Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка локализации субпохондриального белка в почковых дрожжах Saccharomyces cerevisiae

2.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62853

⸱

19 июля 2021 г.

 ,  ,  , 
1Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo

В этой статье

Краткое содержание

Несмотря на недавние достижения, многие дрожжевые митохондриальные белки по-прежнему остаются со своими функциями совершенно неизвестными. Этот протокол обеспечивает простой и надежный метод определения субтохондриальной локализации белков, который был основополагающим для выяснения их молекулярных функций.

Аннотация

Несмотря на недавние успехи в характеристике митохондриального протеома дрожжей, субпохондриальная локализация значительного числа белков остается неуловимой. Здесь мы описываем надежный и эффективный метод определения суборганелларной локализации дрожжевых митохондриальных белков, который считается фундаментальным шагом при выяснении функции митохондриального белка. Этот метод включает в себя начальный этап, который заключается в получении высокочистых интактных митохондрий. Эти митохондриальные препараты затем подвергают протоколу субфракционации, состоящему из гипотонического шока (отека) и инкубации с протеиназой К (протеазой). Во время отека внешняя митохондриальная мембрана избирательно нарушается, позволяя протеиназе К переваривать белки межмембранного космического отсека. Параллельно для получения информации о топологии мембранных белков митохондриальные препараты сначала обрабатывают ультразвуком, а затем подвергают щелочной экстракции карбонатом натрия. Наконец, после центрифугирования фракции гранул и супернатантов из этих различных обработок анализируются с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Постохондриальная локализация, а также мембранная топология интересующего белка получены путем сравнения его западного блот-профиля с известными стандартами.

Введение

Митохондрии являются важнейшими органеллами эукариотических клеток, которые играют решающую роль в биоэнергетике, клеточном метаболизме и сигнальных путях1. Для правильного выполнения этих задач митохондрии полагаются на уникальный набор белков и липидов, отвечающих за их структуру и функцию. Почковые дрожжи Saccharomyces cerevisiae широко используются в качестве модельной системы для исследований митохондриальных процессов, а также для других органелл2. Митохондриальный геном кодирует только восемь белков в дрожжах; подавляющее большинство митохондриальных белков (~99%) кодируются ядерными генами, которые транслируются на цитозольных рибосомах, а затем импортируются в их правильные притохондриальные компартменты сложными механизмами импорта белка3,4,5. Таким образом, митохондриальный биогенез зависит от скоординированной экспрессии как ядерного, так и митохондриального геномов6,7. Генетические мутации, вызывающие дефекты митохондриального биогенеза, связаны с заболеваниями человека8,9,10.

За последние два десятилетия высокопроизводительные протеомные исследования, нацеленные на высокоочищенные митохондрии, привели к всесторонней характеристике дрожжевого митохондриального протеома, который, по оценкам, состоит из не менее 900 белков11,12,13,14. Хотя эти исследования предоставили ценную информацию, суборганелларная локализация каждого белка в четырех митохондриальных подкомпартментах, а именно внешней мембране (OM), межмембранном пространстве (IMS), внутренней мембране (IM) и матрице, все еще требуется. Этот вопрос был частично решен с помощью протеомных исследований двух меньших митохондриальных подкомпартментов (OM и IMS)15,16. Совсем недавно Vögtle и его коллеги сделали большой шаг вперед, создав высококачественную глобальную карту распределения субтохондриального белка в дрожжах. Используя комплексный подход, сочетающий количественную масс-спектрометрию на основе SILAC, различные протоколы фракционирования постохондрий и набор данных из протеомов OM и IMS, авторы выделили 818 белков в четыре митохондриальных подкомпартмента13.

