Методическая статья

Проектирование и разработка модели для изучения влияния дополнительного кислорода на микробиом дыхательных путей муковисцидоза

DOI:

10.3791/62888

⸱

3 августа 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Biology & Biochemistry, University of California, Irvine, 3Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, 4Department of Microbiology & Immunology, Geisel School of Medicine at Dartmouth, 5Swiss i-research and teaching institute

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целью данного протокола является разработка модельной системы влияния гипероксии на микробные сообщества дыхательных путей муковисцидоза. Искусственная среда мокроты имитирует состав мокроты, а гипероксичные условия культуры моделируют воздействие дополнительного кислорода на микробные сообщества легких.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Считается, что микробные сообщества дыхательных путей играют важную роль в прогрессировании муковисцидоза (МВ) и других хронических заболеваний легких. Микробы традиционно классифицируются на основе их способности использовать или переносить кислород. Дополнительный кислород является распространенной медицинской терапией, назначаемой людям с муковисцидозом (pwCF); однако существующие исследования кислорода и микробиома дыхательных путей были сосредоточены на том, как гипоксия (низкий уровень кислорода), а не гипероксия (высокий уровень кислорода) влияет на преимущественно аэробные и факультативные анаэробные микробные сообщества легких. Чтобы устранить этот критический пробел в знаниях, этот протокол был разработан с использованием искусственной среды мокроты, которая имитирует состав мокроты из pwCF. Использование фильтрующей стерилизации, которая дает прозрачную среду, позволяет оптическими методами следить за ростом одноклеточных микробов в культурах суспензии. Для создания гипероксических условий эта модельная система использует установленные методы анаэробного культивирования для изучения гипероксических состояний; вместо удаления кислорода кислород добавляют в культуры путем ежедневного разбрызгивания сывороточных баллонов смесью сжатого кислорода и воздуха. Мокрота от 50 pwCF подвергалась ежедневному спаррингу в течение 72-часового периода, чтобы проверить способность этой модели поддерживать дифференциальные кислородные условия. Метагеномное секвенирование дробовика проводили на культивируемых и некультурных образцах мокроты из 11 pwCF для проверки способности этой среды поддерживать рост комменсальных и патогенных микробов, обычно встречающихся в мокроте муковисцидоза. Кривые роста были получены из 112 изолятов, полученных из pwCF, для проверки способности этой искусственной среды мокроты поддерживать рост распространенных патогенов муковисцидоза. Мы обнаружили, что эта модель может культивировать широкий спектр патогенов и комменсалов в мокроте муковисцидоза, восстанавливает сообщество, очень похожее на некультурную мокроту в нормоксических условиях, и создает различные фенотипы культуры в различных кислородных условиях. Этот новый подход может привести к лучшему пониманию непредвиденных эффектов, вызванных использованием кислорода в pwCF, на микробные сообщества дыхательных путей и распространенные респираторные патогены.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Муковисцидоз (МВ) является генетическим заболеванием, характеризующимся неспособностью очищать густую слизь из легких, что приводит к повторным инфекциям и прогрессирующему снижению функции легких, что часто приводит к необходимости трансплантации легких или смерти. Микробиом дыхательных путей людей с муковисцидозом (pwCF), по-видимому, отслеживает активность заболевания1с уменьшением микробного разнообразия, связанного с неблагоприятными долгосрочными исходами2,3. В клинических исследованиях pwCF дополнительная кислородная терапия была связана с более продвинутым заболеванием4,5,хотя традиционно использование кислородной терапии рассматривалось просто как маркер тяжести заболевания6. Недавние исследования из клинического испытания пациентов с дыхательной недостаточностью показали, что более высокие уровни кислорода у пациентов парадоксальным образом связаны с увеличением серьезных бактериальных инфекций и более высокой смертностью7,предполагая, что дополнительный кислород может способствовать патогенезу заболевания. Влияние дополнительного кислорода на микробиом легкого муковисцидоза и связанные с ним микробные сообщества легких и дыхательных путей не было хорошо изучено.

