Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Измерение состава CD95 Индуцирующего Смерть Сигнального Комплекса и Обработка Прокаспазы-8 в этом Комплексе

2.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62842

⸱

2 августа 2021 г.

 , 
1Translational Inflammation Research, Center of Dynamic Systems, Otto von Guericke University Magdeburg

В этой статье

Краткое содержание

Здесь представлен экспериментальный рабочий процесс, позволяющий обнаружить обработку каспазы-8 непосредственно на вызывающем смерть сигнальном комплексе (DISC) и определяющий состав этого комплекса. Эта методология имеет широкое применение, от разгадки молекулярных механизмов путей гибели клеток до динамического моделирования сетей апоптоза.

Аннотация

Внешний апоптоз опосредован активацией рецепторов смерти (DR), таких как CD95/Fas/APO-1 или связанный с фактором некроза опухоли апоптоз-индуцирующий лиганд (TRAIL)-рецептор 1/рецептор 2 (TRAIL-R1/R2). Стимуляция этих рецепторов их родственными лигандами приводит к сборке вызывающего смерть сигнального комплекса (DISC). DISC содержит DR, адапторный белок Fas-ассоциированный белок с доменом смерти (FADD), прокаспазы-8/-10 и клеточные FADD-подобные интерлейкин (IL)-1β-превращающие фермент-ингибирующие белки (c-FLIP). DISC служит платформой для обработки и активации прокаспазы-8. Последнее происходит через его димеризацию/олигомеризацию в нитях эффекторного домена смерти (DED), собранных на ДИСК.

Активация прокаспазы-8 сопровождается ее обработкой, которая происходит в несколько этапов. В данной работе описан налаженный экспериментальный рабочий процесс, позволяющий измерять образование DISC и обрабатывать прокаспазу-8 в данном комплексе. Рабочий процесс основан на методах иммунопреципитации, поддерживаемых анализом вестерн-блоттинга. Этот рабочий процесс позволяет тщательно контролировать различные этапы набора прокаспазы-8 в DISC и его обработку и очень актуален для исследования молекулярных механизмов внешнего апоптоза.

Введение

Одним из наиболее изученных рецепторов смерти (DR) является CD95 (Fas, APO-1). Внешний апоптотический путь начинается с взаимодействия ДР с его родственным лигандом, т.е. CD95L взаимодействует с CD95 или TRAIL связывается с TRAIL-Rs. Это приводит к образованию DISC на соответствующем DR. DISC состоит из cd95, FADD, прокаспазы-8/-10 и c-FLIP белков1,2. Кроме того, DISC собирается путем взаимодействия между белками, содержащими домен смерти (DD), такими как CD95 и FADD, и DED-содержащими белками, такими как FADD, прокаспаза-8/-10 и c-FLIP(рисунок 1). Прокаспаза-8 подвергается олигомеризации посредством ассоциации своих DED, что приводит к образованию DED-нитей с последующей активацией и обработкой прокаспазы-8. Это запускает каскад каспазы, который приводит к гибели клеток(рисунок 1)3,4. Таким образом, прокаспаза-8 является центральным инициатором каспазы внешнего пути апоптоза, опосредованного CD95 или TRAIL-Rs, активированным на соответствующей макромолекулярной платформе, DISC.

Известно, что две изоформы прокаспазы-8, а именно прокаспаза-8а (p55) и -8b (p53), рекрутируются в DISC5. Обе изоформы состоят из двух DED. DED1 и DED2 расположены в N-концевой части прокаспазы-8a/b, за которой следуют каталитические домены p18 и p10. Детальный криоэлектронный микроскопический (крио-ЭМ) анализ DED прокаспазы-8 выявил сборку белков прокаспазы-8 в нитевидные структуры, называемыеDED-нитями 4,6. Примечательно, что первоначально предполагалось, что линейные цепи прокаспазы-8 будут заниматься димеризацией с последующей активацией прокаспазы-8 на ДИСК. Теперь известно, что эти цепи являются лишь подструктурой прокаспазы-8 ПСД, последняя состоит из трех цепей, собранных в тройнуюспираль 3,4,6,7.

