Методическая статья

Измерение митохондриальных комплексов переноса электронов в ранее замороженной сердечной ткани от потомства свиноматки: модель для оценки изменений митохондриальной биоэнергетики, вызванных физической нагрузкой

DOI:

10.3791/62809

⸱

16 августа 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1AdventHelath, 2University of Illinois Chicago School of Public Health, 3Lincoln Memorial University, 4Children’s Mercy Hospital, 5Scripps Clinic, 6Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 7Kansas City University, 8Roblex Rex Veterans Affairs Medical Center, 9California State University San Marcos, 10East Carolina University, 11Massachusetts Institute of Technology, 12Boehringer Ingelheim Norway KS, 13Heartland Center for Mitochondrial Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подготовка образцов, обогащенных митохондриями, из ранее замороженных архивных твердых тканей позволила исследователям выполнить как функциональные, так и аналитические оценки митохондрий в различных экспериментальных модальностях. Это исследование демонстрирует, как готовить обогащенные митохондриями препараты из замороженной сердечной ткани и выполнять аналитические оценки митохондрий.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Профиль митохондриального комплекса переноса электронов (ETC) модифицируется в сердечной ткани потомства, рожденного от тренированной свиноматки. Предложенная и проверенная гипотеза заключалась в том, что регулярное материнское упражнение свиноматки во время беременности повысит митохондриальную эффективность биоэнергетики сердца потомства. Эта гипотеза была проверена путем выделения митохондрий с использованием процедуры мягкой изоляции для оценки митохондриальных внеземных и суперкомплексных профилей. Описанная здесь процедура позволила обработать ранее замороженные архивные ткани сердца и исключила необходимость подготовки свежих митохондрий для оценки митохондриальных комплексов внеземных цивилизаций, суперкомплексов и сложных профилей активности внеземных цивилизаций. Этот протокол описывает оптимальное измерение белкового комплекса ETC в мультиплексированном иммуноблоттинге на основе антител и суперсложную оценку с использованием электрофореза синего геля.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель этого протокола состояла в том, чтобы предоставить подробные шаги для получения обогащенного митохондриями препарата из ранее замороженной сердечной ткани с новой технологией низкоэнергетического механического разрушения ткани, которая улучшает лизис тканей и извлечение митохондрий. При этом методе повышается эффективность экстракции без создания высокого напряжения сдвига или высокой температуры и достигается короткое время гомогенизации (10-12 с)1.

Получение митохондрий из архивной замороженной ткани является ценным активом для выполнения как функциональных2 , так и биохимических исследований3, которые в противном случае нелегко повторить в точных экспериментальных условиях. Классический гомогенизатор стекла Potter-Elvehjem Teflon pestle или гомогенизатор Dounce использовался и до сих пор используется в исследовательских лабораториях для гомогенизации мягких тканей, таких как печень, почки и мозг. Тем не менее, гомогенизация твердых тканей, таких как мышцы и сердце, требует большего времени гомогенизации, ферментной обработки, высокоскоростной гомогенизации и обширного пользовательского опыта. Это невыгодно для извлечения интактных органелл, таких как митохондрии, из твердых тканей, таких как мышцы и сердце. Способ, описанный в этом протоколе, используется для получения высокопродуктивного обогащенного митохондриями препарата для анализа белковых комплексов митохондриальной электронной транспортной цепи (ETC) и их суперкомплексного образования в тканях сердца, собранных от потомства, рожденного от тренируемой и сидячей свиноматки, замороженного в жидком азоте и хранящегося при -80 °C для будущего использования. Этот метод позволяет пользователю изолировать обогащенный митохондриями препарат из ранее замороженных архивных тканей.

Внешнее воздействие наноматериалов на беременных грызунов может негативно повлиять на сердечную функцию и митохондриальное дыхание и биоэнергетику на потомство во время беременности4. Тем не менее, вызванные аэробными упражнениями положительные изменения в биоэнергетике миоцитов плода во время беременности еще предстоит задокументировать. Тем не менее, новые исследования свидетельствуют о том, что материнские аэробные упражнения во время беременности оказывают положительное влияние на сердечную функцию плода5. Чтобы предоставить дополнительные доказательства, был проведен анализ продольного воздействия материнских упражнений на митохондриальные комплексы дыхательной цепи сердца потомства (т.е. комплекс I через комплекс V) во время беременности.

