Методическая статья

Анализ окислительного стресса в кишечных органоидах мышей с использованием фторогенного зонда, чувствительного к активным формам кислорода

DOI:

10.3791/62880

⸱

17 сентября 2021 г.

 ,  ,  , 
1Molecular Microbial Pathogenesis Unit, Institut Pasteur, 2Chaire de Microbiologie et Maladies Infectieuses, Collège de France, 3Institut de Biologie Paris Seine (IBPS) - Developmental Biology Unit, Sorbonne Université, CNRS UMR7622, INSERM U1156, 4Molecular Radiotherapy, INSERM U1030, Gustave Roussy, Université Paris-Saclay, 5The Center for Microbes, Development and Health, Institut Pasteur Shanghai and Chinese Academy of Sciences, 6Microenvironment and Immunity Unit, Institut Pasteur

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящий протокол описывает способ обнаружения активных форм кислорода (АФК) в органоидах кишечного мыша с использованием качественной визуализации и количественных анализов цитометрии. Эта работа может быть потенциально распространена на другие флуоресцентные зонды для проверки влияния выбранных соединений на АФК.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Активные формы кислорода (АФК) играют важную роль в кишечном гомеостазе. АФК являются естественными побочными продуктами клеточного метаболизма. Они производятся в ответ на инфекцию или травму на уровне слизистой оболочки, поскольку они участвуют в антимикробных реакциях и заживлении ран. Они также являются критическими вторичными мессенджерами, регулирующими несколько путей, включая рост и дифференцировку клеток. С другой стороны, чрезмерные уровни АФК приводят к окислительному стрессу, который может быть вредным для клеток и способствовать кишечным заболеваниям, таким как хроническое воспаление или рак. Эта работа обеспечивает простой метод обнаружения АФК в органоидах кишечных мышей с помощью живой визуализации и проточной цитометрии с использованием коммерчески доступного фторогенного зонда. Здесь протокол описывает анализ влияния соединений, которые модулируют окислительно-восстановительный баланс в кишечных органоидах и обнаруживают уровни АФК в определенных типах клеток кишечника, примером чего является анализ кишечных стволовых клеток, генетически меченных GFP. Этот протокол может использоваться с другими флуоресцентными зондами.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Активные формы кислорода (АФК) являются естественными побочными продуктами клеточного метаболизма. Они также могут активно продуцироваться специализированными ферментативными комплексами, такими как мембранно-связанные NADPH-оксидазы (NOX) и двойные оксидазы (DUOX), которые генерируют супероксид анион и перекись водорода1. Экспрессируя антиоксидантные ферменты и поглотители АФК, клетки могут тонко настраивать свой окислительно-восстановительный баланс, тем самым защищая тканевый гомеостаз2. Хотя АФК может быть очень токсичным для клеток и повреждать ДНК, белки и липиды, они являются важнейшими сигнальными молекулами2. В кишечном эпителии для пролиферации стволовых и прогениторных клеток требуются умеренные уровни АФК3; высокие уровни АФК приводят к их апоптозу4. Хронический окислительный стресс связан со многими желудочно-кишечными заболеваниями, такими как воспалительные заболевания кишечника или рак. Например, в мышиной модели Wnt-управляемого рака кишечника было обнаружено, что повышенная продукция АФК посредством активации NADPH-оксидаз необходима для гиперпролиферации раковых клеток5,6. Определение того, как кишечные клетки, в частности стволовые клетки, стволовые клетки управляют окислительным стрессом и как клеточная среда может влиять на эту способность, имеет важное значение для лучшего понимания этиологии этого заболевания7.

В ткани различные типы клеток представляют базальное окислительное состояние, которое может варьироваться в зависимости от их функции и метаболизма, а также экспрессии различных уровней молекул окислителя и антиоксиданта4,7. Мониторинг ROS in vivo очень сложен. Клеточные проницаемые красители, которые излучают флуоресценцию в соответствии с их окислительно-восстановительным состоянием, были разработаны для визуализации и измерения клеточного АФК в живых клетках и животных. Однако их эффективность зависит от их диффузии внутри живых тканей и их быстрого считывания, что затрудняет их использование на животных моделях8.