Механистические исследования часто не могут быть выполнены непосредственно на людях из-за логистических трудностей и потенциальных этических проблем, связанных с вмешательствами с неизвестной медицинской пользой или вредом. Трансляционные подходы, которые интегрируют биообразцы человека в модельные системы, могут предложить важную биологическую информацию в этих случаях. Хотя способность использовать или переносить кислород традиционно была важным компонентом микробной классификации, мало что известно о том, как терапевтическое введение дополнительного кислорода в окружающую среду может нарушить микробные сообщества дыхательных путей. Чтобы пролить свет на неизвестное влияние дополнительного кислорода на микробиомы дыхательных путей pwCF, нам нужно было решить две основные проблемы; во-первых, создание питательной среды, физиологически аппроксимирующей состав мокроты МВ; во-вторых, создание модельной системы, позволяющей поддерживать повышенные концентрации кислорода в культуре в течение длительных периодов времени.

Искусственные среды мокроты (ASM) широко используются для эмуляции мокроты легких ex vivo8,9,10,но нет четкого консенсуса по конкретному рецепту. Этот протокол описывает рецепт искусственной мокроты и стратегию приготовления, тщательно разработанную для физиологически аппроксимации мокроты из pwCF. В таблице 1 приведены значения выбранных рецептов на основе опубликованной литературы. Основные химические компоненты и рН были сопоставлены со значениями, выявленными исследованиями человеческого МВ мокроты11,12,13. Низкоконцентрированные физиологические питательные вещества добавляли с использованием яичного желтка, который включался в виде 0,25% от конечного объема10,а также смеси витаминов и микрометаллов14,15. Муцин, ключевой компонент мокроты16,был включен в 1% мас./v14. Несмотря на то, что фильтрация является более трудоемкой, стерилизация фильтров была выбрана вместо более традиционной практики тепловой стерилизации для уменьшения потенциальных проблем, связанных с термоиндуцированной денатурацией основных компонентов среды10. Дополнительным преимуществом фильтрационной стерилизации является то, что она генерирует прозрачные среды (теплостерилизация может создавать мутные среды из-за осаждения и коагуляции солей и белков), что позволяет использовать эту искусственную среду мокроты для отслеживания роста микробов на основе увеличения мутности.

Эта модельная система для гипероксической культуры основана на методах анаэробного культивирования, где кислород добавляется, а не удаляется, создавая модель эффекта дополнительного использования кислорода для pwCF. На рисунке 1 и связанном с ним протоколе разбрызгивания кислорода описываются компоненты кислородной разбрызгивающей системы, которые могут быть получены при низких затратах от общих лабораторных и больничных поставщиков. Эта система позволяет смешивать сжатый кислород и воздух с фиксированными концентрациями в диапазоне от 21% до 100% кислорода. Интеграция датчика кислорода позволяет проверить концентрацию выходной газовой смеси, а также проверить газовый состав оттока ранее разрозненных сывороточных баллонов, чтобы убедиться, что кислородные условия поддерживались в желаемом диапазоне.

В этом протоколе описываются процедуры создания искусственной мокроты, построение и использование системы разбрызгивания кислорода, а также применение обоих для культивирования мокроты CF в дифференциальных кислородных условиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование получило одобрение Совета по институциональному обзору партнеров (Протокол No 2018P002934). Критерий включения включал взрослых пациентов с муковисцидозом, которые предоставили письменное информированное согласие на исследование. Критерия исключения не существует. Согласно протокольным рекомендациям, все образцы мокроты были собраны у пациентов с муковисцидозом во время запланированного амбулаторного визита к их клиническому врачу.

1. Искусственная подготовка среды мокроты

ПРИМЕЧАНИЕ: Количества, перечисленные здесь, предназначены для производства 1 л конечной искусственной мокроты и предполагают конкретные реагенты, перечисленные в таблице материалов. Цифры должны быть скорректированы для других объемов или для использования различных реагентов для обеспечения одного и того же конечного продукта. Целевые концентрации см. в таблице 1.