Это исследование имеет важное значение для здоровья, поскольку результаты могут свидетельствовать о том, что материнские физические упражнения улучшают эффективность производства энергии в сердечных митохондриях потомства потомства. В этом исследовании свиноматки (самки свиней) использовались в качестве животной модели по двум причинам: (i) физиология сердца аналогична человеческой6, и (ii) сбор сердечной ткани у потомства из разных временных периодов возможен при институциональном одобрении IACUC. Предлагаемое исследование направлено на то, чтобы ответить на многие фундаментальные вопросы, связывающие материнские физические упражнения и их потенциальное положительное влияние на клеточный и биохимический состав сердечной ткани потомства. Этот подход требует мягких, но эффективных методов выделения митохондрий из ранее замороженной сердечной ткани, полученных в результате длительных и дорогостоящих продольных исследований, которые рассматривали вопросы биоэнергетических изменений в сердечных миоцитах плода во время беременности. Метод, описанный в данном исследовании, позволяет использовать большие суммы ранее замороженной архивной ткани для обогащенной митохондриями подготовки как для аналитических, так и для функциональных исследований. Исследование также поможет заполнить пробел в знаниях в этой области, предоставив предварительные данные, которые могут привести к будущим исследованиям, определяющим влияние материнских упражнений на здоровье сердца в утробе матери и за ее пределами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Замороженные сердечные ткани потомства были получены от доктора Шона Ньюкомера вместе с письмом об одобрении IACUC. Ткани сердца были получены в результате долгосрочного продольного исследования, заморожены во флеш-фазе в жидком азоте и сохранены при -80 °C для будущего использования. Все протоколы, касающиеся обработки сердечной ткани потомства, соответствовали рекомендациям комитетов IBC Университета Канзас-Сити и IACUC.

1. Подготовка буферов и реагентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте все образцы в соответствии с рекомендациями производителя. Используйте ультраочищенную воду или эквивалент во всех рецептах и шагах протокола. Носите средства индивидуальной защиты (лабораторные перчатки, маски для лица, перчатки и защитные очки / лицевой щиток) во время этой процедуры. Буферные объемы подходят для обработки шести образцов тканей.