В прошлом изучение влияния соединений на генерацию АФК проводилось с использованием клеточных линий, но это может не отражать ситуацию in vivo . Кишечная органоидная модель, разработанная группой Clevers9, обеспечивает рост первичных клеток кишечника ex vivo. Культивирование кишечных крипт в матрицах, в присутствии определенных факторов роста, приводит к трехмерным структурам, называемым органоидами (мини-кишечник), которые воспроизводят крипто-ворсинчатую организацию, с клетками из разных эпителиальных линий, выстилающих внутренний просвет, и кишечными стволовыми клетками, находящимися в небольших криптоподобных выступах.

Здесь, используя преимущества этой модели, описан простой метод изучения окислительного стресса в первичных клетках кишечника с одноклеточным разрешением путем добавления коммерчески доступного АФК-чувствительного красителя в органоидную культуральную среду.

Пластинчатые считыватели часто используются для обнаружения производства АФК в общей популяции. Этот протокол использует проточную цитометрию или визуальный анализ для обнаружения АФК в определенном типе клеток с генетически модифицированными клетками или специфическим окрашиванием антител. Эта работа включает в себя культуру органоидов кишечника мышей и визуализацию АФК путем конфокальной визуализации и количественной оценки с помощью проточной цитометрии. Используя органоиды тонкого кишечника, полученные от мышей Lgr5-GFP, можно специально проанализировать уровень окислительного стресса в кишечных стволовых клетках при различных методах лечения. Этот протокол может быть адаптирован для проверки влияния экзогенных молекул, таких как мурамил-дипептид (MDP)10, полученных из микробиоты, на баланс АФК, после стимуляции органоидов выбранными соединениями.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на животных проводились после одобрения Комитетом по использованию Института Пастера и Министерством сельского хозяйства Франции No 2016-0022. Все этапы выполняются внутри вытяжки для культивирования тканей.

1. Подготовка реагентов и материалов для культивирования органоидов кишечника

  1. Для приготовления питательной среды смешайте усовершенствованный DMEM/F-12 с добавлением 1x глутамина, 1x раствора пенициллина/стрептомицина (P/S), 10 мМ HEPES, 50 нг/мл мышиного EGF, 20 мкг/мл мышиного Noggin 500 нг/мл мышиного R-Spondin1 (см. Таблицу материалов). Оставьте среду при комнатной температуре (RT) во время извлечения крипты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Заморозьте неиспользованную среду в аликвотах при -20 °C. Избегайте замерзания и оттепели.
  2. Заполните 50 мл трубки 40 мл Advanced DMEM/F-12 и держите ее на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите неиспользуемую среду при температуре 4 °C. Он будет использоваться для пассирования органоидов.
  3. Предварительно прогрейте пластины для культивирования клеток (μ-Slide 8 и/или 96-луночных круглых дна) в инкубаторе при 37 °C.
  4. Оттаивание базальной мембранной матрицы (БММ) (см. Таблицу материалов) аликвот на льду (перед началом протокола или не менее чем за 1 ч до обшивки крипт).
    ПРИМЕЧАНИЕ: BMM быстро затвердеет, если его не держать холодным.
  5. Готовят раствор для промывки/промывки, добавляя 1% раствор пенициллина-стрептомицина в DPBS (DPBS-P/S).
  6. Наполните 100-миллиметровую чашку Петри 10 мл холодного DPBS-P/S. Наполните шесть трубок по 15 мл 10 мл DPBS и пометьте их от F1 до F6.
  7. Готовят 30 мл раствора ЭДТА 10 мМ путем разведения из 0,5 М ЭДТА в DPBS. Заполните две трубки по 15 мл 10 мл 10 мМ ЭДТА и нанесите на них метки E1 и E2.
  8. Держите все растворы предварительно охлажденными при 4°C и держите их на льду во время процедуры.

