Методическая статья

Флуоресценция в реальном времени, обратная визуализация взъерошивания клеток и макропиноцитоз

DOI:

10.3791/62870

⸱

5 августа 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Molecular Bioscience, The University of Queensland

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол демонстрирует визуализацию декстрана в живых клетках с использованием непрерывного захвата и обратных изображений для оптимизации визуализации взъерошивания, созревания макропиносом и анализа декстрана и других клеточных меток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Макропиноцитоз является высококонсервативным, но все еще не до конца изученным процессом, который необходим для поглощения и поглощения жидкости, питательных веществ в жидкой фазе и других материалов в клетках. Резкое удлинение взъерошенных поверхностей клетки, их закрытие с образованием макропиносом и созревание интернализованных макропиносом являются ключевыми событиями в этом пути, которые может быть трудно зафиксировать с помощью обычной конфокальной визуализации, основанной на отслеживании болюса флуоресцентного груза. Флуоресцентные декстраны обычно используются экспериментально в качестве маркеров жидкой фазы для макропиносом и других эндоцитарных путей. Метод, принятый лабораторией для оптимизации визуализации поглощения декстрана, включает в себя использование живой визуализации клеток, купающихся в высоких концентрациях флуоресцентного декстрана в среде, при этом немеченые клетки выглядят рельефно (черным цветом). Оборки клеток подсвечиваются для визуализации смыкания оборки, а интернализованные макропиносомы проявляются в виде флуоресцентных вакуолей внутри клетки. Этот метод оптимален для визуализации особенностей макропиносом и позволяет легко проводить сегментацию и количественную оценку. В данной работе описывается двойная маркировка путей с помощью декстран разного размера и коэкспрессия липидных зондов и флуоресцентных мембранных белков для обозначения макропиносом и других эндосом. Также продемонстрировано обнаружение интернализованного декстрана на ультраструктурном уровне с помощью корреляционного света и электронной микроскопии (CLEM). Эти клеточные процессы могут быть визуализированы с помощью нескольких методов визуализации в реальном времени, в том числе в 3D. В совокупности эти подходы оптимизируют визуализацию макропиносом для множества различных условий и экспериментальных систем.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Большинство типов клеток позвоночных разделяют врожденную способность к неизбирательному поглощению жидкости с предшественниками на протяжении всей эволюции, восходящей к одноклеточной амебе1. Этот высококонсервативный процесс поглощения жидкой фазы макропиноцитозом (обильным питьем) используется амебой в первую очередьдля получения питательных веществ1, в то время как в клетках позвоночных он также может быть путем подачи питательных веществ в условиях стресса, и он используется иммунными клетками для отбора проб и наблюдения за тканевой средой2. Макропиноцитоз имеет особенности, которые отличают его от других форм эндоцитоза, в том числе характерные большие (>0,2 мм в диаметре) вакуолярные макропиносомы, неселективный характер поглощения жидкости и растворенных веществ и сопутствующие пространства плазматической мембраны, которые оппортунистически интернализуются в макропиносомы. Неселективный характер этого поглощения означает, что сортировка и переработка должны происходить быстро для спасения основных растворимых белков и белков плазматических мембран путем их рециркуляции обратно на поверхность клетки. Большая часть материала, попадающего в макропиносомы, предназначена для деградации в лизосомах, и он направляется в эндо/лизосомальные пути через созревание макропиносом и слияние с другими эндосомами. Белки плазматической мембраны также могут быть переработаны обратно на поверхность клетки из макропиносом. В области рака существует большой интерес к пониманию процесса макропиноцитоза, который активируется в раковых клетках и помогает поддерживать их питание и пролиферацию 2,4,5,6. Макропиноцитоз происходит как конститутивно, так и может быть дополнительно индуцирован рецептор-опосредованной стимуляцией в иммунных клетках, где макропиносомы, сигнализирующие рецепторы, способствуют эндо/лизосомному процессингу для презентации антигена и обеспечивают входной портал для различных вирусов, бактерий и других патогенов 3,7.