Несмотря на успехи, достигнутые этими высокопроизводительными протеомными исследованиями, наши знания о составе протеома постохондрий далеко не полны. Действительно, среди 986 белков, о которых Vögtle и его коллеги сообщили как локализованные в дрожжевых митохондриях, 168 не могли быть отнесены ни к одному из четырех подсоландохондриальных компартментов13. Более того, авторы не предоставили информацию о мембранной топологии белков, которые, как прогнозировалось, будут периферически прикреплены к периферии митохондриальных мембран. Например, невозможно узнать, обращен ли белок, который был назначен периферически прикрепленным к внутренней мембране, к матрице или межмембранному пространству. Помимо этих недостающих данных из общепротеомных исследований, есть противоречивая информация о суборганелларной локализации значительного числа митохондриальных белков. Одним из примеров является протеаза Prd1, которая была назначена в качестве межмембранного космического белка в общих базах данных, таких как Saccharomyces Genome Database (SGD) и Uniprot. Удивительно, но используя протокол субфракционации, подобный описанному здесь, Фёгтле и его коллеги ясно показали, что Prd1 является подлинным матричным белком13. Как упоминалось выше, необходимо прояснить или переоценить субтохондриальную локализацию многих митохондриальных белков. Здесь мы предоставляем простой и надежный протокол для определения суборганелларной локализации дрожжевых митохондриальных белков. Этот протокол был разработан и оптимизирован различными исследовательскими группами и регулярно используется для определения локализации постохондрий, а также мембранной топологии многих митохондриальных белков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Рост дрожжевых клеток

  1. Изолируйте отдельные колонии интересующего штамма, переместив небольшую часть клеток из запаса глицерина -80 ° C на агаровую пластину YPD (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 2% глюкозы). Инкубировать пластину при 30 °C в течение 2-3 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм S. cerevisiae, используемый в настоящем протоколе, получен из BY4741 (MATα; его3Δ1; лей2Δ0; мет15Δ0; ura3Δ0). За исключением генов ауксотрофных маркеров, этот штамм не содержит ни одного удаленного гена и не несет никакой плазмиды. Таким образом, его можно успешно культивировать в богатой среде, стимулируя энергичный рост клеток. При работе со штаммами, трансформируемыми плазмидами, используют соответствующую минимальную среду для отбора плазмид.
  2. Подготовьте закваску путем инокуляции 2-3 отдельных колоний из агаровой пластины YPD в 10-20 мл среды YPGal (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 2% галактозы) в колбе Эрленмейера объемом 100 мл. Инкубировать при 30 °C в течение 24 ч с энергичным встряхиванием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор питательной среды зависит от штамма дрожжей, используемого в протоколе. Как YPD, так и YPGal содержат ферментируемые источники углерода, которые позволяют расти штаммам, которые не выполняют митохондриальное дыхание. Однако, поскольку глюкоза подавляет экспрессию многих митохондриальных генов, не рекомендуется использовать этот источник углерода, поскольку он будет производить меньшее количество митохондрий. При работе с респираторными компетентными штаммами, которые могут дыхнуть, также можно использовать источники углерода, такие как глицерин и этанол, в попытке получить более высокий выход митохондрий.
  3. Разбавьте закваску в 1 л свежей среды YPGal до OD600 менее 0,1. Культивируют клетки при 30 °C с энергичным встряхиванием до тех пор, пока OD600 не достигнет 1-1,5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Определите скорость роста (время удвоения) для каждого штамма дрожжей перед выполнением эксперимента. Это позволит получить точную оценку времени инкубации, необходимого для того, чтобы культура достигла OD600 1-1,5.

2. Выделение высокоочищенных митохондрий

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол адаптирован с17, с незначительными изменениями.