2. Культура органоидов кишечника

  1. Принесите в жертву 8-10-недельную мышь Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) в соответствии с национальными правилами и нормами.
  2. Соберите 5-8 см тощей кишки, охватывающей область между двенадцатиперстной кишкой (5 см от желудка) и подвздошной кишкой (10 см от слепой кишки) и держите в холодном состоянии DPBS-P/S на льду.
  3. Очистите кишечное содержимое, промыв 5-10 мл холодного DPBS-P/S.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Самодельные промывочные шприцы можно получить, подключив наконечник объемом 200 мкл к соплу шприца объемом 10 мл.
  4. Вскрывайте кишечник продольно с помощью шариковых ножниц (см. Таблицу материалов) (для предотвращения повреждения тканей).
  5. С помощью щипцов перенесите ткань в чашку Петри, содержащую холодный DPBS-P/S комнатной температуры, и встряхните ее для смывания.
  6. С помощью пластиковой пипетки Пастера захватите кишечник путем аспирации и перенесите его в 15 мл трубки с маркировкой E1 , содержащую 10 мл холодного 10 мМ ЭДТА.
  7. Переверните трубку 3 раза и высиживайте на льду в течение 10 мин.
  8. Используя пластиковую пипетку Пастера, перенесите ткань в пробирку F1 , содержащую 10 мл DPBS. Вихрь в течение 2 мин (на обычном вихре, держа трубку вручную и следя за тем, чтобы кишечник хорошо закручивался).
  9. Поместите 10 мкл фракции в чашку Петри и оцените качество фракции под микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все вихревые этапы выполняются на максимальной скорости, и качество каждой фракции должно оцениваться под микроскопом (рисунок 1).
  10. С помощью пластиковой пипетки Пастера захватывают кишечник путем аспирации и переносят его в трубку F2 , содержащую 10 мл DPBS и вихрь в течение 2 мин.
  11. Повторите этап 2.10, перенеся ткань в пробирку F3 , содержащую 10 мл DPBS и вихрь в течение 2 мин.
  12. Повторяют инкубацию ЭДТА, как на стадии 2.6, перенося ткань в пробирку Е2 , содержащую 10 мМ ЭДТА.
  13. Переверните трубку 3 раза и высиживайте на льду в течение 5 мин.
  14. Повторите этап 2.10, перенеся ткань в пробирку F4 , содержащую 10 мл DPBS и вихрь в течение 3 мин.
  15. Повторяют этап 2.14, перенося ткань в пробирку F5 , содержащую 10 мл DPBS и вихрь в течение 3 мин.
  16. Повторяют шаг 2.15, перенося ткань в пробирку F6 , содержащую 10 мл DPBS и вихрь в течение 3 мин.
  17. Объедините лучшие фракции, фильтрующиеся под действием силы тяжести через клеточный сетчатый фильтр 70 мкм, в трубку объемом 50 мл (на льду), чтобы устранить ворсинки и значительный мусор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно F5 и F6 являются фракциями, содержащими многочисленные крипты и меньше мусора.
  18. Вращайте крипты при 150 х г при 4 °C в течение 3 мин.
  19. Опорожните трубку, механически разрушите гранулу и добавьте 5 мл холодного DMEM/F12.
  20. Поместите 10 мкл суспензии в чашку Петри и подсчитайте количество крипт, присутствующих в аликвоте, вручную под микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не считайте одиночные ячейки или мелкий мусор.
  21. Рассчитайте объем (V) суспензии крипт, необходимый в мкл, учитывая, что на скважину наносится 300 крипт, W — количество скважин, а N — количество склепов, исчисляемых из 10 мкл суспензии. Перенесите склепы в новую трубку объемом 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: V = 300 x Ш x 10/N. Если в планируемом эксперименте используется небольшой объем, можно использовать центрифужную трубку объемом 1,5 мл.
  22. Вращайте крипты при 200 х г при 4 °C в течение 3 мин.
  23. Осторожно удалите супернатант с помощью пипетки.
  24. Механически разрушают гранулу и осторожно добавляют питательную среду для получения концентрации 90 крипт/мкл.
  25. Добавьте 2 тома неразбавленного BMM, чтобы иметь конечную концентрацию 30 крипт /мкл. Осторожно пипетку вверх и вниз, не вводя пузырьки воздуха в смесь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда держите трубку на льду, чтобы избежать затвердевания BMM.
  26. Пластина 10 мкл крипт/БММ смешивается с каждой лункой. Для анализа проточной цитометрии используйте круглодонные 96-луночные пластины. Распределите 10 мкл в центре каждой скважины в виде купола. Для визуализации используйте μ-слайд 8 скважины (см. Таблицу материалов) и нанесите 10 мкл в виде тонкого слоя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесите органоиды в виде тонкого слоя для анализа визуализации, чтобы обеспечить их углубленную визуализацию.
  27. Оставьте пластину на 5 минут при RT, чтобы BMM затвердел. Поместите пластину в инкубатор при 37 °C и 5% CO2 в течение 15 мин.
  28. Добавьте 250 мкл питательной среды в каждую лунку, следя за тем, чтобы не отсоединить BMM.
  29. Поместите пластины в инкубатор при 37 °C и 5% CO2.
  30. Выполните анализ ROS между 4 и 6 днями культуры. В противном случае изменяют среду и расщепляют органоиды после появления нескольких и длинных почковых структур и при накоплении отмерших клеток в просвет органоидов.

