Анализ мокроты с контролем качества с помощью проточной цитометрии

Краткое содержание

Этот протокол описывает эффективный метод диссоциации мокроты на одноклеточную суспензию и последующую характеристику клеточных подмножеств на стандартных проточных цитометрических платформах.

Аннотация

Мокрота, широко используемая для изучения клеточного содержания и других микроокружающих особенностей для понимания здоровья легких, традиционно анализируется с использованием методологий, основанных на цитологии. Его полезность ограничена, потому что чтение слайдов отнимает много времени и требует узкоспециализированного персонала. Кроме того, обширный мусор и наличие слишком большого количества плоских эпителиальных клеток (STEC) или клеток щек часто делают образец неадекватным для диагностики. Напротив, проточная цитометрия позволяет осуществлять высокопроизводительное фенотипирование клеточных популяций, одновременно исключая мусор и СЭК.

Протокол, представленный здесь, описывает эффективный метод диссоциации мокроты на одну клеточную суспензию, окрашивания антител и фиксации клеточных популяций, а также получения образцов на проточной цитометрической платформе. Здесь представлена стратегия гатинга, которая описывает исключение мусора, мертвых клеток (включая SEC) и дублетов клеток. Кроме того, эта работа также объясняет, как анализировать жизнеспособные одиночные клетки мокроты на основе кластера дифференцировки (CD) 45 положительных и отрицательных популяций для характеристики подмножеств кроветворной и эпителиальной линии. Мера контроля качества также обеспечивается путем идентификации специфических для легких макрофагов в качестве доказательства того, что образец получен из легкого и не является слюной. Наконец, было продемонстрировано, что этот метод может быть применен к различным цитометрическим платформам путем предоставления профилей мокроты от одного и того же пациента, проанализированных на трех проточных цитометрах; Navios EX, LSR II и Lyric. Кроме того, этот протокол может быть модифицирован для включения дополнительных клеточных маркеров, представляющих интерес. Здесь представлен метод анализа целого образца мокроты на проточной цитометрической платформе, что делает мокроту пригодной для разработки высокопроизводительной диагностики заболеваний легких.

Введение

Технические достижения в аппаратном и программном обеспечении проточных цитометров позволили идентифицировать множество различных клеточных популяций одновременно1,2,3,4. Например, использование проточного цитометра в исследованиях гемопоэтических клеток привело к гораздо лучшему пониманию иммунной ^{системы2} и клеточной иерархии кроветворной ^{системы5}, а также к диагностическому различию множества различных видов рака ^{крови6,7,8}

Протокол

Все этапы обработки мокроты выполняются в шкафу биологической безопасности с соответствующими средствами индивидуальной защиты.

1. Подготовка реагентов перед началом диссоциации мокроты

1. Разморозьте 1% параформальдегида (PFA), 25 мл на образец на льду, и держите холодным до использования.
   ВНИМАНИЕ: PFA токсичен при вдыхании и контакте с кожей. Приготовьте фиксатор в соответствии с инструкциями производителя и заморозьте при -20 °C в 25 мл аликвот до использования.
2. Приблизите массу образца и разморожите достаточно 0,1% дитиотрейтола (DTT) для шага 2,2 и доведите его до 37 °C. (Аликвоты DTT следует хранить при -20 °C пе....

Результаты

Этот протокол был разработан с учетом клинических лабораторных условий. При разработке протокола основное внимание уделялось простоте, эффективности и воспроизводимости. Было установлено, что самым трудоемким этапом в обработке мокроты был подсчет клеток. Поэтому протокол настроен таким образом, что обработка мокроты и маркировка клеток могут выполняться независимо от подсчета клеток без потери времени. Точный подсчет клеток, который все еще необходим для надлежащего разбавления образца для беспрепятственного запуска, за.......

Обсуждение

Клеточное содержание мокроты включает в себя большое разнообразие обширных клеток, часто сопровождающихся большим количеством ^{мусора37}. Кроме того, анализ мокроты требует контроля качества, который подтверждает, что образец взят из легкого, а не из ротовой ^{полости38}. Поэтому проанализировать мокроту с помощью проточной цитометрии не так просто, как, например, для крови, которая выделяет гораздо более чистую и однородную клеточную суспензию. Этот протокол решает все эти вопр.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1% параформальдегид Flow-Fix	Polysciences	25037
100 &; M нейлоновые клеточные фильтры, Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M NaOH	EMD	SX0593-1
50 мл коническая соколиная трубка	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 античеловеческий CD19	BioLegend	302219
Alexa488 античеловеческий CD3	BioLegend	300415
Alexa488 античеловеческий цитокератин	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK, CD3 и CD19 изотип	BioLegend	400129
BV510 античеловеческий CD45	BioLegend	304036
CD66b FITC изотип	BD Biosciences	555748
компенсационные бусины CompBead Plus компенсационные бусины	BD Biosciences	560497
Corning полистирол одноразовый стерильный флакон 250 мл	Fisher Scientific	09-761-4
Corning Полистирол одноразовый стерильный флакон 500 мл	Fisher Scientific	09-761-10
CS& Т-образные бусины	BD Biosciences	655051
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
FITC античеловеческий CD66b	GeneTex	GTX75907
Поправляемое окрашивание жизнеспособности	BD Biosciences	564406
FlowCheck	Beckman Coulter	A69183
FlowSet	Beckman Coulter	A69184
HBSS	Fisher Scientific	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
NIST Бусины, 05 μ M	Polysciences	64080
Бусины NIST, 20 μ M	Polysciences	64160
NIST Бусины, 30 μ M	Polysciences	64170
PE античеловеческий CD45	BioLegend	304039
PE-CF594 античеловеческий EpCAM	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM изотип	BD Biosciences	562292
PE-CR594 античеловеческий CD206	BD Biosciences	564063
дигидрат цитрата натрия EMD		SX0445-1
Раствор трипана синего, 0,4%	Fisher Scientific	15250061