Макропиносомы имеют несколько отличительных или уникальных маркеров. Их легче всего идентифицировать во время их формирования у основания драматических, богатых актином взборок клеточной поверхности, которые близки к поглощению жидкости8. Сразу после закрытия F-актин вокруг макропиносом деполимеризуется, а сами макропиносомы претерпевают динамические изменения, связанные с гомо- и гетеротипическим слиянием, тубуляцией иусадкой. Макропиносомы также трудно идентифицировать на ультраструктурном уровне, поскольку они не имеют характерных оболочек или других особенностей и выглядят просто как вакуоли различных размеров. Без дефинитивных мембранных маркеров макропиносома наиболее легко и традиционно определяются их жидким грузом, что экспериментально достигается с помощью флуоресцентного декстрана. Декстран представляет собой сложный полисахарид, полученный из глюкозы, который может быть связан с большим массивом флуоресцентных или электронно-плотных маркеров и добавлен в среду для поглощения клетками или перфузирован для поглощения тканями. Кроме того, декстран с большой молекулярной массой (МВт) (70 кДа) в настоящее время рассматривается как размерно-селективный груз для макропиносом, поскольку он не проникает в другие, более мелкие эндоцитарные везикулы, и стал наиболее распространенной меткой для макропиноцитоза10,11. Наблюдение за макропиноцитозом обычно включает в себя инкубацию клеток с импульсом флуоресцентного декстрана и использование неподвижных или живых клеток для флуоресцентной визуализации для просмотра болюсного мечения декстрана внутри клеток в макропиносомах. Из-за большого размера немеченые макропиносомы также могут быть просматриваемы в некоторых типах клеток с помощью фазового контраста или светлопольной микроскопии, где макропиносомы выглядят как большие белые пустые вакуоли. Некоторая контекстуальная информация получается из фазово-контрастных изображений клеток, и эти изображения затем могут быть дополнительно наложены на флуоресцентные изображения, чтобы изобразить поглощение флуоресцентного декстрана12,13. Декстраны различных размеров и с различными метками могут быть использованы для мониторинга поглощения жидкости несколькими клеточными и эндоцитарными путями 10,14,15, а декстраны могут быть применены к культурам клеток или перфузированы мышам для внутрижизненной визуализации16 или даже введены в эмбрионы мух 17 для визуализации в реальном времени.

Некоторые из трудностей, возникающих при использовании декстрана для отслеживания макропиносом, включают его утечку из макропиносом после фиксации или пермеабилизации клеток, его разбавленные или трудно обнаруживаемые уровни в клетках, которые не проявляют агрессивного макропиноцитоза, а также его динамическое развертывание и дисперсию внутри клеток во времясозревания макропиносом.. Эти проблемы усугубляются в большинстве экспериментов, которые предназначены для отслеживания поглощения одного импульса декстрана, добавленного в клетки, а затем смытого.

Вместо этого в данной статье описываются преимущества применения флуоресцентного декстрана к клеткам и оставления его в среде во время визуализации в реальном времени для регистрации непрерывного поглощения клетками. Это усиливает сигнал декстрана в макропиносомах и последующих эндосомах, демонстрируя весь путь созревания. Просмотр меченых макропиносом на фоне немеченой (черной) внутренней части клеток, в качестве высококонтрастной обратной настройки, выявляет все особенности макропиносом и, наоборот, за пределами клеток, высокофлуоресцентной средой выделяется динамическое взъерошивание клеточной поверхности. Этот метод описывает визуализацию декстрана в реальном времени для световой микроскопической, конфокальной визуализации, а также для его обнаружения после фиксации клеток с помощью коррелятивного света и электронной микроскопии (CLEM). Включенная здесь визуализация была выполнена на различных типах клеток, чтобы продемонстрировать широкую применимость этих подходов, включая активированные макрофаги и микроглиальные клетки, где макропиноцитоз очень активен и быстр, и в раковых клетках, где макропиноцитоз относительно менее распространен.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка клеток на посуде со стеклянным дном 35 мм (День 0)

  1. Поддерживайте и пропускайте клеточные линии в полной среде с добавлением 10% термоинактивированной (для RAW264.7) или обычной эмбриональной сыворотки телят и 1% L-глутамина при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5%CO2 .
  2. Наложите соответствующее количество ячеек для достижения 60% сливаемости за 24 часа на посуде со стеклянным дном диаметром 35 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемая плотность клеток составляет от 2 мл 0,15 x 106 клеток/мл до 0,25 x 106 клеток/мл для описанных здесь клеток микроглии RAW264.7, BV2 и MDA-MB 231.

