Выделение ядер и микроскопия структурированного освещения сверхвысокого разрешения для изучения изменений нуклеопоринов при нейродегенерации человека

Alyssa N. Coyne; Jeffrey D. Rothstein

doi:10.3791/62789

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение ядер и микроскопия структурированного освещения сверхвысокого разрешения для изучения изменений нуклеопоринов при нейродегенерации человека

1.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62789

⸱

10 сентября 2021 г.

Alyssa N. Coyne¹^,² , Jeffrey D. Rothstein¹^,²

¹Brain Science Institute, Johns Hopkins University School of Medicine, ²Department of Neurology, Johns Hopkins University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает оптимизированный рабочий процесс выделения ядер и структурированной световой микроскопии со сверхвысоким разрешением для оценки отдельных нуклеопоринов в нуклеоплазме и NPC в индуцированных нейронах, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, и посмертных тканях человека.

Аннотация

Ядерный поровый комплекс (NPC) представляет собой сложную макромолекулярную структуру, состоящую из нескольких копий ~30 различных нуклеопориновых белков (Nups). В совокупности эти Nups функционируют для регуляции организации генома, экспрессии генов и нуклеоцитоплазматического транспорта (NCT). В последнее время дефекты НКТ и изменения в специфических НКП были идентифицированы как ранние и выраженные патологии при множественных нейродегенеративных заболеваниях, включая боковой амиотрофический склероз (БАС), болезнь Альцгеймера (БА)/лобно-височную деменцию (ЛВД) и болезнь Хантингтона (БГ). Достижения как в световой, так и в электронной микроскопии позволяют тщательно исследовать субклеточные структуры, включая NPC и его составляющие Nup, с повышенной точностью и разрешением. Из широко используемых методов микроскопия структурированного освещения (SIM) со сверхвысоким разрешением предоставляет беспрецедентную возможность изучить локализацию и экспрессию отдельных Nups с использованием традиционных стратегий мечения на основе антител. Выделение ядер перед SIM позволяет визуализировать отдельные белки Nup внутри NPC и нуклеоплазмы в полностью и точно реконструированном 3D-пространстве. Этот протокол описывает процедуру выделения ядер и SIM для оценки экспрессии и распределения Nup в клетках ЦНС человека, полученных из iPSC, и в посмертных тканях.

Введение

Распространенность возрастных нейродегенеративных заболеваний увеличивается по мере старения населения¹. В то время как генетические основы и патологические признаки хорошо изучены, точные молекулярные события, приводящие к повреждению нейронов, остаются плохо изученными²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,