Методическая статья

Измерение потока митохондриального субстрата в рекомбинантных перфринголизиновых O-пермеабилизированных клетках

DOI:

10.3791/62902

⸱

13 августа 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Faculty of Medicine in Hradec Králové, Charles University, 2Department of Pathophysiology, Third Faculty of Medicine, Charles University, 3Department of Internal Medicine, University Hospital Kralovske Vinohrady

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой работе мы описываем модифицированный протокол для тестирования потока митохондриального дыхательного субстрата с использованием рекомбинантного перфринголизина O в сочетании с микропластинчатой респирометрией. С помощью этого протокола мы показываем, как метформин влияет на митохондриальное дыхание двух разных линий опухолевых клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поток митохондриального субстрата является отличительной характеристикой каждого типа клеток, и изменения в его компонентах, таких как транспортеры, каналы или ферменты, участвуют в патогенезе нескольких заболеваний. Поток митохондриального субстрата может быть изучен с использованием интактных клеток, пермеабилизированных клеток или изолированных митохондрий. Исследование интактных клеток сталкивается с несколькими проблемами из-за одновременного окисления различных субстратов. Кроме того, несколько типов клеток содержат внутренние хранилища различных субстратов, что затрудняет интерпретацию результатов. Такие методы, как изоляция митохондрий или использование пермеабилизирующих агентов, нелегко воспроизвести. Выделение чистых митохондрий с интактными мембранами в достаточном количестве из небольших образцов проблематично. Использование неселективных пермеабилизаторов вызывает различные степени неизбежного повреждения митохондриальной мембраны. Рекомбинантный перфринголизин O (rPFO) был предложен в качестве более подходящего пермеабилизатора, благодаря его способности избирательно проникать плазматической мембраной, не влияя на целостность митохондрий. При использовании в сочетании с микропластинчатой респирометрией он позволяет тестировать поток нескольких митохондриальных субстратов с достаточным количеством реплик в рамках одного эксперимента при использовании минимального количества клеток. В этой работе протокол описывает метод сравнения потока митохондриального субстрата двух разных клеточных фенотипов или генотипов и может быть настроен для тестирования различных митохондриальных субстратов или ингибиторов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микропластичная респирометрия произвела революцию в митохондриальных исследованиях, позволив изучать клеточное дыхание небольшого размера выборки1. Клеточное дыхание обычно рассматривается как показатель митохондриальной функции или «дисфункции», несмотря на то, что диапазон функций митохондрий простирается за пределы производства энергии2. В аэробных условиях митохондрии извлекают энергию, хранящуюся в различных субстратах, разрушая и превращая эти субстраты в метаболические промежуточные продукты, которые могут подпитывать цикл лимонной кислоты3 (рисунок 1). Непрерывный поток субстратов необходим для потока цикла лимонной кислоты для генерации высокоэнергетических «доноров электронов», которые доставляют электроны в цепочку переноса электронов, которая генерирует протонный градиент через внутреннюю митохондриальную мембрану, позволяя АТФ-синтазе фосфорилировать АДФ к АТФ4. Поэтому экспериментальная конструкция для анализа митохондриального дыхания должна включать природу образца (интактные клетки, пермеабилизированные клетки или изолированные митохондрии) и митохондриальные субстраты.

Клетки хранят запас местных субстратов5,а митохондрии окисляют несколько типов субстратов одновременно6,что усложняет интерпретацию результатов, полученных в результате экспериментов, проведенных на интактных клетках. Распространенным подходом к исследованию способности митохондрий окислять выбранный субстрат является выделение митохондрий или пермеабилизация исследуемых клеток5. Хотя изолированные митохондрии идеально подходят для количественных исследований, процесс выделения трудоемкий. Он сталкивается с техническими трудностями, такими как необходимость большого размера выборки, чистота выхода и воспроизводимость метода5. Пермеабилизированные клетки предлагают решение для недостатков митохондриальной изоляции; однако обычные пермеабилизирующие агенты моющей природы не являются специфическими и могут повредить митохондриальные мембраны5.

Рекомбинантный перфринголизин O (rPFO) предлагали в качестве селективного проницателя плазматической мембраны7,и он успешно применялся в комбинации с внеклеточным анализатором флюса в нескольких исследованиях7,8,9,10. Мы модифицировали протокол с использованием rPFO для скрининга потока митохондриальной субстраты с помощью анализатора внеклеточного потока XFe96. В этом протоколе сравниваются четыре различных пути окисления субстрата в двух клеточных фенотипах, имея достаточные реплики и надлежащий контроль для каждого тестируемого материала.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. За день до анализа

