Method Article

Выделение ядер и микроскопия структурированного освещения сверхвысокого разрешения для изучения изменений нуклеопоринов при нейродегенерации человека

DOI:

10.3791/62789

⸱

September 10th, 2021

 , 
1Brain Science Institute, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Neurology, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает оптимизированный рабочий процесс выделения ядер и структурированной световой микроскопии со сверхвысоким разрешением для оценки отдельных нуклеопоринов в нуклеоплазме и NPC в индуцированных нейронах, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, и посмертных тканях человека.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ядерный поровый комплекс (NPC) представляет собой сложную макромолекулярную структуру, состоящую из нескольких копий ~30 различных нуклеопориновых белков (Nups). В совокупности эти Nups функционируют для регуляции организации генома, экспрессии генов и нуклеоцитоплазматического транспорта (NCT). В последнее время дефекты НКТ и изменения в специфических НКП были идентифицированы как ранние и выраженные патологии при множественных нейродегенеративных заболеваниях, включая боковой амиотрофический склероз (БАС), болезнь Альцгеймера (БА)/лобно-височную деменцию (ЛВД) и болезнь Хантингтона (БГ). Достижения как в световой, так и в электронной микроскопии позволяют тщательно исследовать субклеточные структуры, включая NPC и его составляющие Nup, с повышенной точностью и разрешением. Из широко используемых методов микроскопия структурированного освещения (SIM) со сверхвысоким разрешением предоставляет беспрецедентную возможность изучить локализацию и экспрессию отдельных Nups с использованием традиционных стратегий мечения на основе антител. Выделение ядер перед SIM позволяет визуализировать отдельные белки Nup внутри NPC и нуклеоплазмы в полностью и точно реконструированном 3D-пространстве. Этот протокол описывает процедуру выделения ядер и SIM для оценки экспрессии и распределения Nup в клетках ЦНС человека, полученных из iPSC, и в посмертных тканях.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Распространенность возрастных нейродегенеративных заболеваний увеличивается по мере старения населения1. В то время как генетические основы и патологические признаки хорошо изучены, точные молекулярные события, приводящие к повреждению нейронов, остаются плохо изученными2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. В последнее время буква G4C2 Экспансия гексануклеотидных повторов в первом интроне гена C9orf72 была идентифицирована как наиболее распространенная генетическая причина связанных с ним нейродегенеративных заболеваний бокового амиотрофического склероза (БАС) и лобно-височной деменции (ЛВД)13,14. В настоящее время несколько исследований подтверждают центральную роль сбоев в механизмах ядерного транспорта, включая ядерные поровые комплексы (NPC) и рецепторы ядерного транспорта (NTR, кариоферины), как возбудителям C9orf72 ALS15,16. В неделящихся клетках мозга крысы скаффолдные нуклеопорины (Nups) чрезвычайно долгоживущие. В результате, сообщалось об изменениях в NPC и NCT во время старения17,18,19,20. Более того, некоторые нуклеопорины или транспортины при мутации связаны с конкретными неврологическими заболеваниями21,22. Например, мутации в Nup62 были связаны с инфантильным двусторонним стриатальным некрозом (IBSN), неврологическим расстройством, поражающим хвостатое ядро и путамен23; мутации в Gle1 были связаны с заболеванием двигательных нейронов плода Синдром летальной врожденной контрактуры-1 (LCCS1)24; и мутации в Аладине являются причиной синдрома ААА25. Изменения функциональной НКТ усугубляются при возрастных нейродегенеративных заболеваниях, таких как БАС, болезнь Хантингтона (БГ) и болезнь Альцгеймера (БА)16,26,27,28,29,30,31. Кроме того, сообщалось, что специфические Nups и NTR являются модификаторами токсичности, опосредованной C9orf72 в Drosophila глаз28 или биохимически модифицировать состояние агрегации связанных с заболеванием белков, таких как FUS и tau27,32,33,34. В совокупности эти ранние исследования позволяют предположить, что измененная НКТ может быть первичным и ранним патологическим признаком БАС и ЛВД. Исследования модельных систем, основанных на сверхэкспрессии, показали, что неправильная локализация специфических Nup и кариоферинов может влиять на NCT16,35,36,37,38. Тем не менее, эти патологические исследования на самом деле не связывают цитоплазматические накопления белков NPC с дефектами в структуре или функции NPC. Например, эта патология может просто отражать нарушение регуляции цитоплазматических пулов белков Nup с незначительным влиянием на состав и функцию NPC. В противоположность этому, недавнее исследование с использованием микроскопии структурированного освещения (SIM) со сверхвысоким разрешением демонстрирует возникновение значительного повреждения самого NPC, характеризующегося снижением специфических уровней Nup в нуклеоплазме и NPC нейронов человека C9orf72 ALS/FTD, что в конечном итоге приводит к изменению функции NPC в качестве раннего инициирующего события в каскадах патогенных заболеваний15.

