Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Лечение ишемии/реперфузионного повреждения с помощью нетеплового инфракрасного света и последующий анализ дифференцировки макрофагов

1.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62908

⸱

30 декабря 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin, 2Department of Internal Medicine, Loyola University Medical Center, 3Department of Orthopedic Surgery, Medical College of Wisconsin, 4Department of Orthopedic Surgery, University of New Mexico

В этой статье

Краткое содержание

Описано снижение реперфузионного повреждения при облучении с длиной волны 670 нм на мышиной модели ишемии и реперфузии путем наложения жгута. Это облучение с длиной волны 670 нм уменьшало воспалительную реакцию, уменьшало количество провоспалительных макрофагов и увеличивало защитные макрофаги.

Аннотация

Повреждение тканей и некроз в результате воспалительных процессов являются следствием ишемической реперфузионной травмы (ИРИ). В скелетных мышцах ишемия снижает аэробную энергетическую емкость мышечных клеток, что приводит к неблагоприятным биохимическим изменениям и воспалению. Цель данного исследования состоит в том, чтобы показать, что воздействие ближнего инфракрасного света (NIR) в период ишемии снижает IRI за счет уменьшения некроза и воспаления в дополнение к уменьшению провоспалительного M1 и увеличению защитных макрофагов M2. Мышам C57/Bl6 подвергалась односторонняя ишемия задних конечностей, индуцированная жгутом, в течение 3 ч с последующей реперфузией в течение 15 или 30 мин. Мыши были случайным образом распределены по 3 группам. Группе 1 была выполнена ИРИ с 30 мин реперфузией. Группе 2 была выполнена ИРИ с реперфузией 15 минут. Каждая группа состояла из мышей, на 50% не получавших БИК, и на 50% обработанных БИК мышей с экспозицией 50 мВт/см2 в течение 5 мин/1 ч после закрытия жгута. Группу 3 составляли фиктивные животные, которых обезболивали в течение 3 ч без ИРИ.

Лазерная допплеровская визуализация потока была проведена на всех мышах для подтверждения ишемии и реперфузии. Данные о потоке были выражены в виде соотношения ишемизированной конечности и контралатерального контроля. Мышей усыпляли после реперфузии, а также собирали квадрицепсы и икроножные мышцы. Проводили иммунопреципитацию и вестерн-блоттинг макрофагов-маркеров CD68 (M1) и CD206 (M2), которые нормализовали к экспрессии CD14. Экспрессия маркеров воспаления CXCL1 и CXCL5 была значительно снижена при использовании NIR в группе IRI. Значительное снижение CD68 и увеличение экспрессии CD206 наблюдалось у животных, получавших ИР и БИК. В группе ИРИ некроз тканей был снижен за счет БИК, что визуализировалось с помощью окрашивания 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида (ТТС). Полученные данные свидетельствуют о том, что воздействие БИК снижает ИРИ и улучшает выживаемость тканей. NIR уменьшал воспаление, уменьшал провоспалительный M1 и увеличивал защитные макрофаги M2. Воздействие БИК уменьшало воспаление и усиливало регенерацию, что приводило к защите тканей после ишемии.

Введение

Ишемическое реперфузионное повреждение (ИРИ) является клинической проблемой, наблюдаемой после повреждения сосудов и длительного использования хирургических жгутов. Предыдущие исследования показали, что 60-90 мин – это верхний порог времени теплой ишемии, за пределами которого может произойти необратимое повреждение тканей. Больше, чем какой-либо другой фактор, ограничения по времени теплой ишемии ограничивают успех и спасение реимплантации дисваскулярных конечностей 1,2.

В скелетных мышцах ишемия снижает аэробную способность клеток, что приводит к острому воспалению и неблагоприятным биохимическим изменениям. Эти эффекты усугубляются реперфузией, которая стимулирует набор нейтрофилов и выработку свободных радикалов, еще больше повреждая скелетные мышцы. Это может произойти из-за окклюзии сосудов, будь то в результате травмы или преднамеренного использования жгута для предотвращения кровотечения. Некоторыми из ключевых медиаторов в этом процессе являются миелопероксидаза (МПО), фермент, экспрессируемый нейтрофилами, который является неотъемлемой частью функции дыхательного взрыва и производства свободныхрадикалов3, и хемокины, такие как CXCL1 и CXCL5, которые служат для рекрутирования нейтрофилов в места острого воспаления4.