  1. Подготовка реагентов и субстратов.
    1. Раствор для митохондриального анализа (MAS): Подготовьте исходные растворы всех реагентов, как описано в таблице 1. Разогрейте запасы маннитола и сахарозы до 37 °C, чтобы полностью раствориться. Смешайте реагенты для приготовления 2x MAS, затем нагрейте смесь до 37 °C. Отрегулируйте pH с 5N KOH до 7,4 (~ 7 мл), затем добавьте воду, чтобы довести объем до 1 л. Фильтр-стерилизуйте и храните аликвоты при -20 °C до дня измерения.
    2. Сывороточный альбумин крупного рогатого скота (5% BSA): Растворите 5 г BSA в 90 мл предварительно расплавленной стерильной воды на магнитной мешалке и избегайте встряхивания. Отрегулируйте рН до 7,4 с 5 Н КОН, а затем добавьте воду, чтобы довести объем до 100 мл. Фильтруют-стерилизуют и хранят аликвоты при -20 °C до дня измерения.
    3. Митохондриальные субстраты: Приготовьте 1 млн растворов сукцината натрия, пирувата натрия и глутамата натрия в стерильной воде. Приготовьте 100 мМ запасного раствора малата натрия в стерильной воде и используйте предварительно приготовленную стерильную воду для приготовления 10 мМ запасного раствора пальмитоилкарнитина. Отрегулируйте рН каждого раствора до 7,4 на 5 Н КОН и фильтруйте-стерилизуйте. Хранить субстраты при температуре 2-8 °C. Во время применения нагревают пальмитоилкарнитин до 37 °C для растворения любых осадков. Для последующего использования храните аликвоты всех субстратов, кроме пирувата, при -20 °C.
    4. Митохондриальные ингибиторы: Используют диметилсульфоксид (ДМСО) для приготовления исходных растворов 25 мМ олигомицина, 50 мМ карбонилцианида 4-(трифторметокси) фенилгидразона (FCCP), 20 мМ ротенона и 20 мМ антимицина А. Хранят аликвоты при -20 °C.
  2. Посев и обработка клеток: Как показано на рисунке 2,засейте клетки в колонки 2-11. Колонки 1 и 12 должны быть оставлены пустыми, чтобы служить фоновыми колодцами. В этой работе были использованы ячейки HepG2 и A549.
    1. Засейте клетки с плотностью 20 000 клеток на лунку. Используйте 50-80 мкл клеточной питательной среды для посева.
    2. Заполните пустые лунки равным объемом клеточной культуральной среды и инкубируйте клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2. Дайте клеткам прикрепиться в течение 3-4 часов, а затем добавьте 100 мкл клеточной культуральной среды во все колодцы.
    3. С добавлением этой последней среды применяйте обработку в колонках 7–11. В этой работе экспериментальную группу обрабатывали 1 мМ метформина гидрохлоридом в течение 16 часов, а контрольную группу обрабатывали равным объемом стерильной дистиллированной воды в качестве органа управления транспортным средством.
  3. Гидратация датчиков: Пипетка 200 мкл стерильной воды на скважину в полезную пластину, затем осторожно верните картридж датчика, погружая датчики в воду. Инкубируйте картридж в инкубаторе безCO2при 37 °C до следующего дня.
  4. Шаблон протокола анализа: Включите анализатор (см. Таблицу материалов)и блок контроллера. Запустите программное обеспечение для управления прибором и сбора данных и разработайте протокол анализа, как описано в таблице 2. В разделе Определения групп создайте четыре стратегии впрыска,где порт A отличается в зависимости от инжектируемой субстрата(рисунок 3). Назовите стратегии в честь субстратов или их аббревиатур.
  5. Портам B, C и D назначают соединения олигомицин, FCCP и ротенон/антимицин А соответственно. Создайте восемь групп и назовите их, как показано на рисунке 4. В разделе Карта пластин назначьте группы соответствующим скважинам, затем сохраните протокол как готовый к использованию шаблон. Оставьте анализатор включенным, чтобы температура стабилизировалась в течение ночи. Держите анализатор в месте со стабильной температурой, чтобы избежать резких перепадов температуры.