При димеризации на нити DED конформационные изменения прокаспазы-8а/б приводят к образованию активного центра прокаспазы-8 и ее активации3,8. За этим следует обработка прокаспазы-8, которая опосредована двумя путями: первый идет через генерацию продукта расщепления p43 / p41, а второй - через начальное поколение продукта расщепления p30. Путь p43/p41 инициируется расщеплением прокаспазы-8a/b в Asp374, в результате чего образуются продукты расщепления p43/p41 и p12(рисунок 2). Далее эти фрагменты автокаталитически расщепляются на Asp384 и Asp210/216, давая начало образованию активного гетеротетрамера каспазы-8, p102/p1829,10,11. Кроме того, было показано, что параллельно пути обработки p43/p41 прокаспаза-8a/b также расщепляется на Asp216, что приводит к образованию продукта С-концевого расщепления p30 с последующим его протеолизом на p10 и p1810 (фиг.2).

Активация прокаспазы-8a/b в нити DED строго регулируется белками, называемыми c-FLIPs12. Белки c-FLIP встречаются в трех изоформах: c-FLIPLong (c-FLIPL),c-FLIPShort (c-FLIPS)и c-FLIPRaji (c-FLIPR). Все три изоформы содержат два DED в их N-концевой области. c-FLIPL также имеет С-концевой каталитически неактивный каспазоподобный домен12,13. Обе короткие изоформы c-FLIP-c-FLIPS и c-FLIPR-действуют антиапоптотическим образом, нарушая образование нити DED наДИСКЕ 6,14,15. Кроме того, c-FLIPL может регулировать активацию каспазы-8 в зависимости от концентрации. Это может привести как к про-, так и к антиапоптотическим эффектам16,17,18. Образуя каталитически активный гетеродимер прокаспазы-8/c-FLIPL, c-FLIPL приводит к стабилизации активного центра прокаспазы-8 и его активации. Про- или антиапоптотическая функция c-FLIPL напрямую зависит от его количества на DED нитях и последующего количества собранных гетеродимеров прокаспазы-8/c-FLIPL 19. Низкие или промежуточные концентрации c-FLIPL на DISC приводят к достаточному количеству гетеродимеров прокаспазы-8/c-FLIPL на нити DED, что поддерживает активацию каспазы-8. Напротив, увеличение количества c-FLIPL непосредственно приводит к его антиапоптотическим эффектам на DISC20.

В совокупности активация и обработка прокаспазы-8a/b на DISC представляет собой строго регулируемый процесс, включающий несколько этапов. В данной работе рассматривается измерение обработки прокаспазы-8 непосредственно на ДИСК, а также анализ состава этого комплекса. Это будет представлено с использованием CD95 DISC в качестве образцового комплекса АВАРИЙНОГО ВОССТАНОВЛЕНИЯ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эксперименты с Т-клетками проводились в соответствии с этическим соглашением 42502-2-1273 Uni MD.

1. Подготовка клеток к эксперименту

ПРИМЕЧАНИЕ: Среднее количество клеток для этой иммунопреципитации составляет 1 × 107. Адгезивные клетки должны быть посеяны за один день до эксперимента, чтобы в день эксперимента было 1 ×10 7 клеток.

