (мас./об.) агара и необходимые добавки, как описано в16 и автоклаве]. Автоклав и храните раствор витамина в темном флаконе при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В случае, если грибковый рост слишком плотный, чтобы идентифицировать и изолировать отдельные колонии, повторно проложите полосу на новой агаровой пластине, чтобы получить отдельные колонии.
  4. Инкубировать в течение 3-4 дней при 37 °C.
  5. Получают конидиальную суспензию приблизительно 2 х 106 клеток/мл, поцарапав 1 см от поверхности конидидированной грибковой колонии, выращенной на пластинах агара СМ, используя стерильную зубочистку(рисунок S1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости подсчитывать конидии с помощью гемоцитометра.
  6. Собирают конидии A. nidulans в стерильной центрифужной трубке 1,5 мл с 1,0 мл автоклавной дистиллированной воды, содержащей 0,05% (v/v) Tween 80 для уменьшения количества сгустков конидий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конидии могут храниться до 2-3 недель при 4 °C без соответствующей потери жизнеспособности (A. Athanasopoulos and V. Sophianopoulou, неопубликованные данные). Тем не менее, рекомендуется фильтровать и / или промывать конидиальную суспензию для удаления мицелиальных частей и питательных веществ, чтобы предотвратить конидиальный отек.

2. Подготовка к визуализации нитевидных грибов, растущих на агаровых (твердых) средах

ПРИМЕЧАНИЕ: Используется модифицированная версия метода 'инвертированного агара17,18.

  1. Первоначально обнаружите 10 мкл аликвот энергично вихревой конидиальной (приблизительно 2 x 104 клетки/мл) в нескольких точках на чашках Петри (Ø9 см) 15 мл ММ с 1% (мас./об.) агаром(рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используя модифицированную версию «метода перевернутого агара», можно визуализировать образцы грибов в течение многих часов без видимого пациозного воздействия на растущие гифы.
  2. Инкубируют экспериментальную культуру в соответствии с стадией развития, предназначенной для исследования.
  3. Вырежьте ≈0,8 мм2 блока агара, содержащего колонию, с помощью стерильного скальпеля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размеры агарового блока, который должен быть разрезан, зависят от размеров оборудования, которое будет размещено впоследствии. В настоящей работе используются 8 скважин μ-слайдов (см. ниже).
  4. Инвертируйте и поместите агаровый блок в колодец μ-слайда или аналогичного 8-камерного покровного стекла с крышкой, подходящего для визуализации в реальном времени.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В случае, если микроскопия пропускаемого света будет использоваться в сочетании с флуоресцентной (маркировкой) микроскопией, блок агара может быть инвертирован на каплю жидкой среды, содержащей краситель для окрашивания живых клеток, непосредственно перед визуализацией.

3. Подготовка к визуализации нитевидных грибов, растущих на жидкой среде

  1. Перенос 10 мкл аликвот энергично вихревой конидиальной суспензии (приблизительно 2 х 104 ячейки/мл) в скважины 8 скважин μ-слайда, содержащего 200 мкл (жидкого) ММ с соответствующими добавками (см. выше).
  2. Инкубировать в течение нужного времени при нужной температуре(рисунок 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если пропускаемая световая микроскопия будет использоваться в сочетании с флуоресцентной (маркировкой) микроскопией, жидкие культуры имеют большое преимущество, что флуоресцентные красители могут быть добавлены в любой желаемый момент времени во время эксперимента19.

4. Захват изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор микроскопа зависит от имеясь оборудования. В любом случае установка микроскопа должна включать в себя перевернутую ступень, камеру окружающей среды или, по крайней мере, помещение с точным контролем температуры воздуха.