  1. Химическая смесь искусственной мокроты (ASCM)
    ПРИМЕЧАНИЕ: ASCM составляет 25% от конечного объема среды. Он устойчив к хранению и может быть приготовлен навалом или заранее. Если вы подготовлены к последующему использованию, автоклавируйте химическую смесь и безопасно храните ее при комнатной температуре.
    1. Смешайте составные химические растворы.
      1. Приготовить 1 M NaCl бульона: Добавить 58,44 г NaCl на литр стерильной воды.
      2. Приготовить бульон 1 M KCl: Добавить 74,55 г KCl на литр стерильной воды.
      3. Приготовить 1 M MgSO4 бульона: Добавить 246,47 г MgSO4·7H2Oна литр стерильной воды или 120,37 г безводного MgSO4 на литр стерильной воды.
      4. Приготовьте 1 М запаса глюкозы: Добавьте 180,16 г глюкозы на литр стерильной воды.
    2. Автоклав стерилизует химические растворы, а также пустую бутылку объемом 250 мл. Выполните этапы автоклавирования по крайней мере до стандартных значений 121 °C и 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 30 минут.
    3. Добавьте 80,59 мл стерильной воды в пустую бутылку объемом 250 мл.
    4. Добавьте в смесь 152,30 мл 1 мл naCl.
    5. Добавьте в смесь 15,8 мл запаса 1 мл кКл.
    6. Добавьте в смесь 610 мкл 1 M MgSO4 бульона.
    7. Добавьте в смесь 700 мкл 1 М запаса глюкозы.
  2. Искусственная смесь муцина мокроты (ASMM)
    ПРИМЕЧАНИЕ: ASMM составляет 50% от конечного объема среды. Убедитесь, что он приготовлен в тот же день, что и последняя средняя партия.
    1. Добавьте 450 мл стерильной воды в пустую бутылку объемом 1 л.
    2. Добавьте в бутылку 50 мл 10-кратного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
    3. Добавьте в бутылку одноразовый магнитный перемешивание.
    4. Автоклавируйте бутылку, содержащую PBS и перемешивающий батончик.
    5. Отмерьте 10 г порошка муцина и добавьте его в PBS.
    6. Энергично встряхните флакон для предварительного перемешивания.
    7. Поместите флакон на конфорку с магнитной мешалкой. Установите нагрев до средней высоты 50 °C и скорость перемешивания до 1100 об/мин. Увеличивайте скорость постепенно, чтобы стержень не отлетел от магнита.
      1. Дайте нагреться и помешивать в течение 15 мин.
      2. Подберите бутылку в термостойких перчатках. Понаблюдайте, чтобы проверить, оседает ли порошок муцина из раствора.
      3. Если порошок муцина не полностью растворен, верните бутылку к нагреванию / мешалке с интервалом в 5 минут, пока она полностью не растворится.
    8. Дайте смеси муцина остыть до комнатной температуры.
  3. Биологическая смесь искусственной мокроты (ASBM)
    ПРИМЕЧАНИЕ: ASBM составляет 25% от конечного объема среды. Приготовьте его в тот же день, что и последнюю среднюю партию, и в отличие от других смесей, не подвергайте его компоненты воздействию тепла.
    1. Разморозьте 100-кратный витаминный бульон в холодильнике с температурой 4 °C или на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно порционируйте витаминный запас в 10 мл аликвот, чтобы свести к минимуму количество циклов замораживания/оттаивания.
    2. Добавьте 124,24 мл стерильной воды в пустую автоклавную бутылку объемом 250 мл.
    3. Добавьте в смесь 25,76 мл 50-кратного запаса незаменимых аминокислот.
    4. Добавьте в смесь 80,14 мл 100-кратного запаса заменимых аминокислот.
    5. Добавьте в смесь 10 мл (размороженного) 100-кратного витаминного бульона.
    6. Добавьте в смесь 1 мл 1000-кратного запаса следовых металлов.
    7. Добавьте в смесь 8,33 мл 30% эмульсии из яичного желтка.
    8. Добавьте в смесь 400 мкл ферритина 10 г/л.
    9. Хорошо перемешайте раствор с помощью ручного встряхивания.
  4. Искусственная среда мокроты (ASM)
    1. Добавьте 250 мл ASCM во флакон емкостью 1 л, содержащий ASMM.
    2. Добавьте 250 мл ASBM в среднюю бутылку.
    3. Титруйте среду основным буфером MOPS (1 M) для достижения рН 6,3 на бумаге pH узкого диапазона. Перед титрованием средняя смесь будет слишком кислой.
    4. Охладите полученную искусственную среду мокроты при 4 °C до тех пор, пока она не будет готова к фильтрации.
    5. Чтобы начать процесс фильтрации, перенесите 200 мл нефильтрованной искусственной мокроты в вакуумную систему фильтрации с фильтром размером пор 0,22 мкм.
    6. Подключите систему фильтрации к вакуумному насосу, включите вакуумный насос, установите его на 70 мбар, а затем поместите камеру на орбитальный шейкер, трясущийся при 90 об/мин в холодном помещении при 4 °C.
      1. Добавьте дополнительные 150 мл среды, так как заметное количество фильтруется. Для полной фильтрации 1 л среды требуется 1-2 дня.
      2. Повторяйте с дополнительными камерами до тех пор, пока все среды не будут отфильтрованы.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь не фильтровать более 350 мл среды через тот же фильтр 0,22 мкм, так как муцин со временем заткнет фильтр.
    7. Хранить в холодильнике фильтрованную искусственную среду мокроты при 4 °C до готовности к использованию. Используйте ASM в течение одного месяца после подготовки для достижения наилучших результатов.