Бедренная артерия не рассекалась, чтобы имитировать открытый жгут в экстренной ситуации. Этот подход также основан на воспроизводимости создания ишемии и реперфузии, а также на устойчивой безкровной области. Предыдущие исследования показали, что воздействие нетеплового инфракрасного (NIR) света с длиной волны 670 нм может увеличить сосудистую коллатерацию в ишемизированной задней конечности мыши с воздействием NIR в течение нескольких дней, смягчая эффекты IRI5. Кроме того, предыдущие исследования показали, что свет ближнего ИК-диапазона может индуцировать поляризацию макрофагов в провоспалительный (M1) или прозаживающий (M2) фенотип6.

Любое лечение, которое может свести к минимуму повреждение тканей и гибель клеток после гипоксии и реперфузии, будет полезным для увеличения успеха в спасении конечностей после сосудистых повреждений. Таким образом, общая цель состоит в том, чтобы улучшить IRI путем введения лечения светом 670 нм в качестве жизнеспособного варианта к другим методам лечения. Эта статья основана на гипотезе о том, что воздействие света ближнего ИК-диапазона в период ишемии уменьшает воспаление и некроз тканей за счет снижения секреции белков хемоаттрактанта и притока воспалительных клеток, побуждая макрофаги принимать фенотип M2.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Данное исследование проводилось в строгом соответствии с рекомендациями, содержащимися в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения. Протокол был одобрен Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (Протокол: AUA#1517). Все исследования с участием мышей проводились в соответствии с политикой PHS.

1. Наложение жгута

ПРИМЕЧАНИЕ: Жгут был наложен для индукции ишемии и получения бескровного операционного поля.

  1. Обезболить мышь C57/Bl6 изофлураном в индукционной камере в концентрации 3-5%.
  2. Извлекайте мышь из индукционной камеры, когда она не реагирует на защемление пальцев ног. Поместите мышь в носовой конус для продолжения анестезии со скоростью 1,5-2% на грелку с неотражающим ковриком под лазерным допплером (LDI).
  3. Наложите жгут вокруг левой задней конечности (рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пока не закрывайте жгут. Сначала измерьте кровоток (см. раздел 2).

2. Измерение кровотока с помощью LDI

ПРИМЕЧАНИЕ: Измеряли кровоток для подтверждения правильной окклюзии и реперфузии, как описано ранее7.

  1. Поместите мышь под наркозом ниже LDI (26 см) на грелку с неотражающей поверхностью в положении лежа с вытянутыми лапами и лапами вверх.
  2. Для захвата изображений можно поместить мышь в область захвата лазера (16,1 см x 16,1 см).
    1. Настройте скорость сканирования лазера 4 мс/пиксель. Делайте снимки с помощью запатентованного программного обеспечения, нажав кнопку записи . Делайте снимки до, во время окклюзии и во время реперфузии, нажав на кнопку записи .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения являются картографическими изображениями, связанными с потоком; красный – хороший кровоток; Синий цвет – это отсутствие кровотока. Подтвердите на изображении, что окклюзированная задняя конечность синего цвета. Точно так же проверьте изображение, чтобы убедиться, что ранее окклюзированная задняя конечность имеет красный цвет при реперфузии. Крайне важно иметь неотражающий коврик для LDI; В противном случае отражение повлияет на изображения.
  3. Проанализируйте изображения с помощью предоставленного программного обеспечения, определив область интереса. Установите соотношение между ишемизированными и контрольными ногами.

3. Протокол ишемии и реперфузии

  1. Закройте жгут вокруг задней конечности мыши, находящейся под наркозом, на 3 часа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Затягивание жгута создает ишемию, прерывая кровоток.
  2. Открыть жгут через 3 ч после окклюзии; Раскройте и перфузируйте заднюю конечность в течение 15 или 30 минут.

4. Забор тканей

  1. Увеличьте анестезию до 5% изофлурана для глубокой анестезии мышей. Проведите пневмоторакс, вскрыв грудную полость острыми ножницами, чтобы обеспечить смерть. Сбор икроножных мышц и четырехглавой мышцы 8,9,10.
  2. Заморозьте собранную ткань в жидком азоте и храните при температуре -80 °C для дальнейшего анализа.

5. Заявка на NIR

ПРИМЕЧАНИЕ: NIR применяется для снижения воспаления и уменьшения реперфузионного повреждения.