  1. Собирают клетки методом центрифугирования при 3000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  2. Промыть ячейки дистиллированной водой и собрать их центрифугированием при 3000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  3. Определите влажный вес клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Самый простой способ измерить вес гранулы ячейки на этапе 2.2 - это определить вес пустой трубки центрифуги непосредственно перед сбором ячеек. После центрифугирования отбросьте супернатант и измерьте массу той же трубки с клетками. Вес клеток — это разница между двумя измерениями.
  4. Повторное суспендирование клеток в буфере DTT (2 мл на 1 г клеток) с помощью пипетки Пастера или наконечника P5000. В таблице 1 приведена информация о составе буфера ДДТ.
  5. Инкубируйте клетки при 30 °C в течение 20 мин с легким встряхиванием (~70 об/мин).
  6. Центрифуга при 3000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре для гранулирования ячеек.
  7. Промыть клетки с помощью зимолиазного буфера без фермента (около 7 мл на 1 г клеток).
    См. таблицу 1 для буферной композиции зимолиазы.
  8. Центрифуга при 3000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре для гранулирования ячеек.
  9. Повторное суспендирование клеток в буфере без зимолиазы (7 мл на 1 г клеток).
  10. Переложите клеточную суспензию в колбу Эрленмейера объемом 250 мл и добавьте Зимолязу-20Т (3 мг на г живого веса).
  11. Инкубировать клетки при 30 °C в течение 30-40 мин с легким встряхиванием (~70 об/мин). Проверьте эффективность этого процесса, сравнив мутность клеточной суспензии до и после лечения зимолиазой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе клетки будут преобразованы в сферопласты из-за переваривания клеточной стенки зимолиазой.
    1. Для этого добавляют по 50 мкл каждой клеточной суспензии в отдельные стеклянные трубки, содержащие 2 мл воды. После энергичного перемешивания мутность клеточной суспензии, обработанной зимолязой, должна быстро уменьшаться из-за осмотического нарушения сферопластов. С другой стороны, мутность необработанной клеточной суспензии должна оставаться неизменной.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эффекты мутности также можно контролировать с помощью простого визуального осмотра или путем измерения OD600 обоих образцов. Во втором случае OD600 образца, обработанного зимолиазой, должен составлять 10-20% от необработанного образца. Альтернативный метод включает подсчет клеток в обоих образцах с помощью световой микроскопии.
    2. Если выход образования сферопластов низкий, добавляют больше зимолязы и инкубируют в течение еще 15 мин интервала.
  12. Собирают сферопласты центрифугированием при 2500 х г в течение 5 мин при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все дальнейшие шаги следует проводить быстро и на льду или при 4 °C, чтобы избежать деградации белка гидролитическими ферментами.
  13. Дважды промыть сферопласты ледяным буфером гомогенизации (около 6,5 мл на 1 г клеток) и гранулированием центрифугированием при 2 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. См. таблицу 1 для буферного состава гомогенизации.
  14. Повторно суспендируют сферопласты в буфере гомогенизации ледяного холода (6,5 мл на 1 г клеток) и переносят его в предварительно охлажденный стеклянный гомогенизатор Dounce. Используйте большой гомогенизатор стекла примерно 30 мл.
  15. Гомогенизируйте сферопласты 15 ударами с помощью пестика.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ударов должно быть отрегулировано в зависимости от посадки пестика. Для тугого пестика достаточно 15 ударов. С другой стороны, при использовании рыхлого пестика рекомендуется выполнять до 25 ударов.
  16. Переложите гомогенат в трубку центрифуги объемом 50 мл и добавьте 1 объем буфера гомогенизации ледяного холода.
