Измерение состава CD95 Индуцирующего Смерть Сигнального Комплекса и Обработка Прокаспазы-8 в этом Комплексе

Summary

Здесь представлен экспериментальный рабочий процесс, позволяющий обнаружить обработку каспазы-8 непосредственно на вызывающем смерть сигнальном комплексе (DISC) и определяющий состав этого комплекса. Эта методология имеет широкое применение, от разгадки молекулярных механизмов путей гибели клеток до динамического моделирования сетей апоптоза.

Abstract

Внешний апоптоз опосредован активацией рецепторов смерти (DR), таких как CD95/Fas/APO-1 или связанный с фактором некроза опухоли апоптоз-индуцирующий лиганд (TRAIL)-рецептор 1/рецептор 2 (TRAIL-R1/R2). Стимуляция этих рецепторов их родственными лигандами приводит к сборке вызывающего смерть сигнального комплекса (DISC). DISC содержит DR, адапторный белок Fas-ассоциированный белок с доменом смерти (FADD), прокаспазы-8/-10 и клеточные FADD-подобные интерлейкин (IL)-1β-превращающие фермент-ингибирующие белки (c-FLIP). DISC служит платформой для обработки и активации прокаспазы-8. Последнее происходит через его димеризацию/олигомеризацию в нитях эффекторного домена смерти (DED), собранных на ДИСК.

Активация прокаспазы-8 сопровождается ее обработкой, которая происходит в несколько этапов. В данной работе описан налаженный экспериментальный рабочий процесс, позволяющий измерять образование DISC и обрабатывать прокаспазу-8 в данном комплексе. Рабочий процесс основан на методах иммунопреципитации, поддерживаемых анализом вестерн-блоттинга. Этот рабочий процесс позволяет тщательно контролировать различные этапы набора прокаспазы-8 в DISC и его обработку и очень актуален для исследования молекулярных механизмов внешнего апоптоза.

Introduction

Одним из наиболее изученных рецепторов смерти (DR) является CD95 (Fas, APO-1). Внешний апоптотический путь начинается с взаимодействия ДР с его родственным лигандом, т.е. CD95L взаимодействует с CD95 или TRAIL связывается с TRAIL-Rs. Это приводит к образованию DISC на соответствующем DR. DISC состоит из cd95, FADD, прокаспазы-8/-10 и c-FLIP белков^1,2. Кроме того, DISC собирается путем взаимодействия между белками, содержащими домен смерти (DD), такими как CD95 и FADD, и DED-содержащими белками, такими как FADD, прокаспаза-8/-10 и c-FLIP(рисунок 1). Прокаспаза-8 подвергается олигомеризации посредством ассоциации своих DED, что приводит к образованию DED-нитей с последующей активацией и обработкой прокаспазы-8. Это запускает каскад каспазы, который приводит к гибели клеток(рисунок 1)^3,4. Таким образом, прокаспаза-8 является центральным инициатором каспазы внешнего пути апоптоза, опосредованного CD95 или TRAIL-Rs, активированным на соответствующей макромолекулярной платформе, DISC.

Известно, что две изоформы прокаспазы-8, а именно прокаспаза-8а (p55) и -8b (p53), рекрутируются в DISC^5. Обе изоформы состоят из двух DED. DED1 и DED2 расположены в N-концевой части прокаспазы-8a/b, за которой следуют каталитические домены p18 и p10. Детальный криоэлектронный микроскопический (крио-ЭМ) анализ DED прокаспазы-8 выявил сборку белков прокаспазы-8 в нитевидные структуры, называемые^{DED-нитями 4,6.} Примечательно, что первоначально предполагалось, что линейные цепи прокаспазы-8 будут заниматься димеризацией с последующей активацией прокаспазы-8 на ДИСК. Теперь известно, что эти цепи являются лишь подструктурой прокаспазы-8 ПСД, последняя состоит из трех цепей, собранных в тройную^{спираль 3,4,6,7.}

При димеризации на нити DED конформационные изменения прокаспазы-8а/б приводят к образованию активного центра прокаспазы-8 и ее активации^3,8. За этим следует обработка прокаспазы-8, которая опосредована двумя путями: первый идет через генерацию продукта расщепления p43 / p41, а второй - через начальное поколение продукта расщепления p30. Путь p43/p41 инициируется расщеплением прокаспазы-8a/b в Asp374, в результате чего образуются продукты расщепления p43/p41 и p12(рисунок 2). Далее эти фрагменты автокаталитически расщепляются на Asp384 и Asp210/216, давая начало образованию активного гетеротетрамера каспазы-8, p10₂/p18₂^9,10,11. Кроме того, было показано, что параллельно пути обработки p43/p41 прокаспаза-8a/b также расщепляется на Asp216, что приводит к образованию продукта С-концевого расщепления p30 с последующим его протеолизом на p10 и p18¹⁰ (фиг.2).