  1. Приготовьте 1,5 л промывочного буфера ткани, соединив 154,035 г сахарозы (0,3 М финала), 3,904 г HEPES (10 мМ финала), 0,111 г ЭДТА (0,2 мМ финала). Добавьте ингредиенты в 1,0 л воды, находясь на перемешиваемой пластине, отрегулируйте рН до 7,2 с разбавленным HCl и внесите до окончательного объема до 1,5 л.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На образец необходимо приблизительно 200 мл промывочного буфера (50-300 мг). Шесть образцов тканей могут быть обработаны за день. Используйте оставшийся буфер промывки, чтобы создать буфер изоляции.
  2. Подготовьте изоляционный буфер из промывочного буфера, ранее описанного на этапе 1.1, добавив 210 мг BSA в 210 мл промывочного буфера. Отрегулируйте рН до 7,4 с помощью разбавленного раствора NaOH.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На образец ткани необходимо приблизительно 35 мл изоляционного буфера; поэтому для шести образцов требуется 210 мл изоляционного буфера. Подготовьте этот буфер, добавив свежий раствор BSA (1 мг/мл в день приготовления. BSA используется для выделения митохондрий, поскольку он улучшает митохондриальные свойства, удаляя естественные разъединители, такие как свободные жирные кислоты. Было обнаружено, что BSA обладает антиоксидантной активностью, увеличивая скорость окисления субстратов, особенно сукцината, в митохондриях мозга7. Альтернативно, бычий сывороточный альбумин может быть заменен менее дорогими бескислотными аналогами, такими как овальбумин.
  3. Готовят 150 мл буфера повторной суспензии путем объединения 0,011 г ЭДТА (конечная концентрация 0,2 мМ ЭДТА или используют 150 мкл 200 мМ запаса раствора ЭДТА для 150 мл буфера повторной суспензии), 12,836 г сахарозы (конечная концентрация сахарозы 0,25 М) и 0,236 г Tris (10 мМ Tris-HCl финала). Отрегулируйте pH до 7,8 с 0,1 N NaOH. Добавьте 60 мкл коктейля ингибитора протеазы непосредственно перед использованием.
  4. Готовят раствор трипсина, растворяя 7,5 мг трипсина в 3,0 мл 1 мМ HCl (2,5 мг трипсина/мл финала). Этого количества достаточно для одного образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте раствор трипсина на основе количества образцов тканей, которые планируется обработать.
  5. Готовят раствор ингибитора трипсина из сои, комбинируя 13,0 мг ингибитора трипсина в 20 мл изоляционного буфера, содержащего BSA (0,65 мг/мл финала ингибитора трипсина).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте свежий раствор ингибитора трипсина.
  6. Готовят реагент персульфата аммония, добавляя 0,1 г персульфата аммония в 1 мл воды (10% персульфата аммония).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Реагент персульфата аммония должен быть либо свежеприготовленным, либо большой объем может быть аликвотирован и храниться в морозильной камере с температурой -20 °C.
  7. Готовят раствор аминокапроновой кислоты (ACA), соединяя 0,131 г 6-аминокапроновой кислоты в 1,0 мл ультраочищенной воды и хранят его при 4 °C (1 M 6-аминокапроновой кислоты).
  8. Готовят раствор красителя Coomassie brilliant blue, растворяя 1 г Coomassie G-250 в 0,5 мл воды и 0,5 мл 1 М аминокапроновой кислоты (конечная концентрация 10% раствора красителя).
  9. Подготовьте 5% Digitonin для Синей нативной СТРАНИЦЫ (BN-PAGE). Приблизительно рассчитайте, сколько дигитонина необходимо в пробоподготовке плюс некоторый дополнительный объем, чтобы компенсировать ошибки дозирования (завышенная оценка на 10 мг). Для 15 мг: Во-первых, развести 15 мг дигитонина в 30 мкл 100% ДМСО. Вихрь, чтобы помочь дигитонину попасть в раствор. Далее добавляют оставшиеся 90% ddH2O (270 мкл). Осторожно нагреть, чтобы перемешать раствор (вихрь), а затем охладить его на льду.
  10. Подготовьте собственный буфер анодов PAGE. Добавьте 50 мл 20-кратного собственного рабочего буфера PAGE в воду объемом 950 мл, чтобы получить конечный объем 1 л. Подготовьте свежий анодный буфер для немедленного использования. Используйте его в качестве 1x работающего буфера.
  11. Подготовьте темно-синий катодный буфер. Растворить 0,0160 г Coomassie бриллиантового синего G-250 в 80 мл нативного анодного буфера PAGE; хорошо перемешать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте свежий катодный буфер для немедленного использования. Может потребоваться только 60 мл, но сделайте дополнительные 20 мл в случае каких-либо утечек.
  12. Подготовьте светло-синий катодный буфер. Добавьте 20 мл темно-синего катодного буфера в 180 мл собственного анодного буфера PAGE и хорошо перемешайте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот буфер можно использовать только один раз.
  13. Приготовьте 5% Coomassie G-250 в качестве добавки к образцу. Разбавить 200 мкл уже изготовленного 10% бульона Coomassie (стадия 1.8) 200 мкл 1 M ACA и хранить при 4 °C.
  14. Подготовьте 4-кратный буфер образцов PAGE, объединив 40% глицерина, 0,04% Ponceau S, 25 мМ Tris-HCl (рН 6,8), 192 мМ глицина в 10 мл конечного объема. Аликвоцитируйте их и храните при -20 °C в морозильной камере.