Прохождение макромолекул между ядром и цитоплазмой регулируется комплексом ядерных пор (NPC). NPC представляет собой большой макромолекулярный комплекс, встроенный в ядерную оболочку, состоящий из нескольких копий 30 нуклеопориновых белков (Nups)39,40,41. Несмотря на то, что стехиометрия Nup варьируется в зависимости от типа клеток 42,43,44, поддержание общего состава NPC имеет решающее значение для NCT, организации генома и общей клеточной жизнеспособности39,41,45,46. В результате, измененный состав NPC и последующие дефекты функционального транспорта, вероятно, повлияют на множество последующих клеточных функций. Nup-составляющие NPC высоко организованы в несколько подкомплексов, включая цитоплазматическое кольцо и филаменты, центральный канал, внешнее кольцо, внутреннее кольцо, трансмембранное кольцо и ядерную корзину. В совокупности каркасные Nups внутреннего, внешнего и трансмембранного колец закрепляют NPC внутри ядерной оболочки и обеспечивают точки привязки для Nups цитоплазматического кольца, центрального канала и ядерной корзины. В то время как малые молекулы (<40-60 кДа) могут пассивно диффундировать через NPC, активный транспорт более крупных грузов облегчается взаимодействием между рецепторами ядерного транспорта (NTR, кариоферинами) и FG Nups цитоплазматических филаментов, центрального канала и ядерной корзины 39,40,41,45. Кроме того, горстка Nup может дополнительно функционировать вне NPC, в нуклеоплазме, регулируя экспрессию генов46,47.

Учитывая, что латеральный размер одного человеческого NPC составляет примерно 100-120 нм40, стандартной широкоугольной или конфокальной микроскопии недостаточно для разрешения отдельных NPC48. Методы электронной микроскопии (ЭМ), такие как ПЭМ или СЭМ, часто используются для оценки общей структуры NPC39,40. Несмотря на преимущества этих методов для определения ультраструктуры NPC, они реже используются для оценки присутствия отдельных белков Nup в NPC. Технические ограничения сочетания мечения на основе антител или меток с этими современными технологиями, TEM и SEM, не всегда позволяют точно и надежно оценить отдельные Nups в NPC или нуклеоплазме. Кроме того, эти методы могут быть технически сложными и еще не широко доступны для всех исследователей. Тем не менее, последние достижения в области световой и флуоресцентной микроскопии повысили доступность технологий визуализации со сверхвысоким разрешением. В частности, SIM предоставляет беспрецедентную возможность получать изображения отдельных Nups с разрешением, которое приближается к боковым размерам одного человеческого NPC 40,48,49,50,51. В отличие от других подходов со сверхвысоким разрешением, таких как стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (STORM) и вынужденное истощение излучения (STED), SIM совместима с обычным иммуноокрашиванием на основе антител49. Таким образом, SIM позволяет провести всесторонний анализ всех Nup, для которых доступно конкретное антитело Nup. Возможность отбора и визуализации нескольких различных Nup в одном и том же препарате дает значительные преимущества по сравнению с другими методами визуализации при исследовании многих белков, составляющих NPC. В данной процедуре подробно описан оптимизированный протокол оценки отдельных Nup-компонентов NPC с использованием ядер, выделенных из нейронов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), и посмертных тканей центральной нервной системы (ЦНС) человека.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все образцы крови для получения iPSC и забора аутопсированных тканей одобрены IRB Университета Джонса Хопкинса под этическим надзором Университета Джонса Хопкинса. Вся информация о пациенте соответствует требованиям HIPPA. Следующий протокол соответствует всем процедурам биобезопасности Университета Джонса Хопкинса.