2. Трансфекция флуоресцентной ДНК-плазмиды (день 1) - по желанию

Примечание: Различные флуоресцентно меченные белки и зонды могут экспрессироваться временно или стабильно в клонированных клеточных линиях для специфической маркировки актиновых оборок и компартментов в эндоцитарном пути, таких как ранние эндосомы, поздние эндосомы или лизосомы.

  1. Трансфектируйте клетки с помощью набора для трансфекции на основе липидов в соответствии с инструкцией производителя, через 1 день после нанесения в капюшон для культуры тканей.
  2. Разведите 2 мкг очищенной ДНК-плазмиды, не содержащей эндотоксинов, в 125 мкл минимально необходимой среды (восстановленной сыворотки). Аккуратно перемешайте и дайте постоять 5 минут при комнатной температуре.
  3. Разведите 5 мкл трансфекционного агента в 125 мкл минимально незаменимой среды (восстановленной сыворотки). Аккуратно перемешайте и дайте постоять 5 минут при комнатной температуре.
  4. Соедините разведенную плазмиду ДНК и разведенный реагент для трансфекции и инкубируйте еще 10 минут, прежде чем добавлять по каплям в клетки.
  5. Клетки с трансфекционным комплексом инкубируют при 37 °C в увлажненном 5% CO2-инкубаторе в течение 3-4 ч, после чего заменяют свежей полноценной питательной средой.
  6. Используйте трансфицированные клетки на следующий день для экспериментов или при условии клонирования ограниченным разведением для получения стабильно экспрессирующих клеточных линий.

3. Визуализация эндоцитарных везикул и макропиносом (день 2)

ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентные декстраны (Dextn Alexa Fluor 488/647 при 10 кДа МВт и Dexton Oregon Green 488/Tetramethylrhodamine при 70 кДа МВт, анионовый, определяемый лизин) различной молекулярной массы используются для мониторинга поглощения жидкой фазы в ряд эндоцитарных путей14. 70 кДа декстрана для макропиносом и 10 кДа для всех путей.

  1. Готовьте декстран(ы) в виде концентрированной суспензии в 200-500 нг/мл в предварительно подогретой питательной среде для добавления в клетки.
  2. НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: Эксперименты могут потребовать предварительного или одновременного добавления добавок или препаратов для влияния на эндоцитарную активность. Например, предварительно обрабатывайте макрофаги и клетки микроглии факторами роста (например, 200 нг/мл CSF-1) или активирующими лигандами (например, ЛПС 100 нг/мл или 300 нг/мл CpG) для усиления взъерошивания и макропиноцитоза. Культивируйте раковые клетки в соответствующей бессывороточной среде в течение 12-16 ч до поглощения декстрана в полной среде. Рекомендуемую плотность ячеек см. в шаге 1.2.
  3. Чтобы подготовиться к визуализации в реальном времени, поместите клетки, выращенные в чашках со стеклянным дном, на столик инвертированного конфокального микроскопа, оснащенного грелкой 37 °C и инкубатором с влажностью 5%CO2 .
  4. Отсадите лишнюю среду, оставив 500 мкл готовой среды в чашке со стеклянным дном.
  5. Найдите подходящий участок клеток и установите фокус. Для покадровой съемки перед съемкой предварительно выберите подходящие флуоресцентные лазеры, фильтры и настройки. Используйте следующие настройки для разрешения отдельных клеток и макропиносом.
    1. Получите изображение исследуемой области на инвертированном конфокальном микроскопе с объективом 63x 1,4 NA с масляной иммерсией Plan Apochromat.
    2. Выберите 512 x 512 для размера изображения, двунаправленное сканирование для быстрого создания изображений.
    3. Сосредоточьтесь на индивидуальной фокальной плоскости клеток. Установите захват как один срез или установите толщину оптического среза (Найквиста) примерно 0,3 мкм для объединения в Z-стеки.
    4. Выберите интервальную съемку с интервалом в 5 секунд, продолжительностью от 20 до 45 минут в зависимости от конкретных типов ячеек.
    5. Выберите аппаратную автофокусировку/следящую фокусировку, чтобы помочь стабилизировать изображение во время съемки в течение соответствующего времени в соответствии с конкретными типами ячеек.
    6. Добавьте равный объем 2x декстрана и немедленно начните захват изображения в реальном времени для макрофагов. Подождите 20 минут, прежде чем визуализировать более медленное поглощение в клетках MDA-MB 231.
      Примечание: С помощью этого метода клетки BV2 с двумя флуорофорными каналами были успешно визуализированы в одной плоскости с отслеживанием максимальной скорости, непрерывно в течение 45 минут после добавления смеси декстранов. Для обнаружения ранних макропиносом в клетках RAW 264.7, где макропиноцитоз протекает очень быстро, необходимо получить один срез (для быстрой визуализации) или стек Z из 4-6 срезов (для 3D-захвата) и провести таймлапс с интервалом 5 с в течение 20 мин после добавления декстрана. Для ячеек MDA-MB 231 необходимо получить оптимальные Z-стеки между 10-15 срезами с интервалом 5 с в течение 40 минут.