  17. Центрифугируйте гомогенат на низкой скорости, 1,500 x g в течение 5 мин при 4 °C к ядрам гранул, клеточному мусору и неразрывным клеткам.
  18. Перенесите супернатант в новую центрифужную трубку объемом 50 мл с помощью пипетки Пастера или наконечника P5000, позаботившись о том, чтобы избежать разрушения гранулы.
  19. Центрифуга при 4 000 х г в течение 5 мин при 4 °C.
  20. Переложите супернатант в высокоскоростную центрифужную трубку и центрифугу при 12 000 х г в течение 15 мин при 4 °C в гранулу сырой фракции митохондрий.
  21. Отбросьте надосадочный материал и аккуратно промыть сырую митохондриальную гранулу в буфере гомогенизации ледяного холода объемом 20-30 мл путем бережного пипетирования с использованием наконечника P5000.
  22. Переложите суспензию в центрифужную трубку объемом 50 мл и центрифугу при 4000 х г в течение 5 мин при 4 °C, чтобы гранулировать оставшийся клеточный мусор.
  23. Переложите супернатант в высокоскоростную центрифужную трубку и центрифугу при 12 000 х г в течение 15 мин при 4 °C в гранулу сырой фракции митохондрий.
  24. Выбросьте супернатант и осторожно повторно суспендируйте сырую митохондриальную гранулу в небольшом объеме (обычно 1000 мкл) ледяного буфера SEM путем мягкого пипетирования с использованием наконечника P1000. См. таблицу 1 для состава буфера SEM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя эта сырая митохондриальная фракция может быть использована непосредственно в некоторых приложениях, таких как импортные анализы белка органелло , она содержит значительное количество других клеточных компонентов. Эти загрязнения могут привести к неправильной интерпретации результатов при определении субтохондриальной локализации белка. Поэтому для получения высокоочищенного митохондриального препарата требуются дальнейшие этапы очистки, как описано ниже.
  25. Готовят растворы сахарозы в ЭМ-буфере в концентрациях 60%, 32%, 23% и 15% (мас./об.). Эти растворы стабильны до 1 месяца при 4 °C. См. таблицу 1 состава эм-буфера.
  26. Подготовьте 4-ступенчатый градиент сахарозы в ультрацентрифужной трубке следующим образом: Поместите 1,5 мл 60% (мас./об.) сахарозы на дно трубки центрифуги. Далее пипетку осторожно ступенчато: 4 мл 32%, 1,5 мл 23% и 1,5 мл 15% сахарозы (мас./об.). Позаботьтесь о том, чтобы не нарушить фазы.
  27. Осторожно загрузите сырую митохондриальную фракцию поверх градиента сахарозы.
  28. Центрифуга в течение 1 ч при 134 000 х г при 4 °C в качающемся роторе ковша.
  29. Осторожно продолжайте удалять раствор сахарозы до тех пор, пока не будет достигнута высокоочищенная фракция митохондрий, которая представлена коричневой полосой на границе раздела сахарозы 60%/32%.
  30. Извлеките очищенные митохондрии с помощью режущего наконечника P1000 и поместите его в предварительно охлажденную высокоскоростную центрифужную трубку.
  31. Разбавляют восстановленные митохондрии 5-10 объемами ледяного SEM-буфера.
  32. Центрифуга в течение 30 мин при 12 000 х г при 4 °C.
  33. Повторное суспендирование чистых митохондрий в 500 мкл ледяного буфера SEM путем бережной пипетки с использованием режущего наконечника P1000.
  34. Определить концентрацию белка высокоочищенного митохондриального препарата с помощью процедуры Брэдфорда в соответствии с инструкциями производителя. Отрегулируйте концентрацию белка до 10 мг белка/мл с помощью ледяного SEM-буфера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для протокола фракционирования эссетохондрий, описанного ниже, рекомендуется использовать свежеприготовленные митохондрии. Тем не менее, Vögtle и его коллеги провели подробный анализ контроля качества митохондриальной интактности и показали, что замороженные органеллы также могут быть использованы в этом протоколе13. Для этого делают аликвоты по 40 мкл и замораживают их в жидком азоте. Хранить при температуре -80 °C.