3. Пассаж органоидов

  1. Начинают проходить тонкокишечные органоиды с 6-го дня культивирования, когда сформировались значительные почковые структуры, а просвет органоидов потемнел.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Просвет органоида становится темным из-за накопления мертвых клеток, мусора и слизи. Не позволяйте органоидам перерастать перед расщеплением. Коэффициент расщепления зависит от роста органоидов. Рекомендуется пассирование органоидов с соотношением 1:2 на 6-й день и 1:3 на 10-й день.
  2. Заполните 15 мл трубки 4 мл холодного Advanced DMEM/F-12 и держите его на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь приведены объемы для 96-луночной культуральной плиты. Если используется другой формат, отрегулируйте громкость соответствующим образом.
  3. Осторожно аспирируйте среду пипеткой или вакуумным насосом из скважин, не касаясь куполов BMM, и выбросьте ее.
  4. Добавьте 100 мкл холодного Advanced DMEM/F-12 на лунку. Пипетка вверх и вниз, чтобы разбить BMM и перенести содержимое скважины в трубку объемом 15 мл.
  5. Промыть колодец 200 мкл холодного Advanced DMEM/F-12 и собрать его в ту же трубку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При прохождении нескольких скважин из одного и того же экспериментального состояния содержимое скважин может быть объединено в одну и ту же 15 мл коллекторную трубу.
  6. Вращайте собирающую трубку 15 мл при 100 х г в течение 5 мин при 4°C.
  7. Выбросьте супернатант и добавьте в гранулу 1 мл холодного Advanced DMEM/F-12. Используя наконечник P1000, возьмите наконечник P10 (без фильтра) и пипетку вверх и вниз не менее 20 раз.
  8. Добавьте в пробирку 4 мл холодного Advanced DMEM/F-12. Отжим при 300 х г в течение 5 мин при 4°C.
  9. Аспирируйте супернатант пипеткой или вакуумным насосом, не нарушая гранулу. Затем нарушите гранулу механически.
  10. Добавьте BMM, разведенный в культуральной среде для роста (соотношение 2:1). Осторожно пипетку вверх и вниз, не вводя пузырьки воздуха в смесь.
  11. Пластина 10 мкл крипт/БММ смешивается с каждой лункой.
  12. Держите пластину в течение 5 минут при RT, чтобы BMM затвердел. Поместите пластину в инкубатор при 37 °C и 5% CO2 в течение 15 мин.
  13. Добавьте в каждую лунку 250 мкл питательной среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не отсоединить BMM.
  14. Поместите пластины в инкубатор при 37 °C и 5% CO2.