  1. Применяйте NIR с длиной волны 670 нм с интенсивностью 100 мВт в течение 5 мин один раз в час во время окклюзии.
  2. Нацельтесь на заднюю конечность с помощью оптоволоконного источника света на расстоянии 2,5 см между задней конечностью и светом. Не подвергайте контралатеральную ногу воздействию ближнего ИК-диапазона (см. схему на рисунке 1 ).
  3. Светите ближним инфракрасным излучением в течение 5 минут в час в течение ишемического периода.
  4. Таким же образом оснастим фиктивную группу. Не закрывайте жгут и не накладывайте NIR на заднюю конечность.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лампа ближнего ИК-диапазона оснащена радиатором. Температура не повышается в течение 5 мин от воздействия света11.

6. Некроз ТТС

ПРИМЕЧАНИЕ: Некроз тканей оценивается для визуализации уменьшения некроза в мышечной ткани.

  1. Свежие четырехглавые мышцы окрашивать TTC при температуре 37 °C в течение 20-30 мин в 1% TTC в 0,1 М фосфатном буфере, доведенном до pH 7,4.
  2. Наблюдайте за красной, окрашенной живой тканью на основании наличия формазанового осадка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Красное окрашивание основано на снижении TTC ферментами дегидрогеназы в здоровых тканях. Некротическая ткань неокрашенная10.
  3. Получение изображений окрашенных TTC срезов для анализа и измерение некротической области путем определения области интереса.

7. Западный анализ на хлортирозин

  1. Подвергните мышей протоколу ишемии/реперфузии (раздел 3).
  2. Соберите ткани (раздел 4) и изолируйте белок, как описано ранее12. Определите концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда13.
  3. Используйте общий лизат белка для проведения электрофореза и блоттинга на 3-хлортирозин, как описано ранее12.
  4. Проводят вестерн-блоттинг на лизаты икроножной мышцы.
    1. Добавьте в образцы буфер для проб Laemmli, содержащий 5% меркаптоэтанола, чтобы получить концентрацию общего белка 25 мкг в 40 мкл.
    2. Проведите испытания образцов на 4-15% геле с удлиненным содержанием трис-глицина (см. Таблицу материалов) при 50 мВ в течение 5 минут. Увеличьте напряжение до 100 мВ на 1 ч, пока не закончится фронт красителя.
  5. Инкубируйте гель в 1x трансферном буфере (25 мМ Трис, 190 мМ глицина, 20% метанола; при необходимости отрегулируйте pH до 8,3) в течение 10 минут.
  6. Соберите сэндвич для переноса (губка, фильтр, гель, целлюлозная мембрана, фильтр, губка). Поместите многоразовый пакет со льдом в передаточное устройство. Перенос на 30 минут в холодильную камеру при давлении 100 мА.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что в переводном бутерброде нет пузырьков, клякса находится на катоде, а гель на аноде.
  7. Промойте блотку и забейте ее в блокирующий буфер (см. Таблицу материалов) с 0,05% Tween в течение 30 минут при комнатной температуре. Промойте блот трис-буферным физиологическим раствором (TBS), содержащим 5% Tween, три раза в течение 5 минут каждый раз перед добавлением основного антитела.
  8. Инкубировать в течение ночи с первичными поликлональными антителами к 3-хлортирозину. Разведите антитела в блокирующем буфере с 0,05% Tween (1:1,000).
  9. Используйте конъюгированный с пероксидазой хрена (HRP) ослиный антимышиный IgG и HRP-антикозий IgG (разведение 1:10 000) в качестве вторичных антител.
  10. Визуализируйте полосы идентичности в блоттинге с помощью реагента с усиленной хемилюминесценцией (ECL) и системы визуализации.
    1. Смешайте компоненты в соответствии с протоколом производителя и инкубируйте их с блотом в течение 3 мин для связывания реагентов ECL с интересующими полосами.
    2. Визуализируйте блоттинг с помощью системы визуализации (см. Таблицу материалов). Используйте программное обеспечение для обработки изображений, такое как ImageJ, для измерения плотности и нормализации значений плотности интересующих каналов по отношению к контрольным каналам.

8. ИФА для CXCL1 и CXCL5

  1. Выделите общий белок из икроножных мышц, как описано ранее12.
  2. Оценивайте степень воспаления с помощью иммуноферментного анализа для CXCL1 и CXCL5, как описано ранее14 и в соответствии с инструкциями производителя.