2. День анализа

  1. Замена воды калибрантом: Выбросьте воду из опорной плиты и пипетки 200 мкл предварительно выровненного калибранта на скважину в опорную плиту. Верните картридж в инкубатор безCO2до момента анализа. Чтобы избежать быстрого испарения калибранта, поддерживайте источник влажности внутри инкубатора и выключите или уменьшите скорость вращения вентилятора до минимума.
  2. Приготовление рабочих растворов: Начните с нагревания 2x MAS, 5% BSA и стерильной воды до 37 °C. Между тем, позвольте запасам ингибитора достичь комнатной температуры. Используйте теплые 2x MAS и стерильную дистиллированную воду для получения 5 мл рабочей концентрации субстратов и ингибиторов, как описано в таблице 3.
  3. Загрузка инжекционных отверстий: Как показано на рисунке 3,загрузите 20 мкл подложек в порт A. Загрузите сукцинат/ротеноновую смесь в порт A рядов A и B. Загрузите пируватно-малатную смесь в порт A рядов C и D. Загрузите смесь глутамата/малата в порт A рядов E и F. Загрузите смесь пальмитоилкарнитин/малат в порт A рядов G и H. Для всей пластины загрузите порт B 22 мкл препарата олигомицина, порт C с 25 мкл препарата FCCP и порт D с 27 мкл смеси ротенона/антимицина A.
  4. Начало этапа калибровки: на вкладке «Запустить анализ» нажмите «Начать запуск», чтобы начать анализ. Вставьте заряженный картридж датчика и начните этап калибровки. Дождитесь завершения калибровки, прежде чем переходить к следующему шагу.
  5. Приготовление пробирной среды (MAS-BSA-rPFO): Чтобы приготовить 20 мл пробирной среды, смешайте 10 мл 2x MAS, 9,2 мл стерильной воды и 0,8 мл 5% BSA в 50 мл пробирке. Добавьте 2 мкл 10 мкМ rPFO для достижения концентрации 1 нМ и повторно суспендируйте смесь с мягким пипетированием. Избегайте встряхивания и не используйте вихревой смеситель для смешивания. Инкубировать пробирку при температуре 37 °C до момента использования.
  6. Промывка клеток: Промывайте клетки и пустые пустые колодцы два раза с помощью предварительного расплавленного буферного физиологического раствора без фосфата кальция и магния (PBS) с использованием многоканальной пипетки. Избегайте повторного использования одних и тех же советов, чтобы отбросить среду клеточной культуры и добавить PBS. Выполните этот шаг вне ламинарного потока, чтобы защитить клетки от высыхания воздушным потоком.
  7. Проницаемость клеток в пробирной среде: используя многоканальную пипетку, отбросьте PBS и замените его 180 мкл предварительной пробирной среды (MAS-BSA-rPFO).
  8. Начало измерения: Сразу после пермеабилизации замените полезную пластину калиброванного картриджа датчика на пластину ячейки и начните измерение.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Начните с нормализации результатов до второго измерения исходного дыхания, чтобы показать значения в процентах коэффициента потребления кислорода (OCR%). Результаты анализа показаны на рисунках 5, 6, 7 и 8. Важно назначить правильные фоновые колодцы для каждой группы и инактивировать фоновые колодцы других групп. Рисунок 5 показывает, что ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данный протокол является модификацией ранее опубликованных исследований7,8,9,10 и руководства пользователя продукта. В отличие от протокола производителя, вместо 3x MAS используется 2x MAS, так как 2×x MAS легче растворяется и не образует осадков после замерзания. Замороженные 2x MAS аликвоты могут храниться до шести месяцев и показывать стабильные результаты. Другим отличием является включение...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят сотрудников кафедры физиологии медицинского факультета в Градце Кралове и кафедры патофизиологии третьего медицинского факультета за помощь в подготовке химических веществ и образцов. Эта работа была поддержана грантовыми программами Карлова университета PROGRES Q40/02, грантом Министерства здравоохранения Чехии NU21-01-00259, грантом Чешского научного фонда 18-10144 и проектом INOMED CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046, финансируемым Министерством образования, молодежи и спорта Чешской Республики и Европейским союзом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Аденозин 5′ -дифосфат монокалия соль дигидратMerckA5285хранить при -20 °°; C
Антимицин АMerckA8674хранить при -20 °°; C
Бычий сывороточный альбуминMerckA3803магазин в 2 - 8 °deg; C
Карбонильцианид 4-(трифторметокси)фенилгидразонMerckC2920хранить при -20 °°; C
ДиметилсульфоксидMerckD8418в магазине RT
D-MannitolMerck63559в магазине RT
Dulbecco фосфатно-солевой буферный растворGibco14190-144в магазине RT
Этиленгликоль-бис (2-аминоэтиловый эфир)-N,N,N′,N′-тетрауксусная кислотаMerck03777в магазине RT
HEPESMerckH7523магазин в RT
L(-)динатриевая соль яблочной кислотыMerckM9138в RT
L-глутаминовая кислота гидрат солиMerckG5889в RT
Магния хлорид гексагидратMerckM2670в RT
ОлигомицинMerckO4876в -20 градусов; C
Пальмитоил-DL-карнитин хлоридMerckP4509хранить при -20 °°; C
Гидроксид калияMerck484016хранить в RT
Моноосновной фосфат калияMerckP5655хранить в RT
RotenoneMerckR8875хранить при -20 °°; C
Seahorse Wave Настольное программное обеспечениеAgilent технологииСкачать с www.agilent.com
Seahorse XFe96 АнализаторAgilent технологии
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent технологии102416-100XFe96 сенсорные картриджи и микропланшеты для клеточных культур XF96
пируват натрияMerckP2256хранить при 2 - 8 градусах; C
Сукцинат натрия двухосновной гексагидратMerckS2378магазин в RT
SucroseMerckS7903магазин в RT
WaterMerckW3500магазин в RT
XF калибрAgilent technologies100840-000в RT
XF Плазматический мембранный пермеабилизаторAgilent technologies102504-100Перфринголизин рекомбинантный О (рПФО) - Аликвота и хранить при -20°С; С

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  2. Murphy, E., et al. Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).
  3. Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function. Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).
  4. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. , Academic press. London. (2002).
  5. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  6. Staňková, P., et al. Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101(2020).
  7. Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis. Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).
  8. Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).
  9. Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
  10. Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase. PLoS One. 11 (8), 0161413(2016).
  11. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), 21746(2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

OSeahorse XFA549

Похожие статьи