4. Подготовка реагентов и материалов для оценки окислительного стресса в органоидах кишечника

  1. Готовят 250 мМ исходного раствора ингибитора N-ацетилцистеина (NAC) (см. Таблицу материалов), повторно суспендируют 10 мг с 245 мкл DPBS. Используйте при конечной концентрации 1 мМ.
  2. Готовят 50 мМ запасного раствора индуктора трет-бутилгидропероксида (tBHP), 70% в воде, разводят 3,22 мкл с 496,8 мкл DPBS. Используйте при конечной концентрации 200 мкМ.
  3. Для исследования проточной цитометрии готовят рабочий раствор флюорогенного зонда длиной 250 мкМ (см. Таблицу материалов) путем разбавления исходного раствора 1/10 в ДМСО. Используйте при конечной концентрации 1 мкМ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как указано в инструкции производителя, фторогенный зонд чувствителен к свету и кислороду. Акции и аликвоты не должны открываться и закрываться слишком много раз.
  4. Для визуализационного исследования готовят рабочий раствор флуорогенного зонда объемом 1,25 мМ путем разбавления исходного раствора 1/2 в ДМСО. Используйте при конечной концентрации 5 мкМ.
  5. Приготовьте окончательный раствор 0,1 мкг/мл DAPI в DPBS, который будет использоваться для дискриминации мертвых клеток в анализе проточной цитометрии.
  6. Разбавляют Hoechst 33342 до 1,25 мг/мл в DPBS. Используйте при конечной концентрации 5 мкг/мл для использования для ядерного окрашивания в анализе визуализации.
  7. Теплый ДМЭМ без фенольного красного цвета при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги описывают использование отрицательных и положительных элементов управления, которые должны быть включены в любые анализы, с использованием условий, указанных на рисунке 2A. Анализ может быть использован для тестирования антиоксидантных или прооксидантных соединений. Этапы одинаковы, и единственное различие заключается в том, когда соединения добавляются перед использованием фторгенного красителя.

5. Визуализация окислительного стресса в 3D органоидах методом конфокальной микроскопии

  1. Взять органоиды, покрытые в камерах скважин μ-Slide 8, и добавить 1 мкл раствора NAC в соответствующие скважины для получения конечной концентрации 1 мМ.
  2. Инкубировать в течение 1 ч при 37 °C и 5% CO2.
  3. Добавляют 1 мкл раствора tBHP в соответствующие скважины для получения конечной концентрации 200 мкМ.
  4. Инкубировать в течение 30 мин при 37 °C и 5% CO2.
  5. Добавьте 1 мкл на лунку разбавления фторогенного зонда 1,25 мМ для получения конечной концентрации 5 мкМ.
  6. Добавьте 1 мкл на лунку разбавления Хешта 1,25 мг/мл для получения конечной концентрации 5 мкг/мл.
  7. Инкубировать в течение 30 мин при 37 °C и 5% CO2.
  8. Удалите среду, не нарушая BMM. Осторожно добавьте 250 мкл теплого ДМЭМ без фенолового красного цвета.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если планируется долгосрочное приобретение, добавьте соединения факторов роста в DMEM без фенольного красного цвета.
  9. Визуализируйте органоиды с помощью конфокального микроскопа, оснащенного термической камерой и газоснабжением, которое обнаруживает флюорогенный зонд (АФК).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Возбуждение/эмиссия (ex/em) для фторогенного зонда составляет 644/665, ex/em для Hoechst (ядер) составляет 361/486, а ex/em для GFP (кишечная стволовая клетка от мышей Lgr5-GFP) составляет 488/510. 63-кратный масляный погружной объектив используется для обнаружения сигналов в стволовых клетках. Не изменяйте настройки лазера между образцами. 20-кратная цель может быть использована для обеспечения обзора производства ROS.
  10. Используйте положительный контроль для настройки интенсивности лазера и временного воздействия для сигнала ROS и убедитесь, что этот сигнал ниже в отрицательном контроле.
  11. С помощью окуляра экран слайда позволяет идентифицировать органоиды GFP, выражающие и регулировать интенсивность лазера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг выполняется вручную.
  12. Определите положения для получения сшитого изображения всего органоида. Настройте z-стек 25 мкм (размер шага 5 мкм), чтобы получить участок органоидов, показывающий один слой клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к руководству пользователя микроскопа для оптимизации настройки. Используя живые клетки, приобретение должно быть произведено в течение 1 ч после окончания инкубации.
  13. Откройте изображения в программном обеспечении для обработки изображений с открытым исходным кодом (см. Таблицу материалов).
  14. Пройдитесь по z-стеку и выберите участок, в котором хорошо представлена середина органоидов и создайте новое изображение с выбранной областью.
  15. Количественно оцените изображения в соответствии с шагами 5.15.1 - 5.15.5.
    1. Выберите инструмент «Линия от руки».
    2. Нарисуйте линию, следующую за ядрами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите только области, представляющие GFP-положительные клетки, если анализируются только стволовые клетки.
    3. Увеличьте ширину линии, чтобы покрыть слой ячейки линией без включения просветного мусора.
    4. Выберите канал для сигнала ROS и измерьте интенсивность флуоресценции в выбранной области и аннотируйте значения.
    5. Проведите линию, где нет сигнала, и измерьте флуоресцентную интенсивность фона, которая будет вычтена до предыдущего значения, чтобы получить окончательную интенсивность.