  1. Предварительно разогрейте термостатированную камеру микроскопа при 37 °C (если не указано иное или как подходящее для используемых грибковых видов) для стабилизации температуры перед запуском. Эта камера позволяет осуществлять температурную модуляцию оптики микроскопа и стадии образца во время покадровых экспериментов. Имейте в виду, что оптические аберрации20 вводятся, когда обычные погружные масла (предназначенные для использования при 23 °C) масла используются при 37 °C или выше.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При ограниченном бюджете инкубационные камеры могут быть изготовлены из картона и изоляционного упаковочного материала21 или с помощью 3D-принтера22.
  2. Включите микроскоп, питание сканера, мощность лазера и компьютер и загрузите программное обеспечение для обработки изображений. Поместите μ-слайд (подготовленный ранее) в стадию микроскопа и сфокусироваться.
  3. Найдите поля зрения, которые содержат изолированные / не перекрывающиеся ячейки (или, по крайней мере, не переполненные), чтобы облегчить измерения роста во время анализа изображений. Захватите не менее 50 растущих клеток на образец, чтобы обеспечить надежный статистический анализ.
  4. Выберите нужный подход к микроскопии пропускаемого света. Уменьшить время экспозиции или мощность лазера и время выдержки пикселей и/или увеличить диаметры точечных отверстий, чтобы свести к минимуму фотоотбеливание грибковых клеток, как описано в других местах 23,24.
  5. Установите микроскоп для получения изображений через нужные промежутки времени и начните сбор временных рядов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы скорректировать фокальный дрейф с течением времени (особенно для длительных экспериментов) из-за теплового дрейфа, различных размеров ячеек и движения клеток, используйте стратегию автофокусировки, если она доступна в программном обеспечении микроскопа.

5. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: В данном разделе описаны ключевые этапы обработки покадровых микроскопических изображений для измерения скорости роста A. nidulans. Открытие, визуализация и обработка изображений осуществляется с помощью программного обеспечения ImageJ/Fiji с открытым исходным кодом25.

  1. Импортируйте изображения на Фиджи с помощью плагинов | Биоформаты | Импортер биоформатов из меню Фиджи с настройками по умолчанию(рисунок 4A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте, правильно ли импортер биоформатов распознает калибровку изображения. Размер рисунка, показанный в верхнем информационном поле изображения окна, должен быть равен исходным размерам изображения(рисунок 4B). Нажмите Shift + P для отображения и изменения свойств изображения в программном обеспечении ImageJ/Fiji.
  2. При необходимости используйте гистограмму, соответствующую26, для коррекции освещенности между различными кадрами (Image | Отрегулируйте | | коррекции отбеливателя Сопоставление гистограмм)(рисунок 4C).
  3. При необходимости используйте SIFT-алгоритм (Плагины | Регистрационный | Линейное выравнивание стека с помощью SIFT) для выравнивания или сопоставления стеков изображений(рисунок 4D). Выбора«Перевод»из ожидаемого меню преобразования должно быть достаточно, чтобы исправить любой дрейф x-y.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие плагины также могут использоваться для выравнивания стека фрагментов изображения, такие как Image Stabilizer (https://imagej.net/Image_Stabilizer) или StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/).
  4. Выбирайте гифы, которые растут параллельно покрову, избегая наклоненных. Обязательно выбирайте гифы, которые распространяются полярным расширением, и избегайте гиф, представляющих боковое и / или апикальное ветвление.
  5. Использование MTrackJ (плагины | MTrackJ) плагин для отслеживания растущих гифтальных подсказок(рисунок 4E)27. Чтобы добавить трек, нажмите кнопку Добавить на панели инструментов и поместите первую точку на подсказку гифа левой кнопкой мыши. Временной ряд автоматически перейдет к следующему кадру. Чтобы завершить процесс отслеживания, дважды щелкните мышью на конечной точке (или нажмите клавишу Esc)(рисунок 4F). Перейдите к другой точке интереса (т.е. растущему гифальному наконечнику) в начальных временных рамках и перезапустите процедуру, измерив скорость роста другой гифы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для установки MTrackJ следуйте инструкциям, представленным на https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
  6. Нажмите кнопку Measure в диалоговом окне MTrackJ(рисунок 4G),чтобы открыть выходную таблицу. Сохранение измерений трека (Файл | Сохранить как) в нужный формат файла (например, csv), проанализировать и построить их(рисунок 4H).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При нажатии кнопки «Фильм» создается фильм, показывающий изображение и прогрессию трека.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Следуя этому протоколу, мы захватили и проанализировали различные изображения, соответствующие различным стадиям роста/развития нителезного гриба A. nidulans. Данные, представленные в этом исследовании, были обработаны и проанализированы с использованием программного обеспечения Fiji. Измерения были сохранены в виде csv-файлов, статистически проанализированы и подготовлены в виде графиков с использованием коммерческого статистического программного обеспечения и / или языка программирования Python с использование...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мониторинг роста и фенотипа грибковых клеток с помощью покадровой микроскопии является мощным подходом к оценке клеточного поведения в режиме реального времени и количественно и точно определить, приводит ли конкретное лекарственное лечение и / или генетическое вмешательство к обнаруживаемому росту клеток или фенотипическим различиям с течением времени.