9. Иммунопреципитация с последующим западным анализом

  1. Подвергните мышей протоколу ишемии/реперфузии (раздел 3).
  2. Соберите ткани (раздел 4) и изолируйте белок, как описано ранее12. Определите концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда13.
  3. Чтобы концентрировать макрофагальную фракцию общего белка лизата, проводят иммунопреципитацию для CD14, как описано ранее15.
  4. Используйте иммунопреципитат CD14 для проведения электрофореза и блоттинга на CD206 и CD68, как описано ранее12.
  5. Проведите вестерн-блоттинг на лизатах икроножной мышцы, как описано в разделе 7.
  6. Инкубируйте иммунопреципитаты в течение ночи с первичными поликлональными антителами к CD206 или CD68. Разведите антитела в соотношении 1:200 при ТБС.
  7. Используйте HRP-конъюгированный ослиный антимышиный IgG и HRP-антикозий IgG (разведение 1:10 000) в качестве вторичных антител.
  8. Нанесите реагент ECL на блоттинг после смешивания компонентов в соответствии с протоколом производителя и инкубируйте в течение 3 минут для визуализации интересующих полос. Визуализируйте блоттинг с помощью системы визуализации.

10. Статистический анализ

  1. Проведите статистический анализ данных внутри и между группами с анализом дисперсии (ANOVA) для повторных измерений с последующей модификацией t-критерия Стьюдента по Бонферрони, p ≤ 0,05.
  2. Экспрессируйте данные в виде среднего ± стандартной погрешности среднего (SEM) или среднего ± стандартного отклонения (SD).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Измерения потока подтвердили ишемию и реперфузию
Размещение света в ближнем ИК-диапазоне и протокол эксперимента показаны на рисунке 1. Была разработана модель ишемии задних конечностей у мышей, которая была использована для оценки влияния воздействия NIR на IRI скелетных мышц. Как и ожидалось, лазерная допплеровская визуализация потока (рис. 2A) подтвердила, что жгут эффективен в индуцировании ишемии наряду с возвращением кровотока к исходно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этой статье описывается одно из первых исследований, посвященных уменьшению реперфузионного повреждения при лечении светом ближнего ИК-диапазона путем изменения воспалительной реакции в задней конечности. Ишемическая реперфузионная травма и лечение светом ближнего ИК-диапазона не являются чем-то новым. Другие исследования были сосредоточены на реперфузии ишемии под действием света ближнего ИК-диапазона. Лечение светом NIR успешно используется для уменьшения размера инфраакта миокарда и...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Мы благодарим отделение ортопедической хирургии за финансирование данного исследования. Мы также благодарим Брайана Линдемера и Гранта Брукеля за их техническую поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2,3,5-трифенилтетразолийSigma Aldrich17779-10X10ML-F1% раствор
4– 15% Criterio TGX Stain-Free Protein GelBioRad#5678084Трис-глицин расширенные гели
4x Laemmli Sample Buffer - 1610747BioRad16110747
670 нм источник светаNIR Technologiesизготовленный на заказ
анализа белка BCAThermo Fisher23227
BioRad ChemiDocBio-RadImaging system
Bio-Rad
β-меркаптоэтанолBioRad1610710
CXCL1 ELISAR& D SystemsDY453-05
CXCL5 ELISAR& D SystemsDX000
ФоранБакстер1001936040изофлурановый ингалянт
козий антикролик IgG-HRPSanta Cruz Biotechnologiessc-20041:10 000
разведение Ice Accu пакет
Лазерный допплер ImagerMoorMOORLDI2-HIR
моноклональное антитело CD14Santa Cruz Biotechnologiessc-5157851:200 разведение
моноклонального антитела CD206Santa Cruz Biotechnologiessc-58986:200 разведение
моноклонального антитела CD68Santa Cruz Biotechnologiessc-200601:200 разведение
Пирс Белк свободный (TBS) блокирующий буферблокирующий буфер
поликлональный хлортирозин антителоHycultHP50021:1,000 разбавление
белка A/G ПЛЮС-АгарозаSanta Cruz Biotechnologiessc-2003
Super Signal West FemtoThermoFisher34095усиленный хемилюминесцентный реагент
набор для со льдом 1