4. Корреляционная световая и электронная микроскопия (КЛЭМ) (День 3) - по желанию

  1. Подготовьте клетки в соответствии с шагами 1, 2 и 3 протокола с адаптациями. Короче говоря, вырастите 0,2 x 106 клеток/мл RAW264.7 клеток на решетчатых стеклянных посудах (чашка 35 мм, сетчатая покровная чашка No 1,5, диаметр стекла 14 мм, без покрытия), трансфектируйте флуоресцентной плазмидой (например, mCherry-2xFYVE) и оставьте на ночь перед добавлением декстрана-488 (70 кДа) на 20 минут при температуре 37 °C, 5%CO2 в увлажненном инкубаторе.
  2. Быстро промойте клетки 1 мл ледяного PBS и закрепите 0,1% глутаральдегидом.
  3. Получите изображения фиксированных клеток dextran-488 и mCherry-2xFYVE на конфокальном микроскопе.
  4. Получение изображений в светлом поле для определения положения сетки до обработки тарелок для просвечивающей электронной микроскопии (ЭМ), как описано ранее18. Короче говоря, далее зафиксируйте клетки в 2,5% глутаральдегиде, постфиксируйте в 1% восстановленном тетраоксиде осмия, поверните в блок 2% уранилацетата, а затем обезвожьте с помощью ряда этанола перед внедрением в смолу LX112. Вырежьте из блока места, обозначенные сеткой, и соберите ультратонкие срезы с помощью ультрамикротома. Получение изображений на электронном микроскопе с напряжением 80 кВ с помощью соответствующего программного обеспечения системы визуализации.

5. Обработка и визуализация данных (День 4)

ПРИМЕЧАНИЕ: ФИДЖИ - пакет анализа изображений с открытым исходным кодом - используется для визуализации и анализа33.

  1. Дублируйте необработанные данные для обработки в соответствии с принципами данных F.A.I.R., т. е. данные исследований могут быть найдены, доступны, совместимы и повторно использованы.
  2. Равномерно регулируйте яркость и контрастность для наборов изображений, используя данные гистограммы.
  3. Отображение изображений в виде проекций максимальной интенсивности из полученных изображений Z-стека.
  4. Вставка масштабной линейки для наборов изображений.
  5. Обрезка/поворот данных поля зрения (опционально). Создание репрезентативных панелей для данных временных рядов.
  6. Для дальнейшего анализа и количественного определения количественно оцените интенсивность флуоресценции декстрана, поступающего в клетки, в качестве меры активности макропиноцитоза. Чтобы ограничить анализ отдельными клетками, используйте описанный здесь метод визуализации.
    1. Инвертируйте таблицу LUT, чтобы перевернуть цвет для областей клеток, лишенных флуоресценции, чтобы выполнить пороговое значение.
    2. Сегментируйте объект переднего плана и создайте маску ячейки для идентификации отдельных ячеек.
    3. Используйте клеточную маску в сочетании с ранее опубликованным методом19 , который идентифицирует и измеряет отдельные макропиносомы. Используйте эти метрики для количественной оценки макропиноцитоза, включая размер, количество и общее поглощение на клетку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подход к визуализации немеченых живых клеток, погруженных в высокую концентрацию флуоресцентного декстрана, имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными методами визуализации для отслеживания макропиноцитоза. Благодаря отображению изображений в рельефном виде тела клеток выглядят черными и позволяют лучше визуализировать драматическое взъерошение поверхности клетки на ярком флуоресцентном фоне с последующей интернализацией в жидкой фазе макропиносом, заполненных декстраном TMR (70 кДа), как показано на