Активация прокаспазы-8a/b в нити DED строго регулируется белками, называемыми c-FLIPs^12. Белки c-FLIP встречаются в трех изоформах: c-FLIP_Long (c-FLIP_L),c-FLIP_Short (c-FLIP_S)и c-FLIP_Raji (c-FLIP_R). Все три изоформы содержат два DED в их N-концевой области. c-FLIP_L также имеет С-концевой каталитически неактивный каспазоподобный домен^12,13. Обе короткие изоформы c-FLIP-c-FLIP_S и c-FLIP_R-действуют антиапоптотическим образом, нарушая образование нити DED на^{ДИСКЕ 6,14,15.} Кроме того, c-FLIP_L может регулировать активацию каспазы-8 в зависимости от концентрации. Это может привести как к про-, так и к антиапоптотическим эффектам^16,17,18. Образуя каталитически активный гетеродимер прокаспазы-8/c-FLIP_L, c-FLIP_L приводит к стабилизации активного центра прокаспазы-8 и его активации. Про- или антиапоптотическая функция c-FLIP_L напрямую зависит от его количества на DED нитях и последующего количества собранных гетеродимеров прокаспазы-8/c-FLIP_L ^19. Низкие или промежуточные концентрации c-FLIP_L на DISC приводят к достаточному количеству гетеродимеров прокаспазы-8/c-FLIP_L на нити DED, что поддерживает активацию каспазы-8. Напротив, увеличение количества c-FLIP_L непосредственно приводит к его антиапоптотическим эффектам на DISC^20.

В совокупности активация и обработка прокаспазы-8a/b на DISC представляет собой строго регулируемый процесс, включающий несколько этапов. В данной работе рассматривается измерение обработки прокаспазы-8 непосредственно на ДИСК, а также анализ состава этого комплекса. Это будет представлено с использованием CD95 DISC в качестве образцового комплекса АВАРИЙНОГО ВОССТАНОВЛЕНИЯ.

Protocol

Эксперименты с Т-клетками проводились в соответствии с этическим соглашением 42502-2-1273 Uni MD.

1. Подготовка клеток к эксперименту

ПРИМЕЧАНИЕ: Среднее количество клеток для этой иммунопреципитации составляет 1 × 10⁷_. Адгезивные клетки должны быть посеяны за один день до эксперимента, чтобы в день эксперимента было 1 ×^{10 7} клеток.

1. Подготовка адгезивных клеток к эксперименту
   1. Семена 5-8 × 10⁶ адгезивных клеток в 20 мл среды (см. Таблицу материалов композиции) для каждого состояния в посуде по 14,5 см за день до начала эксперимента.
   2. В день эксперимента убедитесь, что клетки на 80-90% сливаются и прилипают к блюду. Выбросьте среду и добавьте свежую среду в клетки адгезивов.
2. Подготовка суспензионных клеток к эксперименту
   1. Аккуратно поместите 1 × 10⁷ суспензионных клеток в 10 мл питательной среды (см. Таблицу материалов для композиции) в каждое условие в чашках по 14,5 см непосредственно перед началом эксперимента.
   2. При использовании первичных клеток выделяют первичные Т-клетки в соответствии с ранее описанной процедурой^21. Обрабатывайте первичные Т-клетки 1 мкг/мл фитогемагглютинином в течение 24 ч, а затем 25 Ед/мл IL2 в течение 6 дней.
   3. Тщательно поместите 1 × 10⁸ первичных Т-клеток в 10 мл питательной среды (см. Таблицу материалов для композиции) в каждое условие в чашках по 14,5 см непосредственно перед началом эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется увеличить количество первичных Т-клеток, так как эти клетки меньше.