1. Подготовка предметных стекол для иммуноокрашивания и визуализации

  1. Поместите положительно заряженный стеклянный микроскоп в пустую цитоворонку и нарисуйте круг с помощью гидрофобной барьерной ручки, чтобы очертить область для отложения ядер.
  2. Добавьте 50 мкл раствора коллагена 1 мг/мл (разбавленного в 1x PBS) в центр круга, нарисованного на шаге 1.1, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 минут.
  3. Отсадите раствор коллагена и дайте предметным стеклам высохнуть на воздухе при комнатной температуре в течение примерно 1 часа.

2. Приготовление лизисного буфера и градиентов сахарозы

  1. Приготовьте буфер для лизиса и градиент сахарозы в соответствии с протоколом набора для выделения ядер.
    1. Для каждого образца приготовьте коническую пробирку объемом 50 мл буфера для лизиса, смешав 11 мл поставляемого буфера для лизиса, 110 мкл входящего в него 10% раствора Triton X-100 и 11 мкл свежеприготовленного или размороженного 1 М DTT (дитиотреит).
    2. Для каждого образца используют коническую пробирку объемом 50 мл для приготовления раствора подушки сахарозы 1,85 М путем смешивания 27,75 мл прилагаемого раствора подушки сахарозы 2 мкл, 2,25 мл входящего в комплект буфера для подушки сахарозы и 30 мкл свежеприготовленного или размороженного 1 М DTT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор сахарозной подушки 1,85 М оптимален для iPSN и посмертной ткани ЦНС человека, но корректирует его для других типов клеток или образцов тканей. Недавнобыли опубликованы дополнительные сведения о клетках HEK293, астроцитах, полученных из iPSC, и обогащении ядер олигодендроцитов из посмертных тканей ЦНС.
  2. Аккуратно перемешайте буфер для лизиса и растворы подушки сахарозы, перевернув конические трубки, и храните на льду.

3. Лизис iPSN и посмертная ткань ЦНС человека

  1. Прежде чем приступить к лизису, поместите ротор ультрацентрифуги (без держателей образцов) в ультрацентрифугу и дайте ему предварительно остыть до 4 °C.
  2. Лизис iPSNs.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протоколы лизиса различаются для iPSN и посмертной ткани ЦНС человека. Следуйте протоколу для указанного ниже типа образца (шаг 3.2: iPSNs, шаг 3.3: посмертная ткань ЦНС человека).
    1. Извлеките iPSN из инкубатора и аспирируйте среду. Коротко промойте 1x PBS и добавьте буфер для лизиса непосредственно в лунку или планшет.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь о том, чтобы правильно промыть iPSN достаточным количеством 1x PBS для удаления мусора и мертвых клеток. Объем буфера для лизиса, добавляемого в планшеты iPSN, будет варьироваться. Пожалуйста, обратитесь к таблице 1. Убедитесь, что исходным материалом является >2,5 миллиона iPSN.
    2. Соскребите iPSN скребком для клеток и перенесите их в оставшийся буфер для лизиса в конической пробирке объемом 50 мл.
    3. Закройте каждую коническую пробирку и поместите образцы на 20 с, чтобы облегчить лизис iPSN.
    4. Дайте образцам постоять на льду в течение 1-2 минут, прежде чем продолжить.
  3. Лизис посмертных тканей ЦНС человека.
    1. Взвесьте ~100 мг замороженной посмертной ткани ЦНС человека, разрезав лезвием бритвы в чашке Петри, помещенной на слой сухого льда. Обязательно работайте на поверхности, окруженной одноразовыми прокладками, чтобы избежать локального загрязнения тканей. Обратите внимание на конкретные расслоения серого вещества в сравнении с белым веществом (например, кортикальная мантия в сравнении с подлежащим белым веществом), видимые во время рассечения тканей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с замороженными образцами человеческих тканей носите соответствующие СИЗ, включая средства защиты глаз и перчатки. Этот этап также может быть выполнен заранее, и тканевые аликвоты могут храниться при температуре -80 °C. 50 мг является достаточным количеством для выделения ядер. Тем не менее, более 100 мг ткани часто приводит к неполной изоляции ядер, о чем свидетельствует наличие интактной цитоплазмы, окружающей некоторые ядра.
    2. Приготовьте гомогенизатор Dounce, очистив и тщательно промыв дистиллированной водой. Охладите гомогенизатор, положив его на лед.
    3. Добавьте 100 мг ткани в свежеочищенный, промытый и охлажденный (на льду) гомогенизатор Dounce, содержащий 2 мл приготовленного буфера для лизиса.
    4. Гомогенизация в гомогенизаторе Dounce с помощью стандартной процедуры на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, 10-20 ударов на пестик достаточно, чтобы пройти через образец без сопротивления.
    5. Перенесите 2 мл посмертного гомогената человеческого мозга в оставшиеся 9 мл буфера для лизиса в конических пробирках.
    6. Энергично взбейте вортекс в течение 30 с и дайте ему посидеть на льду в течение 5 минут, чтобы облегчить лизис.