3. Протокол индохондриального фракционирования

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол адаптирован из ссылки18 и состоит из двух этапов: (1) гипотонический отек в присутствии или отсутствии протеиназы К и (2) обработка ультразвуком с последующей экстракцией карбоната. Выполняйте все этапы обоих протоколов на льду или при 4 °C, чтобы избежать деградации белка.

  1. Гипотонический отек в присутствии протеиназы К
    1. Перенесите 40 мкл высокоочищенных митохондрий по 10 мг/мл (400 мкг) в четыре предварительно охлажденные меченые микроцентрифужные трубки по 1,5 мл.
    2. Добавьте 360 мкл SEM-буфера в пробирки 1 и 2.
    3. Добавьте 360 мкл ЭМ-буфера в пробирки 3 и 4.
    4. Добавьте 4 мкл протеиназы К (10 мг/мл) в пробирки 2 и 4. Используйте схему пипетирования, приведенную в таблице 2 , чтобы избежать ошибок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте 10 мг/мл раствора протеиназы К в воде непосредственно перед использованием. Конечная концентрация протеиназы К в эксперименте должна составлять около 50-100 мкг/мл. Пожалуйста, смотрите раздел Обсуждение для получения более подробной информации.
    5. Аккуратно перемешайте все пробирки и высиживайте на льду в течение 30 минут с периодическим перемешиванием.
    6. Добавьте 4 мкл 200 мМ PMSF во все четыре пробирки, чтобы остановить активность протеиназы K.
      ВНИМАНИЕ: PMSF очень токсичен. Надевайте перчатки при работе с растворами, содержащими PMSF.
    7. Центрифуга при 20 000 х г в течение 30 мин при 4 °C.
    8. Соберите супернатант и переложите его в новую 1,5 мл предварительно охлажденную меченую микроцентрифужную трубку. Позаботьтесь о том, чтобы не нарушить гранулу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула может быть непосредственно повторно использована в буфере образца для дальнейшего анализа SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Однако следы протеиназы K могут оставаться активными даже после обработки PMSF и в конечном итоге могут переваривать некоторые белки после того, как гранула была растворена в SDS-содержащем буфере образца. Чтобы избежать этой проблемы, протеиназа К может быть полностью инактивирована путем обработки образцов трихлоруксусной кислотой (ТЦА), как описано ниже.
      ВНИМАНИЕ: ТЦА очень токсичен. Надевайте перчатки при работе с растворами, содержащими ТЦА.
    9. Повторное суспендирование гранулы со стадии 3.1.8 в 400 мкл ледяного SEM-буфера.
    10. Осаждение супернатанта (со стадии 3.1.8) и повторно суспендированной гранулы (со стадии 3.1.9) с TCA до конечной концентрации 10% (мас./об.).
    11. Высиживать все тюбики на льду в течение 10 мин.
    12. Центрифугируйте образцы, обработанные TCA, в течение 10 мин при 12 000 х г при 4 °C.
    13. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 200 мкл буфера образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, что индикатор рН бромфенола синего становится желтым из-за кислотной обработки. Если это произойдет, добавьте небольшие аликвоты (1-5 мкл) основания 1 M Tris до тех пор, пока оно не станет синим.
    14. Добавьте 4 мкл 200 мМ PMSF во все пробирки.
    15. Храните все образцы при -80 °C до дальнейшего анализа SDS-PAGE и вестерн-блоттингом.
  2. Обработка ультразвуком и карбонатная экстракция
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе нет необходимости использовать свежеприготовленные митохондрии после того, как обработка ультразвуком вызывает разрыв митохондриальных мембран.
    1. Перенесите 200 мкл высокоочищенных митохондрий при 10 мг/мл (2 мг белка) в предварительно охлажденную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
    2. Разбавьте митохондрии в один раз ледяным буфером SEM.
    3. Ультразвуковые митохондрии в течение 3 х 30 с на льду. Используйте ультразвуковой аппарат, совместимый с небольшими объемами.
    4. Центрифугируйте образец в течение 30 мин при 100 000 х г при 4 °C.
    5. Соберите супернатант и перенесите его в новую предварительно охлажденную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Держите его на льду. Этот образец будет называться растворимой белковой фракцией (S).
    6. Повторное суспендирование гранулы со стадии 3.2.4 в 400 мкл ледяного SEM-буфера.
    7. Возьмите 100 мкл повторно суспендированной гранулы со стадии 3.2.6 и переложите ее в новую предварительно охлажденную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Держите его на льду. Этот образец будет называться фракцией постохондриальных частиц (SMP).
    8. Оставшиеся 300 мкл со стадии 3.2.6 разбавить свежеприготовленным карбонатом натрия 200 мМ.
    9. Инкубируйте образец с этапа 3.2.8 на льду в течение 30 мин.
    10. Центрифугируйте образец в течение 30 мин при 100 000 х г при 4 °C.
    11. Соберите супернатант и перенесите его в новую предварительно охлажденную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Держите его на льду. Этот образец будет называться карбонатной фракцией супернатанта (CS).
    12. Повторное суспендирование гранулы со стадии 3.2.10 в 400 мкл ледяного SEM-буфера. Этот образец будет называться карбонатной осажденной фракцией (CP).
    13. Осаждение всех образцов (S, SMP, CS и CP) с TCA до конечной концентрации 10% (мас./об.).
    14. Высиживать все тюбики на льду в течение 10 мин.
    15. Центрифугируйте образцы, обработанные TCA, в течение 10 мин при 12 000 х г при 4 °C.
    16. Удалите супернатант и повторно суспендируйте каждую гранулу в буфере образца. Если буфер образца становится желтым, добавьте небольшие аликвоты (1-5 мкл) основания 1 M Tris, пока оно не станет синим.
    17. Добавьте 1 мкл 200 мМ PMSF во все пробирки.
    18. Храните все образцы при -80 °C до дальнейшего анализа SDS-PAGE и вестерн-блоттингом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Успех протокола субтохондриального фракционирования зависит от получения высокоочищенных интактных митохондрий. Для этого важно, чтобы во время лизиса дрожжевых клеток целостность органелл оставалась почти полностью сохраненной. Это достигается с помощью протокола лизиса клеток, который сочетает ферментативное сбраживание клеточной стенки с последующим физическим разрушением плазматической мембраны с использованием гомогенизатора Dounce. Затем митохондриальное содержимое собирается путем дифференциального центрифугирован...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Представленный здесь протокол успешно используется и непрерывно оптимизируется в течение длительного времени для определения локализации белка в притохондриальных компартментах13,14,18,21,22,23. Надежность и воспроизводимость этого протокола сильно зависят от чистоты и целостности митохондриальных препаратов...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарим доктора А. Цаголова (Колумбийский университет) за предоставление антител, выращенных против субтохондриальных маркерных белков Cyt. b2, αKGD и Sco1. Мы также благодарим д-ра Марио Энрике де Барроса (Университет Сан-Паулу) за полезное обсуждение и комментарии в ходе разработки этого протокола.