В этом исследовании была описана надежная методология визуализации живых клеток для измерения и количественного анализа развития грибков, вклю...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была частично поддержана проектом «Греческая исследовательская инфраструктура для визуализации и мониторинга фундаментальных биологических процессов (BioImaging-GR)» (MIS 5002755), который реализуется в рамках акции «Укрепление научно-исследовательской и инновационной инфраструктуры», финансируемой Оперативной программой «Конкурентоспособность, предпринимательство и инновации» (NSRF 2014-2020) и софинансируемой Грецией и ЕС.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
µ-Слайд 8 ЛункаIbidi80826Визуализационные слайды
4-Аминобензойная кислотаMerckA9878
azhAΔ ngnAΔГенотип: zhAΔ::p yrGAf; ngnAΔ::p yrGAf; pyroA4 pantoB100 / Ссылки:Лабораторная коллекция, Athanasopoulos et al., 2013
Bacto Casamino AcidsGibco223030
БиотинMerckB4639
ХлороформMerck67-66-3
Пентагидрат сульфата меди(II) MerckC8027
ГлюкозаMerckG8270
GraphPad Prism 8.0Программное обеспечениеGraphPad Статистическое программное обеспечение
ImageJNIHПрограммное обеспечение для обработки и анализа изображений
Петля инокуляцииMerckI8263-500EA
Фосфат железа(III)Merck1.03935
Leica Application Suite XLeica MicrosystemsПрограммное обеспечение для микроскопа
Сульфат магния гептагидратMerck63138
Моногидрат сульфата марганца(II) MerckM7899
Микроскоп Leica TCS SP8Leica Microsystems
Никотинамид (ниацинамид)Supelco47865-U
ПептонМиллипор68971
Чашки Петри для микробиологической культурыKISKERG090
Хлорид калияMerckP4504
Фосфат калия одноосновнойMerckP5655
Пиридоксина гидрохлоридMerckP6280
Quali - Микроцентрифужные пробирки, 1,7 мл, без ДНКазы, РНКазы и пирогенов, стерильныеKISKERG052-S
Quali - Микроцентрифужные пробирки, 2,0 мл, стерильныеKISKERG053-S
Quali - Стандартные наконечники, скошенные, 100-1000 и микро; LKISKERVL004G
Quali - Стандартные наконечники, скошенные, 1-200 и микро; LKISKERVL700G
Микрообъемные наконечники Quali, без ДНКазы, РНКазы, 0,1-10 и микро; L/прозрачныйKISKERGC. СОВЕТЫ. B
Рибофлавин (B2)Supelco47861
Лезвия для скальпеля No 11OdontoMed2011S2771
Хлорид натрияMerckS7653
Гидроксид натрияMerckS8045
Тетраборат натрия декагидратMerckS9640
VS151 (PilA-GFP и H1-mRFP)Генотип: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+  pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / Ссылки:Лабораторная коллекция, Бираци и др., 2021
WTГенотип: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4; pyrG89 / Ссылки: TN02A3 -FGSC A1149
Дрожжевой экстрактMillipore70161
ZnSO4