2. Кислородное разбрызгивание

  1. Настройка разбрызгивательной станции
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол должен быть выполнен в полном объеме только один раз, после чего настройка может поддерживаться путем простого обслуживания по мере необходимости. На рисунке 1 приведена визуальная схема системы разбрызгивания кислорода.
    1. Получите и правильно закрепите баллоны со сжатым воздухом и кислородом.
      ВНИМАНИЕ: Высокое давление делает резервуары чрезвычайно опасными при неправильном обращении. Убедитесь, что резервуары полностью герметизированы и защищены, что при закрытии резервуара нет утечек и что весь обслуживающий персонал полностью обучен их использованию.
    2. Прикрепите регулятор воздуха к баку сжатого воздуха с помощью гаечного ключа. Для оптимального считывания расхода на регуляторе прикрепите регулятор как можно ближе к вертикальному положению.
    3. Прикрепите регулятор кислорода к сжатому кислородному баллону, прикрепив как можно ближе к вертикальному положению. В зависимости от кислородного баллона может потребоваться перевернуть направление, чтобы затянуться.
    4. Подключите трубку от регуляторов к Y-образному разъему для объединения потока газа из двух резервуаров.
    5. Подключите выход Y-образного разъема к центральному Т-образному клапану.
    6. Подключите одну сторону центрального Т-образного клапана к манометру давления газа.
    7. Подключите другую сторону манометра газа к стерильному шприцевому фильтру диаметром 25 мм с размером пор 0,22 мкм.
    8. Прикрепите второй шприцевой фильтр диаметром 25 мм к шприцу без плунжера, который будет использоваться в качестве газоотвода во время разбрызгивания.
    9. Подключите конечную сторону центрального Т-образного клапана ко второму Т-образному клапану для кислородного монитора.
    10. Подключите шприцевой фильтр диаметром 25 мм к одной стороне этого второго Т-образного клапана вместе с трубкой для прикрепления игл 18 G.
    11. Подключите конечную сторону второго Т-образного клапана к устройству контроля кислорода.
    12. Подключите светотеневую трубу к другой стороне устройства контроля кислорода, которое будет использоваться в качестве газоотвода во время мониторинга.
      ВНИМАНИЕ: При тестировании/использовании системы разбрызгивания кислорода внимательно следите за положением Т-образных соединений и убедитесь, что она соответствует предполагаемому пути через систему. Неспособность сделать это приведет к повышению давления внутри системы и приведет к выходу из строя и развалу компонентов.
    13. Для обслуживания системы и поддержания ее оптимальной производительности полезны следующие методы.
      1. Укрепите соединения большим количеством тефлоновой ленты, чтобы значительно улучшить их уплотнение и уменьшить вероятность того, что компоненты отделятся от внутреннего давления.
      2. Поддерживайте комбинированную скорость потока ниже 10 л/мин для снижения максимального давления и предотвращения сбоев.
      3. Если подозревается утечка, используйте моющее средство, такое как коммерчески доступные детекторы утечки жидкости, чтобы легко определить ее местоположение, так как она будет пузыриться над любыми утечками газа. Пластырь протекает с помощью политетрафторэтиленовой ленты (например, тефлона).
      4. Заменяйте шприцевые фильтры диаметром 25 мм в кислородной разбрызгивательной системе два раза в неделю, но это зависит от частоты использования. Со временем частицы, попавшие в фильтр, уменьшают расход газа и вызывают повышение давления.
      5. Откалибруйте кислородный монитор до 21% кислородного сжатого воздуха перед проведением измерений.
      6. По завершении использования системы выключите резервуары и отводите лишний газ от регуляторов до тех пор, пока поток полностью не прекратится.
  2. Разбрызгивание бутылочной культуры сыворотки
    1. Маркировка 500 мл автоклавных сывороточных флаконов с идентификаторами образцов, датой/временем инокуляции и целевым процентом кислорода.
