Высокопроизводительный, надежный и гибкий по времени метод поверхностной стерилизации семян арабидопсиса

Summary

Предусмотрен высокопроизводительный протокол поверхностной стерилизации семян Arabidopsisthaliana (Arabidopsis), оптимизирующий этапы обработки жидкости с помощью простого всасывающего устройства, построенного с вакуумным насосом. Сотни образцов семян могут быть стерилизованы поверхностно за один день.

Abstract

Arabidopsis на сегодняшний день является модельным видом растений, наиболее широко используемым для функциональных исследований. Поверхностная стерилизация семян арабидопсиса является фундаментальным шагом, необходимым для достижения этой цели. Таким образом, крайне важно установить высокопроизводительные методы поверхностной стерилизации семян Arabidopsis для обработки от десятков до сотен образцов (например, трансгенных линий, экотипов или мутантов) одновременно. В данном исследовании представлен метод стерилизации поверхности семян, основанный на эффективном устранении жидкости в трубах с помощью самодельного всасывающего устройства, построенного из общего вакуумного насоса. За счет резкого сокращения трудоемкого практического времени с помощью этого метода обработка нескольких сотен образцов за один день возможна с небольшими усилиями. Последовательные анализы времени также показали весьма гибкий диапазон времени поверхностной стерилизации за счет поддержания высоких показателей всхожести. Этот метод может быть легко адаптирован для поверхностной стерилизации других видов мелких семян с простой настройкой всасывающего устройства в соответствии с размером семян и скоростью, желаемой для устранения жидкости.

Introduction

Arabidopsis — вид диплоидных растений, относящийся к семейству Brassicaceae. Его относительно короткий жизненный цикл (два месяца на поколение в условиях долгого дня выращивания), небольшой размер растения и самоопыление с производством сотен семян на растение сделали его первым фундаментальным модельным видом растений^1,2. Кроме того, его геном был полностью секвенирован^3,обширные инструменты обратной генетики (насыщенные Т-ДНК, транспозоны и химически мутагенизированные популяции) доступны^4,5,6

Protocol

1. Реагенты и подготовка сред

1. Приготовьте 70% раствор этанола: Добавьте 737 мл 95% технического этанола в 263 мл дистиллированной воды. Тщательно перемешать.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте 70% раствор этанола на нестерильном рабочем столе.
   ВНИМАНИЕ: Этанол легко воспламеняется и может вызвать серьезное раздражение глаз. Хранить вдали от пламени и источников тепла. При попадании в глаза промыть обильной водой.
2. Приготовьте 5% раствор отбеливателя: Добавьте 5 мл бытового отбеливателя (содержащего ~3,5% гипохлорита натрия, NaClO) в 95 мл стерильной дистиллированной воды. Добавьте несколько капель неионного моющего средства (например, Tween 20) и тщатель....

Results

Для оценки времени, необходимого для всей процедуры стерилизации семян, были рассчитаны и сопоставлены с традиционными методами пипетирования разницы во времени обработки жидкости 96 проб в текущем протоколе. Результат показывает, что текущий протокол экономит время, сокращая время обработки жидкости до одной четверти от времени с традиционными протоколами(таблица 1). В таблице далее подчеркивается, что время удаления жидкости в текущем протоколе экономит больше времени, чем у традиционных методов, с общ.......

Discussion

Стерилизация семян является фундаментальным шагом для функциональных исследований при арабидопсисе. Хотя он часто проводится для многих различных целей, доступны ограниченные исследования по высокопроизводительной стерилизации поверхности семян при арабидопсисе.

До сих пор одним из методов с самой высокой пропускной способностью является использование газообразного хлора, образующегося при смешивании отбеливателя с концентрированным HCl. Хотя этот метод требует ограниченного практического врем.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Аквариумный клапан	Amazon	B074CYC5SD	Kit, включающий 2 клапана и тонкостенные трубки. Клапан предотвращает возврат жидкости обратно на стерильный наконечник
Arabidopsis Col-0 семена дикого типа	Nottingham Arabidopsis Stock Center	N1093	Семена дикого типа (чувствительные к канамицину)
Arabidopsis трансгенная линия AdoIspS-79 семена	NA	NA	Трансгенная линия сверхэкспрессирует ген изопренсинтазы из Arundo donax, трансформированный на фоне Col-0, устойчивый к канамицину (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583– 2599).
Микроцентрифуга	Eppendorf	EP022628188	Настольная микроцентрифуга используется для закручивания семян
Murashige & Среда Skoog с	витаминами Duchefa	M0222	Стандартная среда для стерильной культуры
растений Контроллер пипетки	Марка	26300	Используется для работы серологической пипетки
Полиэтиленовая трубка 1	Roth	9591.1	Трубка для подключения от вакуумного насоса к декантаторной бутылке (внутренний диаметр: 7 мм; внешний диаметр: 9 мм)
Полиэтиленовая трубка 2	Roth	9587.1	Трубка для подключения от декантационной бутылки к клапану аквариума  (внутренний диаметр: 5 мм; внешний диаметр: 7 мм)
Винтовая крышка с коннекторами	Roth	PY86.1	2-ходовая винтовая крышка диспенсера GL45 из полипропилена для сцеживания флакона
Серологическая пипетка	марки	27823	Градуированное стекло (многоразовая) серологическая пипетка. Вместо Shakeret al можно использовать одноразовые пипетки
.	Qiagen	85300	Бисерная мельница TissueLyser II обычно используется для гомогенизации тканей. Без добавления бусин в трубочки он работает как шейкер.
Технический этанол	ITW Реагенты (Nova Chimica Srl)	212800	Этанол 96% v/v частично денатурированный технический класс
Tween 20	Merck Millipore	655205	Неионогенное моющее средство, действующее как поверхностно-активное вещество
Универсальные соединители трубок	Roth	Y523.1	Может использоваться для улучшения/упрощения соединений трубок
Вакуумный насос	Merck Millipore	WP6222050	Используется для Изготовление отсасывающего устройства