Измерение состава CD95 Индуцирующего Смерть Сигнального Комплекса и Обработка Прокаспазы-8 в этом Комплексе

Summary

Здесь представлен экспериментальный рабочий процесс, позволяющий обнаружить обработку каспазы-8 непосредственно на вызывающем смерть сигнальном комплексе (DISC) и определяющий состав этого комплекса. Эта методология имеет широкое применение, от разгадки молекулярных механизмов путей гибели клеток до динамического моделирования сетей апоптоза.

Abstract

Внешний апоптоз опосредован активацией рецепторов смерти (DR), таких как CD95/Fas/APO-1 или связанный с фактором некроза опухоли апоптоз-индуцирующий лиганд (TRAIL)-рецептор 1/рецептор 2 (TRAIL-R1/R2). Стимуляция этих рецепторов их родственными лигандами приводит к сборке вызывающего смерть сигнального комплекса (DISC). DISC содержит DR, адапторный белок Fas-ассоциированный белок с доменом смерти (FADD), прокаспазы-8/-10 и клеточные FADD-подобные интерлейкин (IL)-1β-превращающие фермент-ингибирующие белки (c-FLIP). DISC служит платформой для обработки и активации прокаспазы-8. Последнее происходит через его димеризацию/олигомеризацию в нитях эффекторного домена смерти (DED), собранных на ДИСК.

Активация прокаспазы-8 сопровождается ее обработкой, которая происходит в несколько этапов. В данной работе описан налаженный экспериментальный рабочий процесс, позволяющий измерять образование DISC и обрабатывать прокаспазу-8 в данном комплексе. Рабочий процесс основан на методах иммунопреципитации, поддерживаемых анализом вестерн-блоттинга. Этот рабочий процесс позволяет тщательно контролировать различные этапы набора прокаспазы-8 в DISC и его обработку и очень актуален для исследования молекулярных механизмов внешнего апоптоза.

Introduction

Одним из наиболее изученных рецепторов смерти (DR) является CD95 (Fas, APO-1). Внешний апоптотический путь начинается с взаимодействия ДР с его родственным лигандом, т.е. CD95L взаимодействует с CD95 или TRAIL связывается с TRAIL-Rs. Это приводит к образованию DISC на соответствующем DR. DISC состоит из cd95, FADD, прокаспазы-8/-10 и c-FLIP белков^1,2. Кроме того, DISC собирается путем взаимодействия между белками, содержащими домен смерти (DD), такими как CD95 и FADD, и DED-содержащими белками, такими как FADD, прокаспаза-8/-10 и c-FLIP(рисунок 1). Прокаспаза-8 подвергает....

Protocol

Эксперименты с Т-клетками проводились в соответствии с этическим соглашением 42502-2-1273 Uni MD.

1. Подготовка клеток к эксперименту

ПРИМЕЧАНИЕ: Среднее количество клеток для этой иммунопреципитации составляет 1 × 10⁷_. Адгезивные клетки должны быть посеяны за один день до эксперимента, чтобы в день эксперимента было 1 ×^{10 7} клеток.

1. Подготовка адгезивных клеток к эксперименту
   1. Семена 5-8 × 10⁶ адгезивных клеток в 20 мл среды (см. Таблицу материалов композиции) для каждого состояния в посуде по 14,5 см за день до начала эксперимента.

Results

Для анализа набора каспазы-8 в DISC и ее обработки на CD95 DISC, в этой статье описывается классический рабочий процесс, который сочетает IP CD95 DISC с западным блот-анализом. Это позволяет обнаружить несколько ключевых особенностей активации каспазы-8 на ДИСК: сборка макромолекулярной платформы, активирующей каспазу-8, рекрутирование прокаспазы-8 в ДИСК и обработка этой инициаторной каспазы(рис. 1 и Фиг.2). Этот рабочий процесс включает в себя лечение чувствит.......

Discussion

Этот подход был впервые описан Kischkel et al.²⁷ и с тех пор успешно разработан несколькими группами. Необходимо рассмотреть несколько важных вопросов для эффективной обработки DISC-иммунопреципитации и мониторинга каспазы-8 в этом комплексе.