    2. В биологическом капюшоне добавьте 24 мл искусственной мокроты в каждый установленный флакон сыворотки.
    3. Добавляйте 1 мл мокроты пациента, гомогенизированной иглой 18 г (разбавленной стерильным физиологическим раствором, если это необходимо для получения достаточного объема образца для каждого состояния культуры) в каждый флакон сыворотки.
    4. Используя стерильный пинцет, поместите автоклавные резиновые пробки на верхнюю часть каждого флакона сыворотки.
    5. Прижмите резиновые пробки, следите за тем, чтобы не коснуться нижней стороны пробки руками.
    6. Снимите бутылки с вытяжки, нанесите и обжимайте алюминиевые уплотнения. Снимите центральную часть с уплотнений.
    7. Протрите верхнюю часть бутылок спиртовой салфеткой и пропустите их через пламя горелки Бунзена.
    8. Прикрепите стерильную иглу 18-G к плунжерному шприцу с фильтром. Сначала вставьте этот газ в баллон.
    9. Прикрепите стерильную иглу 18-G к выходу газа из системы и вставьте выходную газовую иглу в баллон.
    10. Проложите Т-образные переходы из резервуаров через кислородный монитор. Убедитесь, что целевая концентрация кислорода протекает через систему. Целевой показатель расхода газа приблизительно 5 л/мин.
    11. Перенаправление Т-образных соединений от резервуаров к выходу газа. Газ начинает течь через баллон со сывороткой.
      ВНИМАНИЕ: Обратите пристальное внимание на манометр во время разбрызгивания кислорода. Если давление неожиданно увеличивается, немедленно выключите систему.
    12. Пропустите кислород через флакон с сывороткой в течение 1 мин. При 5 л/мин это обеспечивает 10 воздухообменов и гарантирует, что внутренняя атмосфера достигнет желаемого парциального давления.
    13. Снимите иглу с выделением газа 18-G.
    14. Дайте давлению в бутылке сыворотки нарастить до +1 атмосферы (2 атмосферы на уровне моря), а затем немедленно удалите иглу выхода газа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание давления способствует сохранению гипероксичных состояний с течением времени.
    15. Поместите флакон сыворотки в шейкер инкубатора при температуре 37 °C при 150 об/мин. Инкубируйте образцы в течение трех 24-часовых интервалов. На каждом 24-часовом интервале берут аликвоту для последующего анализа, повторно разбирают образцы и возвращают их в инкубацию в течение общего времени инкубации 72 ч.
  3. Измерение оттока кислорода
    1. Откалибруйте кислородометр до 21% сжатого воздуха, а затем выключите бак.
    2. Проведите прием флакона с сывороткой через кислородный монитор и прикрепите стерильную иглу к концу.
    3. Вставьте иглу через резиновую пробку в флакон с сывороткой.
    4. Подождите, пока показания оттока стабилизируются. Низкая скорость потока из бутылок с сывороткой означает, что это может занять до 2 минут. Сообщите о пиковой разнице с воздухом в помещении (число, наиболее удаленное от 21%).
    5. При выполнении нескольких показаний промывайте систему сжатым воздухом между показаниями.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эти протоколы были применены к 50 отхаркивающим образцам мокроты из pwCF, представленным для обычной помощи в амбулаторной клинике муковисцидоза в Массачусетской больнице общего профиля в Бостоне, штат Массачусетс. Мокроту каждого пациента культивировали при 21%, 50% и 100% кислородных условиях с использованием искусственной мокроты, причем 0,5 мл аликвот брали из каждой культуры через 24 ч, 48 ч и 72 ч культурального времени для тестирования. Культуры были сфотографированы, когда были сделаны извлечения для отслеживания...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании была разработана модель in vitro для изучения влияния гипероксии на микробные сообщества легких. Эта модель, основанная на искусственной среде мокроты и ежедневном разбрызгивании сывороточных баллонов, поддерживает повышенные концентрации кислорода и поддерживает рост микробов, идентифицированных в мокроте из pwCF.