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье описываются вариации более традиционных способов использования мечения декстрана для отслеживания макропиноцитоза, основанные на визуализации клеток в реальном времени, непрерывно купающихся во флуоресцентных декстранах, и визуализации поглощения на черном фоне немеченых клеток. Оптимизированный протокол предоставляет средства для различения различных внутриклеточных везикул и позволяет пространственно-временное отслеживание множественных макропиноцитарных и эндоцитарных ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Татьяну Хромых за экспертную техническую помощь. Флуоресцентная визуализация была выполнена в микроскопии IMB с использованием Центра ультраструктуры и функции рака, финансируемого Австралийским фондом исследования рака; Электронная микроскопия проводилась в Центре микроскопии и микроанализа Университета Квинсленда. Финансирование было получено от Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям Австралии (JLS APP1176209) и Австралийского исследовательского совета (DP180101910). NDC поддерживается в качестве ученого CZI Imaging Scientist грантом No 2020-225648 от Chan Zuckerberg Initiative DAF, консультативного фонда Silicon Valley Community Foundation. YH был поддержан стипендией доктора философии от правительства Австралии и финансированием от Исследовательской программы Юлгильбара Альцгеймера. Z-JX был поддержан стипендией Китайской академии наук.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2% тетраоксид осмияProSciTechEMS19192
647-трансферрина, Invitrogen  Клетки T23366
BV2Подарок любезно предоставлен нам доктором Ливиу Бодеа (Институт мозга Квинсленда)-
CpG (класс B)B Интегрированные технологии ДНКИндивидуальный заказ
Dextran Alexa Fluor 488  при 10 кДа МВтLife Technology Australia Pty LtdD22910
Dextan Alexa Fluor 647  при 10 кДа МВтLife Technology Australia Pty LtdD22914
Декстран Орегон Грин 488 при 70 кДа МВтLife Technology Australia Pty LtdD1818
Декстран тетраметилродамин при 70 кДа МВтLife Technology Australia Pty LtdD7173
DMEM среда с пируватом натрия и L-глутаминомGibco Invitrogen#11995
Фетальная сыворотка теленкаInterpath Services Pty LtdSFBS-F
Глутаральдегидный водный раствор, ЭМ Класс 25%ProSciTechC002
Jeol 1011 электронный микроскопJEOL-L-Глутамин
Gibco Invitrogen25030081
Липофектамин 2000Gibco Invitrogen11668019
MatTek  Стеклянное дно Тарелка 35 мм, непокрытая решеткаMatTek CorporationP35G-2-14-CGRD
Стеклянная нижняя тарелка MatTek 35 мм без покрытияMatTek CorporationP35G-1.5-14C
MDA-MB 231 ячейкиATCCHTB-26
Opti-MEM уменьшенная сыворотка средаThermo Fisher Scientific31985088
Plasmid mCherry-2XFYVEПодарок любезно предоставлен нам доктором Фредериком Менье (Университет Квинсленда)-
Плазмида mCherry-PLCδ-PHПодарок любезно предоставлен нам доктором Фредериком Менье (Университет Квинсленда)-
Raw 264.7 клеткиATCCTIB-71
RPMI среда 1640, без L-глутаминаGibco Invitrogen#21870
Ultrapure LPSJomar Life Research Pte LtdTLR-3PELPS
Uranyl АцетатProSciTechC079
Zeiss инвертированный LSM880 конфокальный микроскопZeiss-
молекулярные зонды