Во-первых, важно соблюдать все этапы промывки во время иммунопреципитации. Особенно важны заключительные этапы промывки бусин сефарозы и сушка бусин сефарозы. Это должно быть сделано правильно, чтобы увеличить соотношение сигнал/шу.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12,5% гель SDS	для		двух разделительных гелей: 3,28 мл дистиллированный H2O 2,5 мл Tris; pH 8,8; 1,5 M 4,06 мл акриламида 100; L 10% SDS 100 &; L 10% APS 7,5 &; L TEMED для двух собирающих гелей: 3,1 мл дистиллированного H2O 1,25 мл Tris; рН 6,8; 1,5 м<бр/> 0,5 мл акриламида<бр/> 50 мкм; L 10% SDS 25 &; L 10% APS 7,5 &; L TEMED
14,5 см клеточные чашки	Greiner	639160
акриламид	Carl Roth	A124.1
Аэрозольный фильтр наконечники для пипеток с фильтром высокой степени восстановления и широким отверстием	VWR	46620-664 (Северная Америка) или 732-0559 (Европа)	Используется для пипетирования шариков до лизата
антиактина Ab	Sigma Aldrich	A2103	разведение: 1:4000 в PBST + 1:100 NaN<суб>3
anti-APO-1 Ab	предоставленный в этих экспериментах профессором. Краммером или может быть приобретен компанией Enzo	ALX-805-038-C100	используемый только для иммунопреципитации
анти-каспазы-10 Ab	Biozol	MBL-M059-3	разведение: 1:1000 в PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-3	клеточная сигнализация	9662 S	разведение: 1:2000 в PBST + 1:100 NaN3
анти-каспазаза-8 Ab C15	предоставлен в этих экспериментах профессором. Краммером или может быть приобретен ENZO	ALX-804-242-C100	разведение: 1:20 в PBST + 1:100 NaN3
anti-CD95 Ab	Santa Cruz	sc-715	разведение: 1:2000 в PBST + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Ab	предоставлен в этих экспериментах профессором. Краммером или может быть приобретен ENZO	ALX-804-961-0100	разведение: 1:10 в PBST + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Ab	предоставлено в этих экспериментах профессором. Краммером или может быть приобретено ENZO	ADI-AAM-212-E	разведение: 1:10 в PBST + 1:100 NaN3
anti-PARP	Ab cell signal	9542	разведение: 1:1000 в PBST + 1:100 NaN3
APS	Carl Roth	9592.3
β-меркаптоэтанол	Carl Roth	4227.2
Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml	Bio Rad	500-0006	используется в соответствии с инструкциями производителя
CD95L,	предоставленными в этих экспериментах профессором. Краммером, или может быть приобретен ENZO	ALX-522-020-C005
хемолюминесцентный детектор Chem Doc XRS+	Bio Rad
cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC)	Sigma Aldrich	11 836 145 001	приготовлен в соответствии с инструкцией производителя
DPBS (10x) без Ca, Mg	PAN Biotech	P04-53500	разведение 1:10 с H2O, хранение в холодильнике
электрофорез	буфер собственного приготовления		10x Буфер для электрофореза: 60,6 г Tris 288 г глицина 20 г SDS ad 2 л H2O разведение 1:10 перед применением
глицин	Carl Roth	3908.3
Goat Anti-Mouse IgG1 HRP	SouthernBiotech	1070-05	разведение 1:10.000 в PBST + 5% молока
Goat Anti-mouse IgG2b HRP	SouthernBiotech	1090-05	разведение 1:10.000 в PBST + 5% молочный козий
Anti-rabbit IgG-HRP	SouthernBiotech	4030-05	разведение 1:10.000 в PBST + 5% молочный
интерлейкин-2 Human(hIL-2)	Merckgroup/ Roche	11011456001	для активации Т-клеток
KCl	Carl Roth	6781.2
KH2PO4	Carl Roth	3904.1
загрузочный буфер 4x Laemmli Sample Buffer, 10 мл	Bio Rad	161-0747	приготовлен в соответствии с инструкциями производителя
Luminata Forte Western HRP субстрат	Millipore	WBLUFO500
лизисный буфер	собственного производства		13,3 мл Tris-HCl; pH 7,4; 1,5 M 27,5 мл NaCl; 5 M 10 мл EDTA; 2 mM 100 мл Triton X-100 добавить 960 мл H2O
среда для адарентных клеток DMEM F12 (1:1) со стабильным глутамином,  2,438 г/л	PAN	Biotech P04-41154	с добавлением 10% FCS, 1% пенициллин-стрептомицина и 0,0001% пуромицина в среду
для первичных Т-клеток	gibco от Life Technologie	21875034	добавлением 10% FCS и 1% пенициллин-стрептомицина в среду
сухого молока	Carl Roth	T145.4
Na2HPO4	Carl	Roth P030.3
NaCl	Carl Roth	3957.2
PBST	собственного производства		20x PBST: 230 г NaCl 8 г KCl 56,8 г Na2HPO4 8 г KH2PO4 20 мл Tween-20 ad 2 л H2O разведение 1:20 перед использованием
PBST + 5% молоко	собственного приготовления		50 г сухого молока + 1 л PBST
	Thermo Fisher Scientific	R30852801	для активации Т-клеток
Power Pac HC	Bio Rad
Precision Plus Protein Standard All Blue	Bio Rad	161-0373	использование между 3-5 и микро;
L Protein A Сефароза CL-4B бусины	Novodirect/ Th.Geyer	GE 17-0780-01	аффинность смолы гранулы приготовлены в соответствии с инструкциями производителя
скребок	VWR	734-2602
SDS	Carl Roth	4360.2
шейкер	Heidolph
азид натрия	Carl Roth	K305.1
TEMED	Carl Roth	2367.3
Trans Blot Turbo мини-размер стеки для переноса	Bio Rad	170-4270	используются согласно инструкции производителя
TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer	Rad	10026938	приготовлен в соответствии с инструкциями производителя
TransBlot Turbo Mini-size нитроцеллюлозная мембрана	Bio Rad	170-4270	используется в соответствии с инструкцией производителя
Trans-Blot-Turbo	Bio Rad
Tris	Chem Solute	8,08,51,000
Triton X-100	Carl Roth	3051.4
Tween-20	Pan Reac Appli Chem	A4974,1000