Существует несколько критических шагов этого подхода. Во-первых, это выбор использовать фильтр-стерилизацию, а не тепловую стерилизацию искусственной мо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Часть этой работы была выполнена в Морской биологической лаборатории при поддержке Морской биологической лаборатории, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (номер гранта 5600373) и подарком от Фонда Саймонса.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
BME Vitamins (100x) РастворMilliporeSigmaB6891Концентрированный раствор витаминов для добавок.
Обжимной механизм, 30 ммDWK Life Sciences224307Обжимной для крепления алюминиевых уплотнителей к бутылкам с сывороткой.
D-(+)-глюкозаMilliporeSigmaG7021Твердый порошок глюкозы (декстровращающий изомер).
Мембранный насос ME 2 NTVACUUBRAND20730003Вакуумный насос для вакуумной фильтрации.
Эмульсия яичного желткаHiMediaFD045Стерильная эмульсия 30% яичного желтка в физрастворе.
Ферритин, катионизированный израствора ферритина (белка, накапливающего железо)
Безопасная горелка Бунзена FIREBOY plus IntegraBiosciences144000Горелка Бунзена с пользовательским интерфейсом и функциями безопасности.
Бумага Hydrion pH (1.0– 14.0)Испытательная бумага Micro Essential Laboratory94для диапазона 1.0–14.0.
Бумага Hydrion pH (4.0– 9,0)Испытательная бумага Micro Essential Laboratory55pH для диапазона 4,0–9,0.
Бумага Hydrion pH (6.0– 8,0)Испытательная бумага Micro Essential Laboratory345pH для диапазона 6,0–8,0.
Предохранительное устройство для подкожных инъекций Needle-Pro EDGE, 18 гSmiths Medical401815иглы 18 г с безопасными колпачками.
Встроенный манометрMilliporeSigma20469Манометр для контроля давления в баллоне.
Innova 42 Инкубированный шейкерEppendorf2231000756Комбинированный инкубатор/орбитальный шейкер.
Шприц Luer-Lok с прикрепленной иглойBecton Dickinson309580Комбинация шприца 3 мл и иглы 18 г.
Ассортимент клапанов ЛюэраWorld Precision Instruments14011Клапаны для трубок газового потока.
Орбитальный шейкер LSEThermoFisher Scientific6780-NPОрбитальный шейкер для перемешивания сред во время фильтрации.
Сульфат магния гептагидратMilliporeSigmaM2773Твердая английская соль (магния сульфат гептагидрат).
Одноступенчатый регулятор медицинского воздуха с расходомеромWestern EnterprisesM1-346-15FMРегулятор расхода воздуха с измерителем 15 л/мин.
MEM Amino Acids (50x) РастворMilliporeSigmaM5550Концентрированный раствор незаменимых аминокислот.
MEM Заменимые аминокислоты (100x) РастворMilliporeSigmaM7145Концентрированный раствор заменимых аминокислот.
Фильтр Millex-GP, 0,22 & микро; mMilliporeSigmaSLMP25SS0,22 & микро; m полиэфирсульфоновый мембранный стерильный шприцевой фильтр.
Milli-Q AcademicMilliporeSigmaZMQS60E01система фильтрации стерильной воды Milli-Q.
MiniOX 3000 Кислородный мониторMSA814365Контроль процента кислорода в газовом потоке.