Ссылки

  1. Drysch, M., et al. An optimized low-pressure tourniquet murine hind limb ischemia reperfusion model: Inducing acute ischemia reperfusion injury in C57BL/6 wild type mice. PLoS One. 14 (1), 0210961(2019).
  2. Bonheur, J. A., Albadawi, H., Patton, G. M., Watkins, M. T. A noninvasive murine model of hind limb ischemia-reperfusion injury. Journal of Surgical Research. 116 (1), 55-63 (2004).
  3. Whiteman, M., Spencer, J. P. Loss of 3-chlorotyrosine by inflammatory oxidants: implications for the use of 3-chlorotyrosine as a bio-marker in vivo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (1), 50-53 (2008).
  4. Becker, S., Quay, J., Koren, H. S., Haskill, J. S. Constitutive and stimulated MCP-1, GRO alpha, beta, and gamma expression in human airway epithelium and bronchoalveolar macrophages. American Journal of Physiology. 266 (3), 278-286 (1994).
  5. Zaidi, M., et al. Transient repetitive exposure to low level light therapy enhances collateral blood vessel growth in the ischemic hindlimb of the tight skin mouse. Photochemistry and Photobiology. 89 (3), 709-713 (2013).
  6. Souza, N. H. C., et al. Photobiomodulation and different macrophages phenotypes during muscle tissue repair. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (10), 4922-4934 (2018).
  7. Tang, G. L., Kim, K. J. Laser doppler perfusion imaging in the mouse hindlimb. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e62012(2021).
  8. Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance. European Journal of Cell Biology. 95 (2), 69-88 (2016).
  9. Adamovich, Y., Ezagouri, S., Dandavate, V., Asher, G. Monitoring daytime differences in moderate intensity exercise capacity using treadmill test and muscle dissection. STAR Protocols. 2 (1), 100331(2021).
  10. Wang, C., Yue, F., Kuang, S. Muscle histology characterization using H&E staining and muscle fiber type classification using immunofluorescence staining. Bio-Protocol. 7 (10), 2279(2017).
  11. Keszler, A., Lindemer, B., Hogg, N., Weihrauch, D., Lohr, N. L. Wavelength-dependence of vasodilation and NO release from S-nitrosothiols and dinitrosyl iron complexes by far red/near infrared light. Archives of Biochemistry and Biophysics. 649, 47-52 (2018).
  12. Weihrauch, D., et al. Vasodilation of isolated vessels and the isolation of the extracellular matrix of tight-skin mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55036(2017).
  13. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  14. Li, Z., Jiang, J., Gao, S. Potential of C-X-C motif chemokine ligand 1/8/10/12 as diagnostic and prognostic biomarkers in idiopathic pulmonary arterial hypertension. Clinical Respiratory Journal. , (2021).
  15. Weihrauch, D., et al. Intralipid increases nitric oxide release from human endothelial cells during oxidative stress. JPEN. Journal of Parenteral and Enteral Nutrition. 45 (2), 295-302 (2021).
  16. Liebert, A., Krause, A., Goonetilleke, N., Bicknell, B., Kiat, H. A role for photobiomodulation in the prevention of myocardial ischemic reperfusion injury: A systematic review and potential molecular mechanisms. Scientific Reports. 7, 42386(2017).
  17. Asghari, A., Takhtfooladi, M. A., Hoseinzadeh, H. A. Effect of photobiomodulation on ischemia/reperfusion-induced renal damage in diabetic rats. Lasers in Medical Science. 31 (9), 1943-1948 (2016).
  18. Quirk, B. J., Sonowal, P., Jazayeri, M. A., Baker, J. E., Whelan, H. T. Cardioprotection from ischemia-reperfusion injury by near-infrared light in rats. Photomedicine and Laser Surgery. 32 (9), 505-511 (2014).
  19. Smith, E. R., Shapiro, G. L. Totally tourniquets. The facts & details about different types of tourniquets. JEMS: A Journal of Emergency Medical Services. 38 (11), 48-50 (2013).
  20. Yu, G., et al. Inhibition of myeloperoxidase oxidant production by N-acetyl lysyltyrosylcysteine amide reduces brain damage in a murine model of stroke. Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 119(2016).
  21. de Brito Sousa, K., et al. Differential expression of inflammatory and anti-inflammatory mediators by M1 and M2 macrophages after photobiomodulation with red or infrared lasers. Lasers in Medical Science. 35 (2), 337-343 (2020).
  22. Iida, N., Grotendorst, G. R. Cloning and sequencing of a new gro transcript from activated human monocytes: expression in leukocytes and wound tissue. Molecular and Cellular Biology. 10 (10), 5596-5599 (1990).
  23. Jani, S., Bergmann, S. R. Metabolic modulation of myocardial ischemia. Current Cardiology Reports. 8 (2), 123-130 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

ближний инфракрасный светповреждение скелетных мышцнекроз тканеймакрофаги M1макрофаги M2лазер-доплеровская визуализациявестерн-блоттингмаркеры воспаления

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.