  1. Подготовка адгезивных клеток к эксперименту
    1. Семена 5-8 × 106 адгезивных клеток в 20 мл среды (см. Таблицу материалов композиции) для каждого состояния в посуде по 14,5 см за день до начала эксперимента.
    2. В день эксперимента убедитесь, что клетки на 80-90% сливаются и прилипают к блюду. Выбросьте среду и добавьте свежую среду в клетки адгезивов.
  2. Подготовка суспензионных клеток к эксперименту
    1. Аккуратно поместите 1 × 107 суспензионных клеток в 10 мл питательной среды (см. Таблицу материалов для композиции) в каждое условие в чашках по 14,5 см непосредственно перед началом эксперимента.
    2. При использовании первичных клеток выделяют первичные Т-клетки в соответствии с ранее описанной процедурой21. Обрабатывайте первичные Т-клетки 1 мкг/мл фитогемагглютинином в течение 24 ч, а затем 25 Ед/мл IL2 в течение 6 дней.
    3. Тщательно поместите 1 × 108 первичных Т-клеток в 10 мл питательной среды (см. Таблицу материалов для композиции) в каждое условие в чашках по 14,5 см непосредственно перед началом эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется увеличить количество первичных Т-клеток, так как эти клетки меньше.

2. Стимуляция CD95L

  1. Стимулируют клетки CD95L (продуцируются, как описаноранее 20 или коммерчески доступны (см. Таблицу материалов)).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация CD95L и время стимуляции зависят от клеточного типа13,15,22,23,24,25. Подготовьте одно условие стимуляции дважды, чтобы параллельно сгенерировать образец «контроля бусины».
    1. Стимулируют адгезивные клетки выбранной концентрацией CD95L. Держите пластину под углом и пипетируйте лиганд в среду, не касаясь адгезивных клеток.
    2. Стимулируйте клетки суспензии CD95L путем пипетирования раствора лиганда в клеточную суспензию.

3. Сбор и лизис клеток

  1. Поместите клеточную посуду на лед.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не выбрасывайте носитель. Умирающие клетки плавают в среде и важны для анализа.
  2. Добавьте 10 мл холодного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) в клеточную суспензию и соскоблите прикрепленные ячейки с пластины. Соберите клеточную суспензию в пробирку объемом 50 мл.
  3. Дважды вымойте посуду с 10 мл холодного PBS и поместите раствор для мытья в ту же трубку объемом 50 мл. Центрифугируют клеточную суспензию при 500 × г в течение 5 мин, 4 °С.
  4. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте гранулу ячейки с 1 мл холодного PBS. Переложите клеточную суспензию в пробирку объемом 1,5 мл.
  5. Центрифугируют клеточную суспензию при 500 × г в течение 5 мин, 4 °С. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте гранулу ячейки с 1 мл холодного PBS.
  6. Центрифугируют клеточную суспензию при 500 × г в течение 5 мин, 4 °С. Откажитесь от надосадочного вещества и повторно суспендируйте клеточную гранулу с 1 мл лизисного буфера (содержащего 4% коктейля ингибитора протеазы). Инкубируйте его в течение 30 минут на льду.
  7. Центрифугировать лизат с максимальной скоростью (~17 000 × g)в течение 15 мин, 4 °C.
  8. Переложите супернатант (лизат) в чистую трубку. Выбросьте гранулу. Возьмите 50 мкл лизата в другой пробирке. Проанализируйте концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда и возьмите количество лизата, соответствующее 25 мкг белка во флаконе. Добавьте буфер загрузки (см. Таблицу материалов для состава) во флакон. Храните его при температуре -20 °C в качестве контроля лизата.

4. Иммунопреципитация (ИП)

  1. Добавьте к лизату 2 мкл антител против АПО-1 и 10 мкл бусин сефарозы белка А (приготовленных по рекомендации производителя). Добавьте только 10 мкл шариков в отдельную пробирку, содержащую лизат (стимулированный образец), чтобы создать «контроль шариков».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте наконечники пипетки с широкими отверстиями, либо разрезая наконечники, либо покупая специальные наконечники для IP при работе с бусинами сефарозы белка А.
  2. Инкубировать смесь лизата с антителами/белком А сефарозными шариками с мягким перемешиванием в течение ночи при 4 °C. Центрифугировать лизаты антителами/белком А сефарозными шариками при 500 × г в течение 4 мин, 4 °С. Выбросьте супернатант, добавьте в бусины 1 мл холодного PBS и повторите этот шаг не менее трех раз.
  3. Выбросьте супернатант. Аспирировать шарики предпочтительно с помощью 50 мкл гамильтоновского шприца.