Буфер MOPS (1 M, pH 9,0)Boston BioProductsBBM-90MOPS буфер для регулировки pH среды.
Муцин изMilliporeSigmaM2378муцин (гликозилированный гелеобразующий белок).
Комплект фитингов с колючими заусеницами из природного полипропиленаHarvard Apparatus72-1413Соединители для трубок газового потока.
Nextera XT Набор для подготовки библиотеки ДНКIlluminaFC-131-1096Подготовка библиотеки к идентификации во время секвенирования.
NovaSeq 6000 Система секвенированияIllumina770-2016-025-NПлатформа секвенирования дробовика для генерации прохождений образцов.
Кислородный одноступенчатый регулятор с расходомеромWestern EnterprisesM1-540-15FMРегулятор расхода кислорода с измерителем 15 л/мин.
Кислородная трубка с 2 стандартными соединителямиSunMed2001-01Трубка для подключения компонентов газовой системы.
Фосфатно-солевой буфер, 10x, pH 7,4Molecular Biologicals InternationalMRGF-6235Концентрированный фосфатно-солевой буферный раствор.
PC 420 Нагревательная плита / мешалкаMarshall ScientificCO-PC420Комбинированная горячая пластина / мешалка.
Хлорид калияMilliporeSigmaP9541Твердая соль хлорида калия.
Одноразовые мешалки из ПТФЭThermoFisher Scientific14-513-95Одноразовые магнитные мешалки.
Резьба PTFE Seal Teflon TapeVWR470042-938Тефлоновая лента для усиления соединений газовых систем.
Q-Gard 2 Картридждля очистки MilliporeSigmaQGARD00D2Картридж для очистки системы Milli-Q.
Многоразовые бутылки для хранения медиаThermoFisher Scientific06-423AБутылки для смешивания и хранения питательных сред.
Резиновая пробка, 30 мм, Серый бромобутилDWK Life Sciences224100-331Резиновые пробки для флаконов с сывороткой.
Флакон для сыворотки с формованными градуировками, 500 млDWK Life Sciences223952стеклянные флаконы для сыворотки для герметичного культивирования.
Набор удлинителей малого диаметраBraun Medical471960Удлинитель трубки с разъемами люэровского замка.
Хлорид натрияMilliporeSigmaS3014Соль хлорида натрия твердая.
Spike-in Control I (высокая микробная нагрузка)ZymoBIOMICSD6320Spike-in микробы (I. halotolerans и A. halotolerans) для расчета абсолютной микробной нагрузки
Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration SystemMilliporeSigmaS2GPU02RE250 мл 0,22 &; m вакуумная фильтрационная камера.
Sani-Cloth Бактерицидные одноразовые салфеткиProfessional Disposables InternationalH04082Одноразовые бактерицидные салфетки для стерилизации.
Смесь микрометаллов, 1000xThermoFisher ScientificNC0112668Концентрированный раствор физиологических микрометаллов.
Алюминиевое уплотнение без футеровки, 30 ммDWK Life Sciences224187-01Алюминиевые уплотнения, обжатые поверх резиновых стопоров.
USP Medical Grade Air TankAirgasAI USP200Резервуар для сжатого воздуха для подачи в систему промывки.
USP Medical Grade Oxygen TankAirgasOX USP200Баллон для сжатого кислорода для входа в систему разбрызгивания.
лошадиной селезенки. порошка Super