2. Стимуляция CD95L

1. Стимулируют клетки CD95L (продуцируются, как описано^{ранее 20} или коммерчески доступны (см. Таблицу материалов)).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация CD95L и время стимуляции зависят от клеточного типа^{13,15,22,23,24,25.} Подготовьте одно условие стимуляции дважды, чтобы параллельно сгенерировать образец «контроля бусины».
   1. Стимулируют адгезивные клетки выбранной концентрацией CD95L. Держите пластину под углом и пипетируйте лиганд в среду, не касаясь адгезивных клеток.
   2. Стимулируйте клетки суспензии CD95L путем пипетирования раствора лиганда в клеточную суспензию.

3. Сбор и лизис клеток

1. Поместите клеточную посуду на лед.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не выбрасывайте носитель. Умирающие клетки плавают в среде и важны для анализа.
2. Добавьте 10 мл холодного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) в клеточную суспензию и соскоблите прикрепленные ячейки с пластины. Соберите клеточную суспензию в пробирку объемом 50 мл.
3. Дважды вымойте посуду с 10 мл холодного PBS и поместите раствор для мытья в ту же трубку объемом 50 мл. Центрифугируют клеточную суспензию при 500 × г в течение 5 мин, 4 °С.
4. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте гранулу ячейки с 1 мл холодного PBS. Переложите клеточную суспензию в пробирку объемом 1,5 мл.
5. Центрифугируют клеточную суспензию при 500 × г в течение 5 мин, 4 °С. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте гранулу ячейки с 1 мл холодного PBS.
6. Центрифугируют клеточную суспензию при 500 × г в течение 5 мин, 4 °С. Откажитесь от надосадочного вещества и повторно суспендируйте клеточную гранулу с 1 мл лизисного буфера (содержащего 4% коктейля ингибитора протеазы). Инкубируйте его в течение 30 минут на льду.
7. Центрифугировать лизат с максимальной скоростью (~17 000 × g)в течение 15 мин, 4 °C.
8. Переложите супернатант (лизат) в чистую трубку. Выбросьте гранулу. Возьмите 50 мкл лизата в другой пробирке. Проанализируйте концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда и возьмите количество лизата, соответствующее 25 мкг белка во флаконе. Добавьте буфер загрузки (см. Таблицу материалов для состава) во флакон. Храните его при температуре -20 °C в качестве контроля лизата.

4. Иммунопреципитация (ИП)

1. Добавьте к лизату 2 мкл антител против АПО-1 и 10 мкл бусин сефарозы белка А (приготовленных по рекомендации производителя). Добавьте только 10 мкл шариков в отдельную пробирку, содержащую лизат (стимулированный образец), чтобы создать «контроль шариков».
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте наконечники пипетки с широкими отверстиями, либо разрезая наконечники, либо покупая специальные наконечники для IP при работе с бусинами сефарозы белка А.
2. Инкубировать смесь лизата с антителами/белком А сефарозными шариками с мягким перемешиванием в течение ночи при 4 °C. Центрифугировать лизаты антителами/белком А сефарозными шариками при 500 × г в течение 4 мин, 4 °С. Выбросьте супернатант, добавьте в бусины 1 мл холодного PBS и повторите этот шаг не менее трех раз.
3. Выбросьте супернатант. Аспирировать шарики предпочтительно с помощью 50 мкл гамильтоновского шприца.

5. Вестерн Блот

1. Добавьте 20 мкл 4-кратного нагрузочного буфера (см. Таблицу материалов для композиции) к шарикам и нагревайте при 95 °C в течение 10 мин. Нагревайте элементы управления лизатом при 95 °C в течение 5 мин.
2. Загрузите лизаты, IP и белковый стандарт на 12,5% гель додецилсульфата натрия (SDS) (см. Таблицу материалов для приготовления геля) и работайте с постоянным напряжением 80 В.
3. Перенесите белки из геля SDS в нитроцеллюлозную мембрану.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь полусухой метод, оптимизированный для интересующих белков, был использован для переноса в течение 12 мин (25 В; 2,5 А = постоянная). Замочите нитроцеллюлозную мембрану и две мини-стопки переноса в буфере электрофореза (см. Таблицу материалов для композиции, подготовьте согласно инструкции производителя) за несколько минут до вестерн-блоттинга.
4. Поместите промокаемую мембрану в коробку и заблокируйте ее на 1 ч в блокирующем растворе (0,1% Tween-20 в PBS (PBST) + 5% в молоке). Инкубировать мембрану блокирующим раствором при мягком перемешивании.
5. Промывайте мембрану три раза ПБСТ в течение 5 мин каждую стирку.