Эта работа была поддержана исследовательскими грантами Фонда ампаро в Пескизе сан-Паулу (FAPESP) (грант 2013/07937-8).

Фернандо Гомес и Хелена Турано также поддерживаются FAPESP, гранты 2017/09443-3 и 2017/23839-7 соответственно. Angélica Ramos также поддерживается Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Bacto PeptoneBD211677
экстракт дрожжей BactoBD212750
Ультрапрозрачные центрифужные пробирки Beckman, 14 x 89 ммBeckman Coulter344059
бычьим сывороточным альбумином (без жирных кислот BSA)Sigma-AldrichA7030Компонент гомогенизационного буфера
DL-ДитиотреитолSigma-Aldrich43815Компонент буфера ДДТ
D-сорбитSigma-AldrichS1876
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)Sigma-AldrichE9884
ГалактозаSigma-AldrichG0625
ГлюкозаSigma-AldrichG7021
MOPSSigma-AldrichM1254
Фенилметилсульфонил фторид (PMSF)Sigma-AldrichP7626Используется для инактивации протеиназы K
Фосфат калия двухосновнойSigma-AldrichP3786
Фосфат калия одноосновнойSigma-AldrichP0662
Протеиназа KSigma-Aldrich
SucroseSigma-AldrichS8501
Трихлоруксусная кислота (TCA)Sigma-AldrichT6399
Trizma BaseSigma-AldrichT1503
Zymolyase-20T из Arthrobacter luteusMP Biomedicals, Ирвайн, Калифорния320921Используется для лизирования клеточных стенок живых дрожжей с получением сферопласта

