Мы представляем протокол визуализации в реальном времени без меток, использующий методы микроскопии пропускаемого света для захвата изображений, анализа и количественной оценки кинетики роста нитевидного гриба A. nidulans как в погруженных культурах, так и в твердых средах. Этот протокол может использоваться в сочетании с флуоресцентной микроскопией.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Количественный анализ скорости роста Aspergillus nidulans с использованием живой микроскопии и программного обеспечения с открытым исходным кодом
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Хорошо известно, что рост колонии нитевидных грибов, в основном зависящий от изменений скорости роста гиф/мицелия, макроскопически оценивается на затверделых средах путем сравнения размеров колоний. Однако количественно измерить скорость роста генетически различных грибковых штаммов или штаммов в различных условиях окружающей среды / роста (рН, температура, источники углерода и азота, антибиотики и т. Д.) Является сложной задачей. Таким образом, стремление к комплементарным подходам к количественной оценке кинетики роста становится обязательным, чтобы лучше понять рост грибковых клеток. Кроме того, хорошо известно, что нитевидные грибы, включая Aspergillus spp., имеют различные способы роста и дифференциации в субвоздушных условиях на твердых средах или погруженных культурах. Здесь мы подробно описываем количественный микроскопический метод анализа кинетики роста модельного гриба Aspergillus nidulans,используя живую визуализацию как в погруженных культурах, так и в твердых средах. Мы захватываем изображения, анализируем и количественно определяем темпы роста различных штаммов грибов воспроизводимым и надежным способом, используя бесплатное программное обеспечение с открытым исходным кодом для биоизобликов (например, Фиджи), таким образом, чтобы не требовал от пользователя какого-либо предварительного опыта анализа изображений.
Введение
Нитевидные грибы имеют большое социально-экономическое и экологическое значение, будучи как промышленными/сельскохозяйственными инструментами для производства ферментов иантибиотиков 1,2, так и патогенами сельскохозяйственных растений3,насекомых-вредителей4 и человека3. Кроме того, нитевидные грибы, такие как Aspergillus nidulans, широко используются в качестве модельных организмов для фундаментальных исследований, таких как исследования в области генетики, клеточной и эволюционной биологии, а также для изучения гифально....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Приготовление инокулятов
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы должны выполняться под ламинарной проточной шкафом.
- Вывод интересующих грибкового штамма из запаса глицерина (-80 °C) с использованием стерильной петли инокуляции на пластины с минимальной средой (MM), дополненной соответствующими требованиями к питанию, относящимися к исследуемому штамму [MM: 10,0 г / л глюкозы, 20 мл / л раствора соли (раствор соли: 26 г / л KCl, 26 г / л MgSO4· 7H2O, 76 г/л KH2PO4, 2,0 мл/л хлороформа) и 1 мл/л микроэлементов (микроэлементы: 40 мг/л Na2B4O7· H2O,400 мг/л CuS....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Следуя этому протоколу, мы захватили и проанализировали различные изображения, соответствующие различным стадиям роста/развития нителезного гриба A. nidulans. Данные, представленные в этом исследовании, были обработаны и проанализированы с использованием программного обеспечения Fiji. Измерения были сохранены в виде csv-файлов, статистически проанализированы и подготовлены в виде графиков с использованием коммерческого статистического программного обеспечения и / или языка программирования Python с использование.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мониторинг роста и фенотипа грибковых клеток с помощью покадровой микроскопии является мощным подходом к оценке клеточного поведения в режиме реального времени и количественно и точно определить, приводит ли конкретное лекарственное лечение и / или генетическое вмешательство к обнаруживаемому росту клеток или фенотипическим различиям с течением времени.
В этом исследовании была описана надежная методология визуализации живых клеток для измерения и количественного анализа развития грибков, вклю.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была частично поддержана проектом «Греческая исследовательская инфраструктура для визуализации и мониторинга фундаментальных биологических процессов (BioImaging-GR)» (MIS 5002755), который реализуется в рамках акции «Укрепление научно-исследовательской и инновационной инфраструктуры», финансируемой Оперативной программой «Конкурентоспособность, предпринимательство и инновации» (NSRF 2014-2020) и софинансируемой Грецией и ЕС.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| µ-Слайд 8 Лунка | Ibidi | 80826 | Визуализационные слайды |
| 4-Аминобензойная кислота | Merck | A9878 | |
| azhAΔ ngnAΔ | Генотип: zhAΔ::p yrGAf; ngnAΔ::p yrGAf; pyroA4 pantoB100 / Ссылки:Лабораторная коллекция, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
| Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
| Биотин | Merck | B4639 | |
| Хлороформ | Merck | 67-66-3 | |
| Пентагидрат сульфата меди(II) Merck | C8027 | ||
| Глюкоза | Merck | G8270 | |
| GraphPad Prism 8.0 | Программное обеспечение | GraphPad Статистическое программное обеспечение | |
| ImageJ | NIH | Программное обеспечение для обработки и анализа изображений | |
| Петля инокуляции | Merck | I8263-500EA | |
| Фосфат железа(III) | Merck | 1.03935 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Программное обеспечение для микроскопа | |
| Сульфат магния гептагидрат | Merck | 63138 | |
| Моногидрат сульфата марганца(II) Merck | M7899 | ||
| Микроскоп Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Никотинамид (ниацинамид) | Supelco | 47865-U | |
| Пептон | Миллипор | 68971 | |
| Чашки Петри для микробиологической культуры | KISKER | G090 | |
| Хлорид калия | Merck | P4504 | |
| Фосфат калия одноосновной | Merck | P5655 | |
| Пиридоксина гидрохлорид | Merck | P6280 | |
| Quali - Микроцентрифужные пробирки, 1,7 мл, без ДНКазы, РНКазы и пирогенов, стерильные | KISKER | G052-S | |
| Quali - Микроцентрифужные пробирки, 2,0 мл, стерильные | KISKER | G053-S | |
| Quali - Стандартные наконечники, скошенные, 100-1000 и микро; L | KISKER | VL004G | |
| Quali - Стандартные наконечники, скошенные, 1-200 и микро; L | KISKER | VL700G | |
| Микрообъемные наконечники Quali, без ДНКазы, РНКазы, 0,1-10 и микро; L/прозрачный | KISKER | GC. СОВЕТЫ. B | |
| Рибофлавин (B2) | Supelco | 47861 | |
| Лезвия для скальпеля No 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
| Хлорид натрия | Merck | S7653 | |
| Гидроксид натрия | Merck | S8045 | |
| Тетраборат натрия декагидрат | Merck | S9640 | |
| VS151 (PilA-GFP и H1-mRFP) | Генотип: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / Ссылки:Лабораторная коллекция, Бираци и др., 2021 | ||
| WT | Генотип: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4; pyrG89 / Ссылки: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
| Дрожжевой экстракт | Millipore | 70161 | |
| ZnSO4 |
Ссылки
- Kumar, A. Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications. International Journal of Microbiology. 2020, 8894215(2020).
- Kück, U., Bloemendal, S., Teichert, I.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