6. Обнаружение вестерн-блоттинга

1. Добавьте первое первичное антитело в указанном разведении (см. Таблицу материалов)к мембране и инкубируйте его в течение ночи при 4 °C с мягким перемешиванием.
2. Промывайте мембрану три раза ПБСТ в течение 5 мин каждую стирку.
3. Инкубировать мембрану с 20 мл вторичного антитела (разбавленного 1:10 000 в ПБСТ + 5% молока) с легким встряхиванием в течение 1 ч при комнатной температуре.
4. Промывайте мембрану три раза ПБСТ в течение 5 мин каждую стирку.
5. Отбросьте ПБСТ и добавьте примерно 1 мл субстрата пероксидазы хрена в мембрану.
6. Обнаружение хемолуминесцентного сигнала (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время экспозиции и количество захваченных изображений зависят от количества белка в клетке и специфичности используемых антител. Он должен быть установлен эмпирически для каждого антитела, используемого для обнаружения.

Results

Для анализа набора каспазы-8 в DISC и ее обработки на CD95 DISC, в этой статье описывается классический рабочий процесс, который сочетает IP CD95 DISC с западным блот-анализом. Это позволяет обнаружить несколько ключевых особенностей активации каспазы-8 на ДИСК: сборка макромолекулярной платформы, активирующей каспазу-8, рекрутирование прокаспазы-8 в ДИСК и обработка этой инициаторной каспазы(рис. 1 и Фиг.2). Этот рабочий процесс включает в себя лечение чувствит...

Discussion

Этот подход был впервые описан Kischkel et al.²⁷ и с тех пор успешно разработан несколькими группами. Необходимо рассмотреть несколько важных вопросов для эффективной обработки DISC-иммунопреципитации и мониторинга каспазы-8 в этом комплексе.

Во-первых, важно соблюдать все этапы промывки во время иммунопреципитации. Особенно важны заключительные этапы промывки бусин сефарозы и сушка бусин сефарозы. Это должно быть сделано правильно, чтобы увеличить соотношение сигнал/шу...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12,5% гель SDS	для		двух разделительных гелей: 3,28 мл дистиллированный H2O 2,5 мл Tris; pH 8,8; 1,5 M 4,06 мл акриламида 100; L 10% SDS 100 &; L 10% APS 7,5 &; L TEMED для двух собирающих гелей: 3,1 мл дистиллированного H2O 1,25 мл Tris; рН 6,8; 1,5 м<бр/> 0,5 мл акриламида<бр/> 50 мкм; L 10% SDS 25 &; L 10% APS 7,5 &; L TEMED
14,5 см клеточные чашки	Greiner	639160
акриламид	Carl Roth	A124.1
Аэрозольный фильтр наконечники для пипеток с фильтром высокой степени восстановления и широким отверстием	VWR	46620-664 (Северная Америка) или 732-0559 (Европа)	Используется для пипетирования шариков до лизата
антиактина Ab	Sigma Aldrich	A2103	разведение: 1:4000 в PBST + 1:100 NaN<суб>3
anti-APO-1 Ab	предоставленный в этих экспериментах профессором. Краммером или может быть приобретен компанией Enzo	ALX-805-038-C100	используемый только для иммунопреципитации
анти-каспазы-10 Ab	Biozol	MBL-M059-3	разведение: 1:1000 в PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-3	клеточная сигнализация	9662 S	разведение: 1:2000 в PBST + 1:100 NaN3
анти-каспазаза-8 Ab C15	предоставлен в этих экспериментах профессором. Краммером или может быть приобретен ENZO	ALX-804-242-C100	разведение: 1:20 в PBST + 1:100 NaN3
anti-CD95 Ab	Santa Cruz	sc-715	разведение: 1:2000 в PBST + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Ab	предоставлен в этих экспериментах профессором. Краммером или может быть приобретен ENZO	ALX-804-961-0100	разведение: 1:10 в PBST + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Ab	предоставлено в этих экспериментах профессором. Краммером или может быть приобретено ENZO	ADI-AAM-212-E	разведение: 1:10 в PBST + 1:100 NaN3
anti-PARP	Ab cell signal	9542	разведение: 1:1000 в PBST + 1:100 NaN3
APS	Carl Roth	9592.3
β-меркаптоэтанол	Carl Roth	4227.2
Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml	Bio Rad	500-0006	используется в соответствии с инструкциями производителя
CD95L,	предоставленными в этих экспериментах профессором. Краммером, или может быть приобретен ENZO	ALX-522-020-C005
хемолюминесцентный детектор Chem Doc XRS+	Bio Rad
cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC)	Sigma Aldrich	11 836 145 001	приготовлен в соответствии с инструкцией производителя
DPBS (10x) без Ca, Mg	PAN Biotech	P04-53500	разведение 1:10 с H2O, хранение в холодильнике
электрофорез	буфер собственного приготовления		10x Буфер для электрофореза: 60,6 г Tris 288 г глицина 20 г SDS ad 2 л H2O разведение 1:10 перед применением
глицин	Carl Roth	3908.3
Goat Anti-Mouse IgG1 HRP	SouthernBiotech	1070-05	разведение 1:10.000 в PBST + 5% молока
Goat Anti-mouse IgG2b HRP	SouthernBiotech	1090-05	разведение 1:10.000 в PBST + 5% молочный козий
Anti-rabbit IgG-HRP	SouthernBiotech	4030-05	разведение 1:10.000 в PBST + 5% молочный
интерлейкин-2 Human(hIL-2)	Merckgroup/ Roche	11011456001	для активации Т-клеток
KCl	Carl Roth	6781.2
KH2PO4	Carl Roth	3904.1
загрузочный буфер 4x Laemmli Sample Buffer, 10 мл	Bio Rad	161-0747	приготовлен в соответствии с инструкциями производителя
Luminata Forte Western HRP субстрат	Millipore	WBLUFO500
лизисный буфер	собственного производства		13,3 мл Tris-HCl; pH 7,4; 1,5 M 27,5 мл NaCl; 5 M 10 мл EDTA; 2 mM 100 мл Triton X-100 добавить 960 мл H2O
среда для адарентных клеток DMEM F12 (1:1) со стабильным глутамином,  2,438 г/л	PAN	Biotech P04-41154	с добавлением 10% FCS, 1% пенициллин-стрептомицина и 0,0001% пуромицина в среду
для первичных Т-клеток	gibco от Life Technologie	21875034	добавлением 10% FCS и 1% пенициллин-стрептомицина в среду
сухого молока	Carl Roth	T145.4
Na2HPO4	Carl	Roth P030.3
NaCl	Carl Roth	3957.2
PBST	собственного производства		20x PBST: 230 г NaCl 8 г KCl 56,8 г Na2HPO4 8 г KH2PO4 20 мл Tween-20 ad 2 л H2O разведение 1:20 перед использованием
PBST + 5% молоко	собственного приготовления		50 г сухого молока + 1 л PBST
	Thermo Fisher Scientific	R30852801	для активации Т-клеток
Power Pac HC	Bio Rad
Precision Plus Protein Standard All Blue	Bio Rad	161-0373	использование между 3-5 и микро;
L Protein A Сефароза CL-4B бусины	Novodirect/ Th.Geyer	GE 17-0780-01	аффинность смолы гранулы приготовлены в соответствии с инструкциями производителя
скребок	VWR	734-2602
SDS	Carl Roth	4360.2
шейкер	Heidolph
азид натрия	Carl Roth	K305.1
TEMED	Carl Roth	2367.3
Trans Blot Turbo мини-размер стеки для переноса	Bio Rad	170-4270	используются согласно инструкции производителя
TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer	Rad	10026938	приготовлен в соответствии с инструкциями производителя
TransBlot Turbo Mini-size нитроцеллюлозная мембрана	Bio Rad	170-4270	используется в соответствии с инструкцией производителя
Trans-Blot-Turbo	Bio Rad
Tris	Chem Solute	8,08,51,000
Triton X-100	Carl Roth	3051.4
Tween-20	Pan Reac Appli Chem	A4974,1000