Ссылки

  1. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
  2. Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. Yeast mitochondria: An overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology. FEMS Yeast Research. 18 (5), 1-17 (2018).
  3. Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86, 685-714 (2017).
  4. Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell. 138 (4), 628-644 (2009).
  5. Schmidt, O., Pfanner, N., Meisinger, C. Mitochondrial protein import: from proteomics to functional mechanisms. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (9), 655-667 (2010).
  6. Couvillion, M. T., Soto, I. C., Shipkovenska, G., Churchman, L. S. Synchronized mitochondrial and cytosolic translation programs. Nature. 533 (7604), 499-503 (2016).
  7. Richter-Dennerlein, R., et al. Mitochondrial protein synthesis adapts to influx of nuclear-encoded protein. Cell. 167 (2), 471-483 (2016).
  8. Suomalainen, A., Battersby, B. J. Mitochondrial diseases: The contribution of organelle stress responses to pathology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (2), 77-92 (2018).
  9. Nicolas, E., Tricarico, R., Savage, M., Golemis, E. A., Hall, M. J. Disease-associated genetic variation in human mitochondrial protein import. American Journal of Human Genetics. 104 (5), 784-801 (2019).
  10. Calvo, S. E., Mootha, V. K. The mitochondrial proteome and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 11, 25-44 (2010).
  11. Reinders, J., Zahedi, R. P., Pfanner, N., Meisinger, C., Sickmann, A. Toward the complete yeast mitochondrial proteome: Multidimensional separation techniques for mitochondrial proteomics. Journal of Proteome Research. 5 (7), 1543-1554 (2006).
  12. Sickmann, A., et al. The proteome of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13207-13212 (2003).
  13. Vögtle, F. N., et al. Landscape of submitochondrial protein distribution. Nature Communications. 8 (1), 00359(2017).
  14. Morgenstern, M., et al. Definition of a high-confidence mitochondrial proteome at quantitative scale. Cell Reports. 19 (13), 2836-2852 (2017).
  15. Zahedi, R. P., et al. Proteomic analysis of the yeast mitochondrial outer membrane reveals accumulation of a subclass of preproteins. Molecular Biology of the Cell. 17 (3), 1436-1450 (2006).
  16. Vögtle, F. -N., et al. Intermembrane space proteome of yeast mitochondria. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1840-1852 (2012).
  17. Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (30), e1417(2009).
  18. Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 80 (06), 45-64 (2007).
  19. Gomes, F., et al. Proteolytic cleavage by the inner membrane peptidase (IMP) complex or Oct1 peptidase controls the localization of the yeast peroxiredoxin Prx1 to distinct mitochondrial compartments. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 17011-17024 (2017).
  20. Fujiki, Y., Hubbard, L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: Application to endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 93 (1), 97-102 (1982).
  21. Glick, B. S., et al. Cytochromes c1 and b2 are sorted to the intermembrane space of yeast mitochondria by a stop-transfer mechanism. Cell. 69 (5), 809-822 (1992).
  22. Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 65, 37-51 (2001).
  23. Glick, B. S. Pathways and energetics of mitochondrial protein import in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 260 (1992), 224-231 (1995).
  24. Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Analytical Biochemistry. 287 (2), 339-342 (2000).
  25. Meisinger, C., Pfanner, N., Truscott, K. N. Isolation of yeast mitochondria. Methods in molecular biology. 313 (1), Clifton, N.J. 33-39 (2006).
  26. Kang, Y., et al. Tim29 is a novel subunit of the human TIM22 translocase and is involved in complex assembly and stability. eLife. 5, 17463(2016).
  27. Wrobel, L., Sokol, A. M., Chojnacka, M., Chacinska, A. The presence of disulfide bonds reveals an evolutionarily conserved mechanism involved in mitochondrial protein translocase assembly. Scientific Reports. 6, 27484(2016).
  28. Callegari, S., et al. TIM29 is a subunit of the human carrier translocase required for protein transport. FEBS letters. 590 (23), 4147-4158 (2016).
  29. Neupert, W., Herrmann, J. M. Translocation of proteins into mitochondria. Annual Review of Biochemistry. 76, 723-749 (2007).
  30. Meineke, B., et al. The outer membrane form of the mitochondrial protein Mcr1 follows a TOM-independent membrane insertion pathway. FEBS Letters. 582 (6), 855-860 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Субмитохондриальная локализациямитохондриальные белкиобработка протеиназой Kгипотонический отекщелочная экстракцияSDS-PAGEвестерн-блоттингсубфракционирование митохондрий
Оценка локализации субпохондриального белка в почковых дрожжах Saccharomyces cerevisiae
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.