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. King, J. S., Kay, R. R. The origins and evolution of macropinocytosis. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1765), 20180158(2019).
  2. Stow, J. L., Hung, Y., Wall, A. A. Macropinocytosis: Insights from immunology and cancer. Current Opinion in Cell Biology. 65, 131-140 (2020).
  3. Kerr, M. C., Teasdale, R. D. Defining macropinocytosis. Traffic. 10 (4), 364-371 (2009).
  4. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
  5. Kim, S. M., et al. PTEN deficiency and AMPK activation promote nutrient scavenging and anabolism in prostate cancer cells. Cancer Discovery. 8 (7), 866-883 (2018).
  6. Recouvreux, M. V., Commisso, C. Macropinocytosis: A metabolic adaptation to nutrient stress in cancer. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 8, 261(2017).
  7. Stow, J. L., Condon, N. D. The cell surface environment for pathogen recognition and entry. Clinical & Translational Immunology. 5 (4), 71(2016).
  8. Swanson, J. A., Watts, C. Macropinocytosis. Trends in Cell Biology. 5 (11), 424-428 (1995).
  9. Buckley, C. M., King, J. S. Drinking problems: mechanisms of macropinosome formation and maturation. FEBS Journal. 284 (22), 3778-3790 (2017).
  10. Berthiaume, E. P., Medina, C., Swanson, J. A. Molecular size-fractionation during endocytosis in macrophages. Journal of Cell Biology. 129 (4), 989-998 (1995).
  11. Lin, X. P., Mintern, J. D., Gleeson, P. A. Macropinocytosis in different cell types: Similarities and differences. Membranes (Basel). 10 (8), 177(2020).
  12. Pacitto, R., Gaeta, I., Swanson, J. A., Yoshida, S. CXCL12-induced macropinocytosis modulates two distinct pathways to activate mTORC1 in macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 101 (3), 683-692 (2017).
  13. Yoshida, S., Pacitto, R., Yao, Y., Inoki, K., Swanson, J. A. Growth factor signaling to mTORC1 by amino acid-laden macropinosomes. Journal of Cell Biology. 211 (1), 159-172 (2015).
  14. Chvanov, M., et al. Intracellular rupture, exocytosis and actin interaction of endocytic vacuoles in pancreatic acinar cells: initiating events in acute pancreatitis. Journal of Physiology. 596 (13), 2547-2564 (2018).
  15. Ballesteros, A., Swartz, K. J. Dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), e60769(2020).
  16. Weigert, R. Imaging the dynamics of endocytosis in live mammalian tissues. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (4), 017012(2014).
  17. Chen, L., et al. A novel method to image macropinocytosis in vivo. Frontiers in Neuroscience. 12, 324(2018).
  18. King, N. P., et al. Soluble NSF attachment protein receptor molecular mimicry by a Legionella pneumophila Dot/Icm effector. Cellular Microbiology. 17 (6), 767-784 (2015).
  19. Condon, N. D., et al. Macropinosome formation by tent pole ruffling in macrophages. Journal of Cell Biology. 217 (11), 3873-3885 (2018).
  20. Lemmon, M. A. Pleckstrin homology (PH) domains and phosphoinositides. Biochemical Society Symposium. 74, 81-93 (2007).
  21. Gillooly, D. J., et al. Localization of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast and mammalian cells. EMBO Journal. 19 (17), 4577-4588 (2000).
  22. Mayle, K. M., Le, A. M., Kamei, D. T. The intracellular trafficking pathway of transferrin. Biochimica et Biophysica Acta. 1820 (3), 264-281 (2012).
  23. Hacker, U., Albrecht, R., Maniak, M. Fluid-phase uptake by macropinocytosis in Dictyostelium. Journal of Cell Science. 110, Pt 2 105-112 (1997).
  24. Wall, A. A., et al. Small GTPase Rab8a-recruited Phosphatidylinositol 3-Kinase gamma regulates signaling and cytokine outputs from endosomal toll-like receptors. Journal of Biological Chemistry. 292 (11), 4411-4422 (2017).
  25. Bohdanowicz, M., Grinstein, S. Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis. Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).
  26. Swanson, J. A., Yoshida, S. Macropinosomes as units of signal transduction. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1765), 20180157(2019).
  27. Schnatwinkel, C., et al. The Rab5 effector Rabankyrin-5 regulates and coordinates different endocytic mechanisms. PLoS Biology. 2 (9), 261(2004).
  28. Yeo, J. C., Wall, A. A., Luo, L., Stow, J. L. Sequential recruitment of Rab GTPases during early stages of phagocytosis. Cellular Logistics. 6 (1), 1140615(2016).
  29. Racoosin, E. L., Swanson, J. A. Macropinosome maturation and fusion with tubular lysosomes in macrophages. Journal of Cell Biology. 121 (5), 1011-1020 (1993).
  30. Dolat, L., Spiliotis, E. T. Septins promote macropinosome maturation and traffic to the lysosome by facilitating membrane fusion. Journal of Cell Biology. 214 (5), 517-527 (2016).
  31. Kuhn, S., Lopez-Montero, N., Chang, Y. Y., Sartori-Rupp, A., Enninga, J. Imaging macropinosomes during Shigella infections. Methods. , 12-22 (2017).
  32. Kommnick, C., Lepper, A., Hensel, M. Correlative light and scanning electron microscopy (CLSEM) for analysis of bacterial infection of polarized epithelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 17079(2019).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Видео скоро будет доступно

Похожие статьи