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLoS One. 13 (3), 0194060(2018).
  2. Acosta, N., et al. Sputum microbiota is predictive of long-term clinical outcomes in young adults with cystic fibrosis. Thorax. 73 (11), 1016-1025 (2018).
  3. Muhlebach, M. S., et al. Initial acquisition and succession of the cystic fibrosis lung microbiome is associated with disease progression in infants and preschool children. PLoS Pathogens. 14 (1), 1006798(2018).
  4. Zolin, A., Bossi, A., Cirilli, N., Kashirskaya, N., Padoan, R. Cystic fibrosis mortality in childhood. Data from European cystic fibrosis society patient registry. International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (9), (2018).
  5. Ramos, K. J., et al. Heterogeneity in survival in adult patients with cystic fibrosis with FEV1 30% of predicted in the United States. Chest. 30 (6), 1320-1328 (2017).
  6. Ramos, K. J., et al. Predictors of non-referral of patients with cystic fibrosis for lung transplant evaluation in the United States. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (2), 196-203 (2016).
  7. Girardis, M., et al. Effect of conservative vs conventional oxygen therapy on mortality among patients in an intensive care unit: The Oxygen-ICU randomized clinical trial. JAMA. 316 (15), 1583-1589 (2016).
  8. Comstock, W. J., et al. The WinCF model - An inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55532(2017).
  9. Diraviam Dinesh, S. Artificial sputum medium. Protocol Exchange. , Version 1 (2010).
  10. Kirchner, S., et al. Use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against Pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857(2012).
  11. Grandjean Lapierre, S., et al. Cystic fibrosis respiratory tract salt concentration: An Exploratory Cohort Study. Medicine. 96 (47), Baltimore. 8423(2017).
  12. Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
  13. Van Sambeek, L., Cowley, E. S., Newman, D. K., Kato, R. Sputum glucose and glycemic control in cystic fibrosis-related diabetes: a cross-sectional study. PLoS One. 10 (3), 0119938(2015).
  14. Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846(2016).
  15. Gallagher, T., et al. Liquid chromatography mass spectrometry detection of antibiotic agents in sputum from persons with cystic fibrosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 65 (2), (2021).
  16. Voynow, J. A., Rubin, B. K. Mucins, mucus, and sputum. Chest. 135 (2), 505-512 (2009).
  17. Sui, H. Y., et al. Impact of DNA extraction method on variation in human and built environment microbial community and functional profiles assessed by shotgun metagenomics sequencing. Frontiers in Microbiology. 11, 953(2020).
  18. McIver, L. J., et al. bioBakery: a meta'omic analysis environment. Bioinformatics. 34 (7), 1235-1237 (2018).
  19. Truong, D. T., et al. MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling. Nature Methods. 12 (10), 902-903 (2015).
  20. Stammler, F., et al. Adjusting microbiome profiles for differences in microbial load by spike-in bacteria. Microbiome. 4 (1), 28(2016).
  21. Henke, M. O., Renner, A., Huber, R. M., Seeds, M. C., Rubin, B. K. MUC5AC and MUC5B mucins are decreased in cystic fibrosis airway secretions. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 86-91 (2004).
  22. Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyper concentration and increased osmotic pressure. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3047-3060 (2014).
  23. Matthews, L. W., Spector, S., Lemm, J., Potter, J. L. Studies on pulmonary secretions. I. The over-all chemical composition of pulmonary secretions from patients with cystic fibrosis, bronchiectasis, and laryngectomy. American Review of Respiratory Disease. 88, 199-204 (1963).
  24. Ibanez de Aldecoa, A. L., Zafra, O., Gonzalez-Pastor, J. E. Mechanisms and regulation of extracellular DNA release and its biological roles in microbial communities. Frontiers in Microbiology. 8, 1390(2017).
  25. Tunney, M. M., et al. Detection of anaerobic bacteria in high numbers in sputum from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (9), 995-1001 (2008).
  26. Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Investigation. 109 (3), 317-325 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Cystic Fibrosis MicrobiomeSupplemental OxygenArtificial Sputum MediumAirway Microbial CommunitiesOxygen SpargingSerum Bottle CultureMetagenomic SequencingMicrobial Community CompositionLung PathogensFilter Sterilization

Похожие статьи