2. Выделение митохондрий из замороженной сердечной ткани

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните процедуру изоляции митохондрий в холодной камере с температурой 4 °C. Однако в случае недоступности холодильного помещения используйте для выполнения процедуры ледяную ванну большого размера.

  1. Извлеките ранее замороженные образцы сердечной ткани из морозильной камеры с температурой -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Максимум четыре образца ткани могут быть комфортно обработаны для выделения митохондрий в данный день.
  2. Взвесьте трубку, содержащую образец сердечной ткани, и запишите вес. Приготовьте три стакана (каждый по 50 мл), содержащие 40 мл промывочного буфера. Охладите каждый стакан в ледяной соляной ванне с равным количеством льда и соли, смешанных в течение 3-5 минут, прежде чем перейти к следующему этапу. Поместите магнитные перемешивающие стержни в каждый стакан и установите мешалку на среднюю скорость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не замораживайте стаканы и используйте их сразу после того, как начнут появляться облака кристаллов льда.
  3. Поместите замороженную сердечную ткань непосредственно в ледяной раствор в первом стакане. Подождите примерно 5 минут, помешивая и оказывая небольшое давление на ткани с помощью пинцета, чтобы получить как можно больше крови.
  4. Взвесьте пустую трубку и вычтите из исходного веса (шаг 2.2), чтобы получить чистый вес сердечной ткани.
  5. Выньте ткань щипцами и сожмите сердце чистым бумажным полотенцем из фильтровальной бумаги, чтобы удалить кровь. Затем поместите ткань во второй стакан. Подождите примерно 5 минут при перемешивании, чтобы удалить лишнюю кровь.
  6. Аккуратно высушите салфетку на бумажном полотенце. Удалите весь жир, свернувшуюся кровь, ушные раковины и фасции (белую ткань). Затем опустите желудочковую ткань.
  7. Измельчите образцы тканей с помощью измельчителя, выполнив шаги 2.7.1-2.7.9.
    1. Поместите сердечную ткань (~50-300 мг) в камеру измельчителя тканей со стороны барана.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Камера измельчителя тканей (трубка) для использования с измельчителем. Гомогенизация тканей в трубке измельчителя требует около 10-12 с на образец ткани. Гомогенизация ткани завершается после того, как гомогенизированная ткань проходит через перфорированный диск в верхнюю камеру. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  1. Добавьте ~0,2-0,8 мл промывочного буфера на сторону колпачка трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что общий объем образца и промывочного буфера, объединенных во время измельчения, не превышает 0,7-0,8 мл.
  2. Используйте трубчатый инструмент, чтобы плотно закрыть камеру измельчителя крышкой измельчителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не затягивайте крышку измельчителя.
  3. Поместите камеру измельчителя в держатель шредера стороной тарана вниз. Таран задействует фитинг в держателе измельчителя.
  4. Вставьте бит драйвера измельчителя; пусть бит взаимодействует с колпачком измельчителя. Убедитесь, что бит плотно закреплен на месте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте полностью заряженный драйвер шредера.
  5. Вручную применяйте давление вниз к драйверу измельчителя и камере измельчителя до тех пор, пока индикатор давления на держателе измельчителя не достигнет значения приблизительно 2 на держателе измельчителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка может быть на более высоком уровне, если измельченная ткань более волокнистая.
  6. Запускайте драйвер шредера в течение примерно 10-12 с, нажав на спусковой крючок водителя измельчителя, сохраняя при этом настройку на уровне 2.
  7. Посмотрите на трубку, чтобы проверить, вся или большая часть твердой массы ткани измельчена через лизисный диск и пропущена в верхнюю камеру камеры измельчителя, глядя на трубку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться измельчение образца ткани в течение более длительного периода. Просто верните трубку в держатель измельчителя и продолжайте процесс. Большинство видов образцов тканей требуют только 10-12 с измельчения. В то время как все измельчение будет производить некоторое тепло из-за трения, это короткое время обработки не будет значительно нагревать образец.
  8. После измельчения образца поднимите камеру измельчителя из держателя. С помощью трубчатого инструмента снимите колпачок измельчителя и поместите его на чистую поверхность для последующего использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крышка измельчителя должна рассматриваться как загрязненная экстрактом образца и, в зависимости от типа образца, может быть загрязнена инфекционными материалами. Не используйте тот же колпачок измельчителя для любых других образцов тканей, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение.
  1. Переложите измельченную сердечную ткань в третий стакан с 40 мл промывочного буфера и перемешайте батончик и перемешайте ткань в течение 5 мин на средней скорости, находясь на перемешиваемой пластине.
  2. Отфильтруйте суспензию через мононитью из нейлоновой сетки (размер пор 74 мкм) и выбросьте фильтрат. Промыть измельченную ткань на фильтре 3x с 10 мл промывочного буфера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что мононитя из нейлоновой сетки предварительно смачивается водой.
  3. Переложите промытую и измельченную ткань в стакан объемом 50 мл с 20 мл промывочного буфера и поместите стакан в ледяную ванну на магнитной мешалке. Добавьте 0,5 мл раствора трипсина, постоянно помешивая в течение 15 мин. Примерно на полпути через инкубацию (примерно через 7,5 мин) переместите суспензию ткани в свободно установленный ручной гомогенизатор «стекло на стекле», который будет удерживать 0-15 мл объема.

figure-protocol-2
Рисунок 1: Камера измельчителя тканей (трубка) для использования с измельчителем. Гомогенизация тканей в трубке измельчителя требует около 10-12 с на образец ткани. Гомогенизация ткани завершается после того, как гомогенизированная ткань проходит через перфорированный диск в верхнюю камеру. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  1. Аккуратно гомогенизируйте 4-5 ходами, чтобы диспергировать суспензию без образования пены. Поместите гомогенат в стакан объемом 50 мл и аккуратно перемешайте на перемешивающей пластине в течение 15 мин при 4 °C.
  2. После 15 мин инкубации добавляют 10 мл изоляционного буфера, содержащего ингибитор трипсина, в стакан, содержащий гомогенат, и инкубируют в течение 1 мин при 4°С при осторожном перемешивании.
  3. Снова отфильтруйте суспензию через нейлоновый фильтр и сохраните фильтрат в конической трубке объемом 50 мл.
  4. Соберите фракцию твердых частиц, оставленную на нейлоновом фильтре, и поместите ее в гомогенизатор «стекло на стекле». Добавьте 15-20 мл моечного буфера и аккуратно гомогенизируйте вручную в течение 25-30 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтрат течет очень медленно на этом этапе. Чтобы увеличить поток фильтрата, поместите наконечник воронки, касающийся внутренней части конической трубки.
  5. Соедините гомогенат с фильтратом, сбалансируйте трубки и центрифугу при 600 х г в течение 15 мин при 4 °C.
  6. Отфильтруйте полученный супернатант в новую коническую трубку с помощью нейлонового фильтра, чтобы избежать загрязнения гранулой. Снова запустите центрифугу при 8 500 х г в течение 15 мин при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пластиковую переносную пипетку, чтобы удалить супернатант и пожертвовать 0,2 мл супернатанта с верхней части пушистой гранулы.
  7. Откажитесь от супернатанта и промыть гранулу 2-3 раза 1 мл изоляционного буфера. Убедитесь, что пушистый белый слой внешнего обода каждый раз отбрасывается.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вымойте гранулу, добавив изоляционный буфер с помощью пипетки с наконечником 1 мл или новой передаточной пипетки. Добавьте буфер сбоку трубки, а не непосредственно над гранулой, чтобы предотвратить разрушение гранулы и предотвратить загрязнение супернатанта. Затем аспирируйте буфер передаточной пипеткой и повторите процесс еще два раза.
  8. Добавьте 5 мл изоляционного буфера в каждую трубку и разбейте гранулу, используя пипетку с наконечником 1 мл или новую передаточную пипетку.
  9. Разбавьте суспензию 20 мл дополнительного изоляционного буфера и снова запустите центрифугу при 8 500 х г в течение 15 мин при 4 °C.
  10. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 5 мл буфера повторного использования. Затем добавьте еще 15 мл буфера в общей сложности 20 мл и центрифугу при 8 500 х г в течение 15 мин. при 4 °C. Выбросьте супернатант. Полученная коричневая гранула содержит промытые интактные митохондрии.
  11. Повторное суспендирование обогащенной митохондриями гранулы в 250 мкл повторного буфера, включая ингибиторы протеазы. Аликвот в 25 мкл, быстро заморозить в жидком азоте и хранить в морозильной камере -80 °C в течение нескольких лет.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Запасной 5 мкл обогащенного митохондриями препарата для анализа белка. Для исследования BN-PAGE (Blue native-PAGE) аликвотировать повторно суспендированную гранулу в 50 мкг митохондриального белка на трубку. Центрифуга при 8 500 х г в течение 15 мин при 4 °C. Тщательно аспирируйте супернатант и храните митохондриальную гранулу (50 мкг белка / аликвоты) в морозильной камере с температурой -80 °C в течение нескольких лет.

3. Оценка митохондриального комплекса переноса электронов (ETC)

ПРИМЕЧАНИЕ: Отдельные митохондриальные белки ETC (т.е. Complex-I, II, III, IV, V) могут быть оценены с помощью стандартного иммуноблоттинга. Из-за разнообразия образцов (четыре временные точки: 48 ч, 3 месяца, 6 месяцев, 9 месяцев), двух экспериментальных условий (физический и сидячий) и ряда иммунозондирующих антител (пять антител) рекомендуется мультиплексированное иммуноблоттинг. Выполните мультиплексированное иммуноблоттинг следующим образом.

  1. Разрешить 50 мкг обогащенного митохондриями образца белка в 4%-20% градиентном полиакриламидном гелевом электрофорезе (100 В, 90 мин).
  2. Перенос белков на PVDF-мембрану (75 В; 60 мин)
  3. Блокируют мембрану в блокирующем буферном растворе не менее чем на 1 ч при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время блокировки может быть продлено до ночи при 4 °C. Блокирующий буфер (Таблица материалов) содержит ингредиенты, не относящиеся к млекопитающим (т.е. рыбьи белки), которые с меньшей вероятностью имеют специфические связывающие взаимодействия с антителами, а также с другими белками млекопитающих, присутствующими в типичных способах.
  4. Исследуйте мембрану коктейлем антител, включая антикомплекс-I, II, III, IV, V, и инкубируйте в течение ночи на орбитальном шейкере при 4 °C.
  5. На следующий день промыть мембрану и зонд вторичным антителом с ИК-меткой в течение 2 ч на орбитальном шейкере при RT (комнатной температуре).
  6. Промыть пять раз 1x TBS-T (TBS, содержащий Tween 20) и один раз 1x TBS (tris буферизованный физиологический раствор).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для последней стирки не включайте моющее средство в буфер TBS.
  7. Создайте пятно в анализаторе изображений.

4. Оценка суперкомплекса митохондрий методом электрофореза Blue Native Poly Acrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE)

ПРИМЕЧАНИЕ: Сверхсложный профиль ETC также может быть оценен с помощью метода BN-PAGE.

  1. Подготовьте образец буферного коктейля на 20 мкл на 50 мкг обогащенного митохондриями белка гранул (7 мкл воды + 5 мкл 4x нативного полиакриламидного геля электрофореза буфера загрузки образца + 8 мкл 5% digitonin + 2 мкл Coomassie G-250).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте запасной образец буферного коктейля в зависимости от количества доступных образцов (50 мкг белка на образец). Выбирайте соответствующие количества дигитонина на основе концентрации белка в гранулах, обогащенных митохондриями (таблица 1)8.
  2. Нагрейте дигитонин при 95 °C в течение 3 минут, перемешайте и остудите на льду, прежде чем сделать мастер-микс.
  3. Добавьте добавку для образца Coomassie G-250 непосредственно перед загрузкой образцов в гель.
  4. Добавьте 20 мкл буферного коктейля образца в пробирку, содержащую 50 мкг митохондриальной белковой гранулы. Солюбилизируйте/повторно суспендируйте гранулу, аккуратно смешивая гранулу с пипеткой без образования пены.
  5. Инкубируйте смесь на льду в течение 20 минут для достижения максимальной солюбилизации гранул, обогащенных митохондриями. Время от времени осторожно щелкайте трубками, чтобы усилить солюбилизацию.
  6. В ожидании инкубации подготовьте собственный буфер анода PAGE/работающий буфер 1x и катодный буфер темно-синего цвета.
  7. Центрифуга солюбилизированной гранулы, обогащенной митохондриями, при 20 000 х г в течение 10 мин при 4 °C.
  8. После центрифугирования соберите 15 мкл супернатанта в новые трубки, помещенные на лед.
  9. Добавьте соответствующее количество 5% реагента Coomassie G-250 к супернатанту, полученному на стадии 4.8 (см. таблицу 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем 5% Coomassie G-250 должен быть таким, чтобы конечная концентрация красителя составляла 1/4 от концентрации моющего средства. Выполните этот шаг непосредственно перед загрузкой образцов в гель.
БелокДигитонин/белок4x буфер образцов5% ДигитонинВодаЗаключительный том5% Кумасси G-250
соотношение (г/г)добавка к образцу
50 мкг8587202
50 мкг45411201

Таблица 1: Приготовление проб буферного коктейля с двумя различными соотношениями моющее средство/белок. Для достижения максимальной солюбилизации мембранных белков из митохондриальной суспензии концентрация белка дигитонина/митохондриальной суспензии должна быть скорректирована до 4-8 г дигитонина/г белка. В сердечной ткани 400 мкг дигитонина на 50 мкг белков митохондриальной суспензии (т.е. 8 г дигитонина/г белка митохондрий) использовали для максимизации растворимости суперкомплексов из суспензии митохондрий.

  1. Залейте 3%-8% градиентным гелем, удалите гребень и трижды промойте колодцы геля с 1x рабочим буфером.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гель лучше всего полимеризуется, если его влить за день до этого.
  2. Настройте систему электрофореза и поместите гель в аппарат.
  3. Заполните пробные колодцы катодным буфером темно-синего цвета.
  4. Загрузка 10 мкл неокрашенного белкового стандарта в качестве нативного молекулярно-массового маркера на первой и последней лунке геля.
  5. Загрузите все количество пробы супернатанта + добавки для пробы Coomassie, приготовленной на этапе 4.9 выше, в скважины с использованием наконечника для загрузки геля с плоской головкой.
  6. Осторожно заполните буферную плотину мини-ячейки приблизительно 60 мл катодного буфера темно-синего цвета, не нарушая образцы в скважинах, а затем заполните буферный резервуар собственным рабочим буфером PAGE 1x.
  7. Включите блок питания и электрофоризируйте образцы при напряжении 150 В в течение примерно 30 минут.
  8. Извлеките катодный буфер темно-синего цвета из буферной плотины (внутренней камеры) с помощью передаточной пипетки или аспирируйте пробоотборные скважины. Заполните внутреннюю камеру 150-200 мл катодного буфера голубого цвета и запустите электрофорез при 250 В в течение 60 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время электрофореза можно определить, проверив, когда передняя часть красителя мигрирует всего на 0,5 см выше нижней части гелевой кассеты.
  9. Извлеките гель из кассеты и поместите в чистый пластиковый контейнер. Промыть гель дистиллированной водой хорошего качества в течение 15 мин на коромысле/орбитальном шейкере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы удалить градиентный гель из кассеты, обработайте кассету снизу, которая прочнее, чтобы свести к минимуму вероятность поломки.
  10. Залейте водой, погрузите гель в достаточное количество реагента для окрашивания Coomassie GelCode Blue и инкубируйте в течение 1 ч на орбитали/коромысле при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием смешайте раствор реагента Blue stain (Таблица материалов), осторожно закрутив флакон несколько раз.
  11. Декантировать раствор красителя, добавить дистиллированную воду, несколько раз промыть водой, а затем положить на орбиталь/коромысло для очистки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вставьте кусочек губки (~3 см х 0,5 см) в контейнер для удаления геля и оставьте гель для ночного окрашивания. Губка адсорбирует частицы красителя, не требуя многократной замены воды.
  12. Проанализируйте гель в анализаторе изображений.

5. Оценка суперкомплекса митохондрий иммуноблот-анализом

  1. Выполните новый набор BN-PAGE без окрашивания геля в конце электрофореза.
  2. Следуйте той же процедуре, что и в разделе 3 (оценка митохондриального комплекса переноса электронов (ETC)), чтобы завершить иммуноблоттинг.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Следуя протоколу, был получен хороший выход обогащенной митохондриями белковой смеси из сердечной ткани. Приблизительно 15 мг/мл обогащенной митохондриями белковой смеси было получено в среднем из 1,2 г замороженной сердечной ткани, собранной у потомства свиноматки. Наблюдения показали, что менее 0,5 г замороженной сердечной ткани не давали достаточного количества обогащенной митохондриями белковой смеси для проведения анализа BN-PAGE. Количество митохондриального препарата было достаточным для выполнения (i) стандартног...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Критические шаги для этого протокола указаны здесь. Во-первых, гомогенизация тканей должна быть тщательно обработана, чтобы во время процесса гомогенизации тканей не применялись чрезмерные эффекты. Следует использовать тканевой измельчитель, который является частью технологии циклического давления (PCT) для первоначальной гомогенизации тканей9. Этот шаг уменьшит чрезмерный цикл инсульта гомогенизатора «стекло на стекле» (рисунок 1B), который может еще больше разрушить...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была финансово поддержана внутренним грантом Университета Канзас-Сити для Абдулбаки Агбаса и Летней исследовательской стипендией для Даниэля Барреры. Авторы благодарны за редакционную работу доктора Яна Тэлли.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Аминокапроевая кислотаSigma/AldrichA2504-100G
Anti-Hu Total OxPhos complex kitInvitrogen458199
антитела против VDAC abcamab15895use 1 µ г/мл
Coomassie G-250ThermoSientific20279
Coomassie GelCode BlueThermoScientific24592
DigitoninCabiochem300410
Гомогенизатор стекло-стеклянный пестикVWRKT885451-0020
Image StudioLICOR
IR-Dye конъюгированный анти-Rabbit AbLICORLC0725
Считыватель пластин MultiwellBioTekSynergy HT
Нативный маркер молекулярной массыThermoFisherBN2001
Нейлоновая сетка МононитьSmall Part IncCMN-74
Орбитальный шейкерThermoScientfic
PCT ShredderPressure Bioscience Inc
SEA БЛОК Блокирующий буферThermoScienctific37527
Измельчитель PULSE Давление пробиркиBioscience IncFT500-PS
Настольная центрифугаEppendorf5418
ТрипсинAmrescoM150-1G
Ингибитор трипсинаAmrescoM191-1GТребуется свежий препарат

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
  2. Osto, C., et al. Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples. Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116(2020).
  3. Agbas, A., et al. Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions. Current Protocols in Toxicology. 80, 73(2019).
  4. Hathaway, Q. A., et al. Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).
  5. May, L. E., et al. Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow. American Journal of Obstetrics & Gynecology MFM. 2 (2), 100095(2020).
  6. Ehler, W. J., et al. Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery. Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).
  7. Panov, A. V., et al. Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).
  8. Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
  9. Pressure Biosciences Inc. Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , South Easton, MA. (2010).
  10. McLaughlin, K. L., et al. Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs. Scientific Reports. 10 (1), 17599(2020).
  11. Hom, J., Sheu, S. S. Morphological dynamics of mitochondria--a special emphasis on cardiac muscle cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).
  12. Greggio, C., et al. Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Cardiac Tissue MitochondriaFrozen Tissue MitochondriaMaternal Exercise ModelBlue Native ElectrophoresisMultiplexed ImmunoblottingSupercomplex AssessmentComplex I II ActivityMitochondria Isolation

Похожие статьи