4. Выделение ядер из iPSN и посмертной ткани ЦНС человека

  1. Нанесите слой на 10 мл 1,85 М раствора сахарозы (выполненного на шаге 2.1.2) на дно ультрацентрифужной пробирки и добавьте 18 мл 1,85 М раствора сахарозы в каждый лизат.
  2. Аккуратно перемешайте раствор лизата/сахарозы (объединенный на шаге 4.1), перевернув коническую пробирку объемом 50 мл.
  3. Медленно добавьте 28 мл смеси раствора лизата и сахарозы в верхнюю часть 10 мл 1,85 М раствора сахарозы в ультрацентрифужной пробирке (из шага 4.1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В конической пробирке объемом 50 мл содержится в общей сложности 29 мл смеси лизата и сахарозы в конической пробирке (шаги 4.1-4.2). Оставьте 1 мл этой смеси лизата и сахарозы в конической пробирке объемом 50 мл. Это обеспечивает точное и стабильное пипетирование среди всех образцов благодаря вязкости раствора подушки сахарозы.
  4. Поместите ультрацентрифужные пробирки в держатели и добавьте дополнительно 1,85 М раствор сахарозы (см. шаг 2.1.2) по мере необходимости, чтобы сбалансировать образцы.
  5. Поместите держатели образцов в ротор охлаждаемой ультрацентрифуги и вращайте при температуре 30 000 x g, 4 °C в течение 45 минут.
  6. Извлеките ультрацентрифужные пробирки из держателей образцов и выбросьте надосадочную жидкость. Ядра будут видны в виде гранул на нижних сторонах ультрацентрифужной пробирки.
  7. Ресуспендируйте гранулы ядер в 1 мл поставляемого буфера для хранения ядер путем вортексирования и перенесите в микроцентрифужную пробирку.
  8. Центрифугируйте микроцентрифужные пробирки при температуре 2 500 x g, 4 °C в течение 5 минут.
  9. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте ядра путем вортексирования в свежем 1 мл предоставленного буфера для хранения ядер.
  10. Приступайте к иммуноокрашиванию или храните ядра при температуре -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ядра могут храниться при температуре -80 °C до 6 месяцев и подвергаться двум циклам замораживания/оттаивания, прежде чем структурная целостность будет нарушена.

5. Иммуноокрашивание выделенных ядер

  1. Возьмите аликвоту 10 мкл суспензии ядер и подсчитайте с помощью гемацитометра или автоматического счетчика клеток.
  2. Соберите подготовленные предметные стекла (с шага 1.3) в цитоворонки.
  3. В каждую цитоворонку наносится слой 200 мкл буфера для хранения свежих ядер и ~100 000 ядер.
  4. Аккуратно вращайте ядра на предметных стеклах, поместив цитоворонки в цитоспин и центрифугируя в течение 3 минут при 100 x g.
  5. Отсоедините цитоворонки и немедленно добавьте ~100 мкл 4% PFA (параформальдегида) в предметные стекла и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ядра также могут быть зафиксированы метанолом. Используйте метод фиксации, подходящий для каждого антитела. При использовании метанола пропустите этап пермеабилизации (5.7). Цитоворонки бывают одноразовыми; Выбросьте их на этом этапе.
  6. Промойте ядра 3 раза в течение 5 минут 1x PBS.
  7. Пермеабилизируйте ядра 0,1% Triton X-100 в 1x PBS в течение 10 минут при комнатной температуре.
  8. Заблокируйте ядра в блочном растворе (10% сыворотка козы или осла в 1x PBS) на 30 минут при комнатной температуре.
  9. Инкубируйте ядра с первичными антителами, разведенными в блочном растворе, в течение ночи при 4 °С.
  10. Промойте ядра 3 раза в течение 5 минут 1x PBS.
  11. Инкубировать ядра со вторичными антителами, разведенными в блочном растворе в течение 1 ч при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вторичные антитела Alexa Fluor 488, 568 и 647 являются предпочтительными.
  12. Промойте ядра 3 раза в течение 5 минут 1x PBS.
  13. ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Инкубируйте ядра в течение 5 минут с помощью DAPI или Hoechst, а затем выполните два дополнительных 5-минутных промывки с помощью 1x PBS.
  14. Держите безворсовую салфетку на краю круга, содержащего ядра, чтобы полностью удалить последний раствор PBS.
  15. Добавьте 1 каплю (~10 μл) жесткого монтажного носителя с защитой от выцветания (без DAPI) на каждый слайд и аккуратно установите квадратные покровные стекла с высоким допуском 18 мм x 18 мм на каждый слайд.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании жесткого носителя герметичность слайдов не требуется, если изображения слайдов выполняются в течение соответствующего периода времени. Иммунореактивность Nup обычно остается стабильной на незапечатанных предметных стеклах, хранящихся при температуре 4 °C в течение ~6 месяцев. Тем не менее, края покровного стекла могут быть запечатаны тонким слоем лака для ногтей, если используется носитель для влажного монтажа или при длительном хранении.
  16. Держите предметные стекла в защищенном от света месте и дайте им застыть в течение ночи при комнатной температуре.
  17. Получить изображение ядер можно с помощью микроскопии структурированного освещения (SIM) со сверхвысоким разрешением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Zeiss, Nikon и GE Healthcare производят SIM-микроскопы. Следуйте системным протоколам получения и обработки изображений. Используйте параметры визуализации (мощность лазера, наборы фильтров, время экспозиции), подходящие для каждого Nup и флуорофора. При визуализации следует избегать краев круга (начиная с шага 1.1), так как эти ядра обычно сплющены и разбросаны в результате этапа центрифугирования (5.4). Полностью деконволютированные и обработанные изображения могут быть подвергнуты ряду анализов, включая обнаружение пятен и измерение объема с помощью стандартных модулей 3D-анализа в программном обеспечении для анализа изображений FIJI или Imiris. Дополнительные сведения о методах анализа были недавно опубликованы15.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для изучения NPC и нуклеоплазматического распределения и экспрессии POM121 в ядрах нейронов человека контрольные и C9orf72 iPSN были дифференцированы, как описано ранее15. Посмертные моторные коры головного мозга человека и iPSN на 32-й день были лизированы и подвергнуты выделению ядер и иммуноокрашиванию, как описано выше. NeuN-положительные изолированные ядра визуализировали с помощью микроскопии структурированного освещения (SIM) со сверхвысоким разрешением с использованием микроскопа со структ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Учитывая недавнее выявление дефицита НКТ как раннего и заметного явления при множественных нейродегенеративных заболеваниях 16,27,28,30,31, существует острая необходимость в тщательном изучении механизма, с помощью которого возникает эта патология. Поскольку NPC и его отдельные белки Nup критически контролируют функциональный ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Посмертные ткани ЦНС человека были предоставлены банком аутопсии БАС Университета Джона Хопкинса и ядром посмертной ткани Target ALS. Эта работа была поддержана стипендией ALSA Milton Safenowitz Postdoctoral Fellowship (ANC), а также финансированием от NIH-NINDS, Министерства обороны, Ассоциации ALS, Ассоциации мышечной дистрофии, F Prime, Центра Роберта Паккарда по исследованию БАС Answer ALS Program и Chan Zuckerberg Initiative.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
50 мл конические пробиркиFisher Scientific14-959-49A
Ультрацентрифуга BeckmanCoulter
Cell скребкиSarstedt83.183
CollagenAdvanced Biomatrix5005
CoverslipsMatTekPCS-170-1818
CytofunnelThermo Fisher Scientific
Cytospin 4Fisher ScientificA78300003
Dounce гомогенизаторыDWK Life Sciences357542
DTTSigma AldrichD0632
Eppendorf tubesFisher Scientific05-408-129
Goat Anti-Chicken Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21449
Козий анти-мышь Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11029
Козий анти-мышь Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11031
Козий анти-мышь Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21236
Козий антикролик Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11034
Козий антикролик Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11036
Козья антикрыса Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21245
Козья антикрыса Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11006
Козья антикрыса Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11077
Козья антикрыса Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21247
ГемацитометрFisher Scientific267110
Предметные стекла для микроскопаFisher Scientific12-550-15
Нормальная козья сывороткаВектор LabsS-1000
Nuclei PURE Prep Набор для выделения ядерSigma AldrichNUC201содержит буфер для лизиса, 10% тритон X-100, 2 м градиент сахарозы, раствор подушки сахарозы и буфер для хранения ядер; Упоминается в протоколе как «набор для выделения ядер»
PBSThermo Fisher Scientific10010023
PFAElectron Microscopy Sciences15714-S
Prolong Gold AntifadeInvitrogenP36930Упоминается в протоколе как «жесткое крепление для защиты от выцветания»
SW 32 Ti Ultracentrifuge RotorBeckman Coulter369694Упоминается в протоколе как «ультрацентрифужный ротор»
Triton X-100Sigma AldrichT9284
Trypan BlueThermo Fisher Scientific15-250-061
ультрацентрифужные пробиркиBeckman Coulter344058
первичные антителануклеопоринаПервичные антитела, подходящие для иммунофлуоресцентного обнаружения индивидуальных нуклеопоринов, доступны от нескольких компаний.
A78710020

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hou, Y., et al. Ageing as a risk factor for neurodegenerative disease. Nature Reviews. Neurology. 15 (10), 565-581 (2019).
  2. Kim, G., Gautier, O., Tassoni-Tsuchida, E., Ma, X. R., Gitler, A. D. ALS genetics: Gains, losses, and implications for future therapies. Neuron. 108 (5), 822-842 (2020).
  3. Bang, J., Spina, S., Miller, B. L. Frontotemporal dementia. Lancet. 386 (10004), 1672-1682 (2015).
  4. Blauwendraat, C., Nalls, M. A., Singleton, A. B. The genetic architecture of Parkinson's disease. The Lancet Neurology. 19 (2), 170-178 (2020).
  5. Cacace, R., Sleegers, K., Van Broeckhoven, C. Molecular genetics of early-onset Alzheimer's disease revisited. Alzheimer's & Dementia. 12 (6), 733-748 (2016).
  6. Di Resta, C., Ferrari, M. New molecular approaches to Alzheimer's disease. Clinical Biochemistry. 72, 81-86 (2019).
  7. Karch, C. M., Cruchaga, C., Goate, A. M. Alzheimer's disease genetics: from the bench to the clinic. Neuron. 83 (1), 11-26 (2014).
  8. Kovacs, G. G. Molecular pathology of neurodegenerative diseases: principles and practice. Journal of Clinical Pathology. 72 (11), 725-735 (2019).
  9. McColgan, P., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: a clinical review. European Journal of Neurology. 25 (1), 24-34 (2018).
  10. Ross, C. A., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment. The Lancet. Neurology. 10 (1), 83-98 (2011).
  11. Dugger, B. N., Dickson, D. W. Pathology of neurodegenerative diseases. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (7), 028035(2017).
  12. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, Suppl 10-17 (2004).
  13. DeJesus-Hernandez, M., et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron. 72 (2), 245-256 (2011).
  14. Renton, A. E., et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron. 72 (2), 257-268 (2011).
  15. Coyne, A. N., et al. G(4)C(2) repeat RNA initiates a POM121-mediated reduction in specific nucleoporins in C9orf72 ALS/FTD. Neuron. 107 (4), 1124-1140 (2020).
  16. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 56-61 (2015).
  17. D'Angelo, M. A., Raices, M., Panowski, S. H., Hetzer, M. W. Age-dependent deterioration of nuclear pore complexes causes a loss of nuclear integrity in postmitotic cells. Cell. 136 (2), 284-295 (2009).
  18. Hetzer, M. W. The role of the nuclear pore complex in aging of post-mitotic cells. Aging (Albany NY). 2 (2), 74-75 (2010).
  19. Savas, J. N., Toyama, B. H., Xu, T., Yates, J. R., Hetzer, M. W. Extremely long-lived nuclear pore proteins in the rat brain. Science. 335 (6071), 942(2012).
  20. Toyama, B. H., et al. Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures. Cell. 154 (5), 971-982 (2013).
  21. Nofrini, V., Di Giacomo, D., Mecucci, C. Nucleoporin genes in human diseases. European Journal of Human Genetics. 24 (10), 1388-1395 (2016).
  22. Sakuma, S., D'Angelo, M. A. The roles of the nuclear pore complex in cellular dysfunction, aging and disease. Seminars in Cell & Developmental Biology. 68, 72-84 (2017).
  23. Basel-Vanagaite, L., et al. Mutated nup62 causes autosomal recessive infantile bilateral striatal necrosis. Annals of Neurology. 60 (2), 214-222 (2006).
  24. Nousiainen, H. O., et al. Mutations in mRNA export mediator GLE1 result in a fetal motoneuron disease. Nature Genetics. 40 (2), 155-157 (2008).
  25. Cronshaw, J. M., Matunis, M. J. The nuclear pore complex: disease associations and functional correlations. Trends in Endocrinology and Metabolism. 15 (1), 34-39 (2004).
  26. Chou, C. C., et al. TDP-43 pathology disrupts nuclear pore complexes and nucleocytoplasmic transport in ALS/FTD. Nature Neuroscience. 21 (2), 228-239 (2018).
  27. Eftekharzadeh, B., et al. Tau protein disrupts nucleocytoplasmic transport in Alzheimer's disease. Neuron. 99 (5), 925-940 (2018).
  28. Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 129-133 (2015).
  29. Gasset-Rosa, F., et al. Polyglutamine-expanded huntingtin exacerbates age-related disruption of nuclear integrity and nucleocytoplasmic transport. Neuron. 94 (1), 48-57 (2017).
  30. Grima, J. C., et al. Mutant huntingtin disrupts the nuclear pore complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
  31. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
  32. Guo, L., et al. Nuclear-import receptors reverse aberrant phase transitions of RNA-binding proteins with prion-like domains. Cell. 173 (3), 677-692 (2018).
  33. Hofweber, M., et al. Phase Separation of FUS Is Suppressed by Its Nuclear Import Receptor and Arginine Methylation. Cell. 173 (3), 706-719 (2018).
  34. Yoshizawa, T., et al. Nuclear Import Receptor Inhibits Phase Separation of FUS through Binding to Multiple Sites. Cell. 173 (3), 693-705 (2018).
  35. Chew, J., et al. Aberrant deposition of stress granule-resident proteins linked to C9orf72-associated TDP-43 proteinopathy. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 9(2019).
  36. Zhang, Y. J., et al. Poly(GR) impairs protein translation and stress granule dynamics in C9orf72-associated frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis. Nat Medicine. 24 (8), 1136-1142 (2018).
  37. Zhang, Y. J., et al. C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins. Nature Neuroscience. 19 (5), 668-677 (2016).
  38. Zhang, Y. J., et al. Heterochromatin anomalies and double-stranded RNA accumulation underlie C9orf72 poly(PR) toxicity. Science. 363 (6428), (2019).
  39. Beck, M., Hurt, E. The nuclear pore complex: understanding its function through structural insight. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (2), 73-89 (2017).
  40. Lin, D. H., Hoelz, A. The structure of the nuclear pore complex (an update). Annual Review of Biochemistry. 88, 725-783 (2019).
  41. Raices, M., D'Angelo, M. A. Nuclear pore complex composition: a new regulator of tissue-specific and developmental functions. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (11), 687-699 (2012).
  42. Kinoshita, Y., Kalir, T., Dottino, P., Kohtz, D. S. Nuclear distributions of NUP62 and NUP214 suggest architectural diversity and spatial patterning among nuclear pore complexes. PLoS One. 7 (4), 36137(2012).
  43. Ori, A., et al. Cell type-specific nuclear pores: a case in point for context-dependent stoichiometry of molecular machines. Molecular Systems Biology. 9, 648(2013).
  44. Rajoo, S., Vallotton, P., Onischenko, E., Weis, K. Stoichiometry and compositional plasticity of the yeast nuclear pore complex revealed by quantitative fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), 3969-3977 (2018).
  45. Li, C., Goryaynov, A., Yang, W. The selective permeability barrier in the nuclear pore complex. Nucleus. 7 (5), 430-446 (2016).
  46. Raices, M., D'Angelo, M. A. Nuclear pore complexes and regulation of gene expression. Current Opinion in Cell Biology. 46, 26-32 (2017).
  47. Pascual-Garcia, P., Capelson, M. Nuclear pores in genome architecture and enhancer function. Current Opinion in Cell Biology. 58, 126-133 (2019).
  48. Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
  49. Maglione, M., Sigrist, S. J. Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences. Nature Neuroscience. 16 (7), 790-797 (2013).
  50. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative superresolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  51. Wu, Y., Shroff, H. Faster, sharper, and deeper: structured illumination microscopy for biological imaging. Nature Methods. 15 (12), 1011-1019 (2018).
  52. Hampoelz, B., et al. Pre-assembled nuclear pores insert into the nuclear envelope during early development. Cell. 166 (3), 664-678 (2016).
  53. Hampoelz, B., et al. Nuclear pores assemble from nucleoporin condensates during oogenesis. Cell. 179 (3), 671-686 (2019).
  54. Agote-Aran, A., et al. Spatial control of nucleoporin condensation by fragile X-related proteins. The EMBO Journal. 39 (20), 104467(2020).
  55. Colombi, P., Webster, B. M., Fröhlich, F., Lusk, C. P. The transmission of nuclear pore complexes to daughter cells requires a cytoplasmic pool of Nsp1. The Journal of Cell Biology. 203 (2), 215-232 (2013).
  56. Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).
  57. Löschberger, A., Franke, C., Krohne, G., van de Linde, S., Sauer, M. Correlative super-resolution fluorescence and electron microscopy of the nuclear pore complex with molecular resolution. Journal of Cell Science. 127, Pt 20 4351-4355 (2014).
  58. Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. Journal of Cell Science. 125, Pt 3 570-575 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Nuclei IsolationStructured Illumination MicroscopyNuclear Pore ComplexNucleoporin AlterationsNucleocytoplasmic TransportSuper Resolution MicroscopyHuman NeurodegenerationiPSC Derived CNS CellsAntibody LabelingPostmortem Tissues
Video Coming Soon

Related Articles