5. Вестерн Блот

  1. Добавьте 20 мкл 4-кратного нагрузочного буфера (см. Таблицу материалов для композиции) к шарикам и нагревайте при 95 °C в течение 10 мин. Нагревайте элементы управления лизатом при 95 °C в течение 5 мин.
  2. Загрузите лизаты, IP и белковый стандарт на 12,5% гель додецилсульфата натрия (SDS) (см. Таблицу материалов для приготовления геля) и работайте с постоянным напряжением 80 В.
  3. Перенесите белки из геля SDS в нитроцеллюлозную мембрану.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь полусухой метод, оптимизированный для интересующих белков, был использован для переноса в течение 12 мин (25 В; 2,5 А = постоянная). Замочите нитроцеллюлозную мембрану и две мини-стопки переноса в буфере электрофореза (см. Таблицу материалов для композиции, подготовьте согласно инструкции производителя) за несколько минут до вестерн-блоттинга.
  4. Поместите промокаемую мембрану в коробку и заблокируйте ее на 1 ч в блокирующем растворе (0,1% Tween-20 в PBS (PBST) + 5% в молоке). Инкубировать мембрану блокирующим раствором при мягком перемешивании.
  5. Промывайте мембрану три раза ПБСТ в течение 5 мин каждую стирку.

6. Обнаружение вестерн-блоттинга

  1. Добавьте первое первичное антитело в указанном разведении (см. Таблицу материалов)к мембране и инкубируйте его в течение ночи при 4 °C с мягким перемешиванием.
  2. Промывайте мембрану три раза ПБСТ в течение 5 мин каждую стирку.
  3. Инкубировать мембрану с 20 мл вторичного антитела (разбавленного 1:10 000 в ПБСТ + 5% молока) с легким встряхиванием в течение 1 ч при комнатной температуре.
  4. Промывайте мембрану три раза ПБСТ в течение 5 мин каждую стирку.
  5. Отбросьте ПБСТ и добавьте примерно 1 мл субстрата пероксидазы хрена в мембрану.
  6. Обнаружение хемолуминесцентного сигнала (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время экспозиции и количество захваченных изображений зависят от количества белка в клетке и специфичности используемых антител. Он должен быть установлен эмпирически для каждого антитела, используемого для обнаружения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для анализа набора каспазы-8 в DISC и ее обработки на CD95 DISC, в этой статье описывается классический рабочий процесс, который сочетает IP CD95 DISC с западным блот-анализом. Это позволяет обнаружить несколько ключевых особенностей активации каспазы-8 на ДИСК: сборка макромолекулярной платформы, активирующей каспазу-8, рекрутирование прокаспазы-8 в ДИСК и обработка этой инициаторной каспазы(рис. 1 и Фиг.2). Этот рабочий процесс включает в себя лечение чувствит...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот подход был впервые описан Kischkel et al.27 и с тех пор успешно разработан несколькими группами. Необходимо рассмотреть несколько важных вопросов для эффективной обработки DISC-иммунопреципитации и мониторинга каспазы-8 в этом комплексе.

Во-первых, важно соблюдать все этапы промывки во время иммунопреципитации. Особенно важны заключительные этапы промывки бусин сефарозы и сушка бусин сефарозы. Это должно быть сделано правильно, чтобы увеличить соотношение сигнал/шу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Мы благодарим Фонд Вильгельма Сандера (2017.008.02), Центр динамических систем (CDS), финансируемый программой ЕС ERDF (Европейский фонд регионального развития) и DFG (LA 2386) за поддержку нашей работы. Мы благодарим Карину Гуттек за поддержку наших экспериментов. Мы благодарим профессора Дирка Рейнхольда (OvGU, Магдебург) за предоставление нам первичных Т-клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
12,5% гель SDSдлядвух разделительных гелей:
3,28 мл дистиллированный H2O
2,5 мл Tris; pH 8,8; 1,5 M
4,06 мл акриламида
100; L 10% SDS
100 &; L 10% APS
7,5 &; L TEMED

для двух собирающих гелей:
3,1 мл дистиллированного H2O
1,25 мл Tris; рН 6,8; 1,5 м<бр/> 0,5 мл акриламида<бр/> 50 мкм; L 10% SDS
25 &; L 10% APS
7,5 &; L TEMED
14,5 см клеточные чашкиGreiner639160
акриламидCarl RothA124.1
Аэрозольный фильтр наконечники для пипеток с фильтром высокой степени восстановления и широким отверстиемVWR46620-664 (Северная Америка) или 732-0559 (Европа)Используется для пипетирования шариков до лизата
антиактина AbSigma AldrichA2103разведение: 1:4000 в PBST + 1:100 NaN<суб>3
anti-APO-1 Abпредоставленный в этих экспериментах профессором. Краммером или может быть приобретен компанией EnzoALX-805-038-C100используемый только для иммунопреципитации
анти-каспазы-10 AbBiozolMBL-M059-3разведение: 1:1000 в PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-3клеточная сигнализация9662 Sразведение: 1:2000 в PBST + 1:100 NaN3
анти-каспазаза-8 Ab C15предоставлен в этих экспериментах профессором. Краммером или может быть приобретен ENZOALX-804-242-C100разведение: 1:20 в PBST + 1:100 NaN3
anti-CD95 AbSanta Cruzsc-715разведение: 1:2000 в PBST + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Abпредоставлен в этих экспериментах профессором. Краммером или может быть приобретен ENZOALX-804-961-0100разведение: 1:10 в PBST + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Abпредоставлено в этих экспериментах профессором. Краммером или может быть приобретено ENZOADI-AAM-212-Eразведение: 1:10 в PBST + 1:100 NaN3
anti-PARPAb cell signal9542разведение: 1:1000 в PBST + 1:100 NaN3
APSCarl Roth9592.3
β-меркаптоэтанолCarl Roth4227.2
Bradford solution
Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml		Bio Rad500-0006используется в соответствии с инструкциями производителя
CD95L,предоставленными в этих экспериментах профессором. Краммером, или может быть приобретен ENZOALX-522-020-C005
хемолюминесцентный детектор
Chem Doc XRS+		Bio Rad
cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC)Sigma Aldrich11 836 145 001приготовлен в соответствии с инструкцией производителя
DPBS (10x) без Ca, MgPAN BiotechP04-53500разведение 1:10 с H2O, хранение в холодильнике
электрофорезбуфер собственного приготовления10x Буфер для электрофореза:
60,6 г Tris
288 г глицина
20 г SDS
ad 2 л H2O
разведение 1:10 перед применением
глицинCarl Roth3908.3
Goat Anti-Mouse IgG1 HRPSouthernBiotech1070-05разведение 1:10.000 в PBST + 5% молока
Goat Anti-mouse IgG2b HRPSouthernBiotech1090-05разведение 1:10.000 в PBST + 5% молочный козий
Anti-rabbit IgG-HRPSouthernBiotech4030-05разведение 1:10.000 в PBST + 5% молочный
интерлейкин-2 Human(hIL-2)Merckgroup/ Roche11011456001для активации Т-клеток
KClCarl Roth6781.2
KH2PO4Carl Roth3904.1
загрузочный буфер
4x Laemmli Sample Buffer, 10 мл		Bio Rad161-0747приготовлен в соответствии с инструкциями производителя
Luminata Forte Western HRP субстратMilliporeWBLUFO500
лизисный буферсобственного производства13,3 мл Tris-HCl; pH 7,4; 1,5 M
27,5 мл NaCl; 5 M
10 мл EDTA; 2 mM
100 мл Triton X-100
добавить 960 мл H2O
среда для адарентных клеток DMEM F12 (1:1) со стабильным глутамином,  2,438 г/лPANBiotech P04-41154с добавлением 10% FCS, 1% пенициллин-стрептомицина и 0,0001% пуромицина в среду
для первичных Т-клетокgibco от Life Technologie21875034добавлением 10% FCS и 1% пенициллин-стрептомицина в среду
сухого молокаCarl RothT145.4
Na2HPO4CarlRoth P030.3
NaClCarl Roth3957.2
PBSTсобственного производства20x PBST:
230 г NaCl
8 г KCl
56,8 г Na2HPO4
8 г KH2PO4
20 мл Tween-20
ad 2 л H2O
разведение 1:20 перед использованием
PBST + 5% молокособственного приготовления50 г сухого молока + 1 л PBST
Thermo Fisher ScientificR30852801для активации Т-клеток
Power Pac HCBio Rad
Precision Plus Protein Standard All BlueBio Rad161-0373использование между 3-5 и микро;
L Protein A Сефароза CL-4B бусиныNovodirect/ Th.GeyerGE 17-0780-01аффинность смолы гранулы приготовлены в соответствии с инструкциями производителя
скребокVWR734-2602
SDSCarl Roth4360.2
шейкерHeidolph
азид натрияCarl RothK305.1
TEMEDCarl Roth2367.3
Trans Blot Turbo мини-размер стеки для переносаBio Rad170-4270используются согласно инструкции производителя
TransBlot Turbo 5x Transfer BufferRad10026938приготовлен в соответствии с инструкциями производителя
TransBlot Turbo Mini-size нитроцеллюлозная мембранаBio Rad170-4270используется в соответствии с инструкцией производителя
Trans-Blot-TurboBio Rad
TrisChem Solute8,08,51,000
Triton X-100Carl Roth3051.4
Tween-20Pan Reac Appli ChemA4974,1000
, , Ab Bio

Ссылки

  1. Lavrik, I. N., Krammer, P. H. Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC. Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).
  2. Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. Life and death in peripheral T cells. Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).
  3. Dickens, L. S., et al. A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death. Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).
  4. Fu, T. -M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
  5. Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).
  6. Fox, J. L., et al. Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
  7. Schleich, K., et al. Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model. Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).
  8. Hughes, M. A., et al. Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival. Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).
  9. Lavrik, I., et al. The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2]. Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).
  10. Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation. Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).
  11. Golks, A., et al. The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation. Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).
  12. Oztürk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions. Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).
  13. Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).
  14. Hughes, M. A., et al. Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate. Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).
  15. Hillert, L. K., et al. Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly. Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).
  16. Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).
  17. Micheau, O., et al. The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).
  18. Chang, D. W., et al. C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis. EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).
  19. Hillert, L. K., et al. Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer. Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).
  20. Fricker, N., et al. Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL. Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).
  21. Arndt, B., et al. Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation. Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).
  22. Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network. Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).
  23. Schleich, K., et al. Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain. Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).
  24. Lavrik, I. N., et al. Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling. Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).
  25. Sprick, M. R., et al. Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8. EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).
  26. Neumann, L., et al. Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells. Molecular Systems Biology. 6 (1), 352(2010).
  27. Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).
  28. Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways. Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).
  29. Kallenberger, S. M., et al. Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis. Science Signaling. 7 (316), 23(2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Процессинг прокаспазы-8формирование DISC-комплекса CD95внешний путь апоптозаметод иммунопреципитациивестерн-блоттингактивация каспазы-8рекрутирование FADDбелки c-FLIPанализ активности каспазы-8
Измерение состава CD95 Индуцирующего Смерть Сигнального Комплекса и Обработка Прокаспазы-8 в этом Комплексе
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.