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kumar, A. Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications. International Journal of Microbiology. 2020, 8894215(2020).
  2. Kück, U., Bloemendal, S., Teichert, I. Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics. PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).
  3. Paterson, R. R. M., Lima, N. Filamentous Fungal Human Pathogens from Food Emphasising Aspergillus, Fusarium and Mucor. Microoraganism. 5 (3), (2017).
  4. Wang, C., Wang, S. Insect Pathogenic Fungi: Genomics, Molecular Interactions, and Genetic Improvements. Annual Review of Entomology. 62, 73-90 (2017).
  5. Etxebeste, O., Espeso, E. A. Aspergillus nidulans in the post-genomic era: a top-model filamentous fungus for the study of signaling and homeostasis mechanisms. International Microbiology. 23 (1), 5-22 (2020).
  6. Riquelme, M., et al. Fungal Morphogenesis, from the Polarized Growth of Hyphae to Complex Reproduction and Infection Structures. Microbiology and Molecular Biology Reviews MMBR. 82 (2), (2018).
  7. Athanasopoulos, A., André, B., Sophianopoulou, V., Gournas, C. Fungal plasma membrane domains. FEMS Microbiology Reviews. , (2019).
  8. Pantazopoulou, A., Peñalva, M. A. Organization and Dynamics of the Aspergillus nidulans Golgi during Apical Extension and Mitosis. Molecular Biology of the Cell. 20 (20), 4335-4347 (2009).
  9. Bayram, Ö, Feussner, K., Dumkow, M., Herrfurth, C., Feussner, I., Braus, G. H. Changes of global gene expression and secondary metabolite accumulation during light-dependent Aspergillus nidulans development. Fungal Genetics and Biology. 87, 30-53 (2016).
  10. Yu, J. -H. Regulation of Development in Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus. Mycobiology. 38 (4), 229-237 (2010).
  11. Tomkins, R. G. Measuring growth: The petri dish method. Transactions of the British Mycological Society. 17 (1-2), 150-153 (1932).
  12. Gifford, D. R., Schoustra, S. E. Modelling colony population growth in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Journal of Theoretical Biology. 320, 124-130 (2013).
  13. Kasprowicz, R., Suman, R., O'Toole, P. Characterising live cell behaviour: Traditional label-free and quantitative phase imaging approaches. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 89-95 (2017).
  14. Aknoun, S., et al. Quantitative phase microscopy for non-invasive live cell population monitoring. Scientific Reports. 11, (2021).
  15. Chessel, A., Carazo Salas, R. E. From observing to predicting single-cell structure and function with high-throughput/high-content microscopy. Essays in Biochemistry. 63 (2), 197-208 (2019).
  16. Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).
  17. Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. Live-cell Imaging of Filamentous Fungi Using Vital Fluorescent Dyes and Confocal Microscopy. Methods in Microbiology. 34, 63-87 (2004).
  18. Trinci, A. P. J. A Kinetic Study of the Growth of Aspergillus nidulans and Other Fungi. Journal of General Microbiology. 57 (1), 11-24 (1969).
  19. Lichius, A., Zeilinger, S. Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi. Journal of Visualized Experiments. (153), e60613(2019).
  20. Oomen, L. C. J. M., Sacher, R., Brocks, H. H. J., Zwier, J. M., Brakenhoff, G. J., Jalink, K. Immersion oil for high-resolution live-cell imaging at 37°C: optical and physical characteristics. Journal of Microscopy. 232 (2), 353-361 (2008).
  21. Distel, M., Köster, R. In Vivo Time-Lapse Imaging of Zebrafish Embryonic Development. CSH protocols. 2007, (2007).
  22. Walzik, M., et al. A portable low-cost long-term live-cell imaging platform for biomedical research and education. Biosensors and Bioelectronics. 64, (2014).
  23. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
  24. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Miura, K. Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences. F1000Research. 1000, 1494(2020).
  27. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for Cell and Particle Tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  28. Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1. Microbiology. 155, Pt 6 2040-2048 (2009).
  29. Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans. Scientific Reports. 11 (1), 7391(2021).
  30. Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans. Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).
  31. Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans. Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).
  32. Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis. Scientific Reports. 5 (1), (2015).
  33. Peñalva, M. A. Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64. Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).
  34. Versari, C., et al. Long-term tracking of budding yeast cells in brightfield microscopy: CellStar and the Evaluation Platform. Journal of The Royal Society Interface. 14 (127), 20160705(2017).
  35. Adams, T. H., Wieser, J. K., Yu, J. -H. Asexual Sporulation in Aspergillus nidulans. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (1), 35-54 (1998).
  36. Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. Microscopy of fungal biofilms. Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).
  37. Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
  38. Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns. Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).
  39. Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf. Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ImageJ Fiji

Похожие статьи