6. Количественная оценка окислительного стресса на диссоциированных органоидах с помощью проточного цитометра

  1. Добавьте 1 мкл раствора NAC в скважины для отрицательного контроля для получения конечной концентрации 1 мМ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте органоиды, покрытые 96-луночными пластинами с круглым дном.
  2. Инкубировать в течение 1 ч при 37 °C и 5% CO2.
  3. Добавляют 1 мкл раствора tBHP в соответствующие скважины для получения конечной концентрации 200 мкМ.
  4. Инкубировать в течение 30 мин при 37 °C и 5% CO2.
  5. С помощью многоканальной пипетки удалите среду, не нарушая прикрепленный BMM, и перенесите ее на другую 96-луночную круглую нижнюю пластину. Держите эту тарелку в стороне.
  6. Добавьте 100 мкл трипсина, а с помощью многоканальной пипетки, пипетки вверх и вниз не менее пяти раз, чтобы уничтожить BMM.
  7. Инкубировать не более 5 мин при 37 °C и 5% CO2.
  8. С многоканальной пипеткой пипетка вверх и вниз не менее пяти раз, чтобы диссоциировать органоиды.
  9. Отжим при 300 х г в течение 5 мин при RT.
  10. Отбросьте супернатант, перевернув пластину. Добавьте обратно среду, собранную на этапе 6.3, в соответствующие скважины и повторно суспендируйте ячейки путем пипетирования вверх и вниз 5 раз.
  11. Добавьте фторогенный зонд в конечной концентрации 1 мкМ. Добавьте 1 мкл на лунку из разбавления 250 мкМ и инкубируйте в течение 30 мин при 37 °C и 5% CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте флюорогенный зонд в скважины, необходимые для настроек прибора (рисунок 2B).
  12. Отжим при 300 х г в течение 5 мин при RT.
  13. Повторное суспендирование клеток 250 мкл 0,1 мкг/мл раствора DAPI. Перенесите образцы в соответствующие проточные цитометрические трубки, держите трубки на льду и приступайте к анализу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте PBS вместо DAPI в скважины, необходимые для настроек инструмента (рисунок 2B).
  14. Оптимизируйте настройки напряжения прямого и бокового рассеяния на неиспорченных контрольных и лазерных напряжениях для каждого флуорофора с помощью моноокрашенных образцов.
  15. Используя соответствующую стратегию гатинга (рисунок 4A), соберите не менее 20 000 событий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 50 000 мероприятий являются предпочтительными. Подробные настройки сбора варьируются в зависимости от используемого инструмента.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В качестве доказательства концепции описываемого протокола использовались крипты, полученные из мышиной линии Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2, в которой кишечные стволовые клетки отображают мозаичную экспрессию GFP, которая была установлена Barker et al., чтобы изначально охарактеризовать кишечные стволовые клетки10 и позволить отобразить эти клетки на основе их экспрессии GFP. Таким образом, предоставляется модель для сравнения уровней АФК в популяции определенного типа клеток при различных методах лечени...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа предоставляет пошаговый протокол для выделения мышиных точевидных крипт, культивирования их в 3D-органоиды и анализа АФК в органоидах путем объединения ФТОРогенного зонда, чувствительного к АФК, с качественной микроскопической визуализацией целых органоидов и количественным измерением АФК с использованием проточной цитометрии на отдельных клетках после диссоциации органоидов.

Первым важным шагом в этом методе является процедура извлечения крипт. Действительно, качество приготовления...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом Французского национального исследовательского агентства (ANR) 17-CE14-0022 (i-Stress).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Mice
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)Лаборатория Джексона
Growth culture medium
Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)Добавка ThermoFisher12634010
B-27, минус витамин АThermoFisher12587010Концентрация стока: 50x
GlutaMAX (glutamine)ThermoFisher35050038Концентрация стока: 100x
HepesThermoFisher15630056Концентрация стока: 1 м
Murine EGFR& D2028-EG-200Концентрация запасов: 500 &микро; г/мл в
PBS мышиной NogginR& D1967-NG/CFКонцентрация запасов: 100 &m; г/мл в PBS
Murine R-spondin1R& D3474-RS-050Концентрация запасов: 50 & микро; г/мл в
добавке PBS N-2 ThermoFisher17502048Концентрация в запасе: 100x
Пенициллин-стрептомицин (P/S)ThermoFisher15140122Концентрация в запасе: 100x (10 000 единиц/мл пенициллина и 10 000 &; г/мл стрептомицина
)Material
70 µ m клеточный фильтрCorning352350
96-луночный круглый дноCorning3799
ножницы с шариковым наконечникомFine Science Tools GMBH14086-09
CellROX® Темно-красный реагентThermoFisherC10422
DAPI (4',6-диамидино-2-phé нилиндол, дихлоргидрат) (fluorgenic probe)ThermoFisherD1306stock при 10 мг/мл
DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS)ThermoFisher14190144
FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red)ThermoFisherA1896701
Hoechst 33342ThermoFisherH3570stock при 10 мг/мл
Пониженный фактор роста Matrigel, фенол без красного (Basement Membrane Matrix)Corning356231после получения оттаивания в холодильнике, хранить в течение 1 часа на льду и сделать 500 мл аликвот и хранить при -20 °°; C
µ-Slide 8 луночных камерIbidi80826
N-ацетилцистеин (NAC)SigmaA9165
раствор трет-бутилгидропероксида (tBCHP) (70% масс. В H2O2)Sigma458139
TrypLE Express Enzyme (1X), без фенолового красного (trypsin)ThermoFisher12604013
UltraPure 0,5 M EDTA, pH8.0ThermoFisher15575020
Y-27632SigmaY0503Rock-ингибитор для минимизации гибели клеток при диссоциации тканей
Программы и оборудование
Attune NxT (Flow Cytometer)ThermoFischerПроточный цитометр
анализатор Fiji/ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/downloadsгенерация изображений
FlowJoBD BioscienceFACS анализ
Observer.Z1Конфокальная системаZeiss
Opterra (фокус со стреловидным полем)Конфокальная системаBruker
высокоскоростная камера EMCCD Evolve Delta 512Фотометрическаяконфокальная система
PrismGraphPad Программное обеспечениестатистического анализа

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aviello, G., Knaus, U. G. NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article. Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).
  2. Holmström, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
  3. vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation. Cell Reports. 35 (1), 108949(2021).
  4. Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
  5. Myant, K. B., et al. ROS production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
  6. Juhasz, A., et al. NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction. Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).
  7. Aviello, G., Knaus, U. G. ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage. British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).
  8. Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
  9. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  10. Levy, A., et al. Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).
  11. Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).
  12. Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death. Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).
  13. Ahn, H. Y., et al. Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides. Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).
  14. Bidaux, G., et al. Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).
  15. Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316(2010).
  16. Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model. Journal of Visualized Experiments. (141), e58450(2018).
  17. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи