Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Определение митохондриального дыхания и гликолиза в образцах ткани сетчатки ex vivo

4.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62914

⸱

4 августа 2021 г.

 ,  , 
1Neurobiology, Neurodegeneration & Repair Laboratory, National Eye Institute, National Institutes of Health

В этой статье

Краткое содержание

Здесь описан подробный протокол для проведения анализа митохондриального стресса и анализа скорости гликолитизма в образцах ткани сетчатки ex vivo с использованием коммерческого биоанализатора.

Аннотация

Митохондриальное дыхание является критическим энергетическим путем во всех клетках, особенно в фоторецепторах сетчатки, которые обладают высокоактивным метаболизмом. Кроме того, фоторецепторы также демонстрируют высокий аэробный гликолиз, как раковые клетки. Точные измерения этих метаболических активностей могут дать ценную информацию о клеточном гомеостазе в физиологических условиях и в болезненных состояниях. Высокопроизводительные микропластинчатые анализы были разработаны для измерения митохондриального дыхания и различных метаболических активностей в живых клетках. Тем не менее, подавляющее большинство из них разработаны для культивируемых клеток и не были оптимизированы для интактных образцов тканей и для применения ex vivo. Здесь описан подробный пошаговый протокол, использующий технологию флуоресценции на основе микропластин, для непосредственного измерения скорости потребления кислорода (OCR) в качестве индикатора митохондриального дыхания, а также скорости внеклеточного подкисления (ECAR) в качестве индикатора гликолиза в неповрежденной ex vivo ткани сетчатки. Этот метод был использован для успешной оценки метаболической активности в сетчатке взрослой мыши и демонстрации его применения в исследовании клеточных механизмов старения и заболеваний.

Введение

Митохондрии являются важными органеллами, которые регулируют клеточный метаболизм, передачу сигналов, гомеостаз и апоптоз, координируя несколько важных физиологических процессов1. Митохондрии служат электростанцией в клетке для генерации аденозинтрифосфата (АТФ) путем окислительного фосфорилирования (OXPHOS) и обеспечивают энергию, которая поддерживает почти все клеточные события. Большая часть клеточного кислорода метаболизируется в митохондриях, где он служит конечным акцептором электронов в цепи переноса электронов (ETC) во время аэробного дыхания. Низкие количества АТФ также могут быть получены в результате гликолиза в цитозоле, где глюкоза превращается в пируват, который может быть дополнительно преобразован в лактат или транспортироваться в митохондрии и окисляться до ацетил-КоА, субстрата в цикле трикарбоновой кислоты (цикл ТЦА).

Сетчатка является одной из наиболее метаболически активных тканей у млекопитающих2, демонстрируя высокий уровень митохондриального дыхания и чрезвычайно высокое потребление кислорода3. Палочковые и конусные фоторецепторы содержат высокую плотность митохондрий4, а OXPHOS генерирует большую часть АТФ в сетчатке5. Кроме того, сетчатка также в значительной степени зависит от аэробного гликолиза6,7 путем преобразования глюкозы в лактат5. Митохондриальные дефекты связаны с различными нейродегенеративными заболеваниями8,9; и с его уникальными высокими энергетическими потребностями, сетчатка особенно уязвима к метаболическим дефектам, в том числе тем, которые влияют на митохондриальный OXPHOS4 и гликолиз10. Митохондриальная дисфункция и дефекты гликолиза связаны с дегенеративными заболеваниями сетчатки11,12 и макулярной13, возрастной макулярной дегенерацией10,14,15,16 и диабетической ретинопатией17,18. Поэтому точные измерения митохондриального дыхания и гликолиза могут обеспечить важные параметры для оценки целостности и здоровья сетчатки.

Митохондриальное дыхание может быть измерено путем определения скорости потребления кислорода (OCR). Учитывая, что превращение глюкозы в пируват, а затем в лактат приводит к экструзии протонов и подкислению внеклеточной среды, измерения скорости внеклеточного подкисления (ECAR) дают представление о потоке гликолиза. Поскольку сетчатка состоит из нескольких типов клеток с близкими отношениями и активной синергией, включая обмен субстратами6, крайне важно проанализировать митохондриальную функцию и метаболизм в контексте всей ткани сетчатки с неповрежденным ламинированием и схемой. В течение последних нескольких десятилетий электроды Кларка типа O2 и другие кислородные микроэлектроды использовались для измерения потребления кислорода в сетчатке19,20,21. Эти кислородные электроды имеют серьезные ограничения в чувствительности, требовании большого объема образца и необходимости непрерывного перемешивания суспендирующего образца, что обычно приводит к нарушению клеточного и тканевого контекста. Протокол, описанный здесь, был разработан с использованием флуоресцентного метода на основе микропластин для измерения митохондриального энергетического метаболизма в свежерассеченной ткани сетчатки мыши ex vivo. Он позволяет одновременно измерять OCR и ECAR со средней пропускной способностью в режиме реального времени с использованием небольшого образца (1 мм перфоратора) ткани сетчатки ex vivo, избегая при этом необходимости в суспензии и непрерывном перемешивании.

Здесь показана экспериментальная процедура анализа митохондриального стресса и анализа гликолитической скорости на свежерассеченных перфораторных дисках сетчатки. Этот протокол позволяет измерять метаболическую активность, связанную с митохондриями, в контексте ткани ex vivo. В отличие от анализов, выполняемых с использованием культивируемых клеток, показания, полученные здесь, отражают комбинированный энергетический метаболизм на тканевом уровне и зависят от взаимодействия между различными типами клеток в ткани. Протокол модифицирован по сравнению с ранее опубликованной версией 22,23 для адаптации к новому поколению внеклеточного анализатора 24-луночного потока Agilent Seahorse (XFe24) с пластиной Islet Capture. Среда для анализа, концентрации инъекционных соединений и количество/продолжительность циклов анализа также были оптимизированы для ткани сетчатки. Приведен подробный пошаговый протокол приготовления перфораторных дисков сетчатки. Более подробную информацию о настройке программы и анализе данных можно получить из руководства пользователя производителя24,25,26.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все мышиные протоколы были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Национального института глаз (NEI ASP# 650). Мыши содержались в 12-часовых светло-темных условиях и ухаживали за ними, следуя рекомендациям Руководства по уходу и использованию лабораторных животных, Института ресурсов лабораторных животных и Политики службы общественного здравоохранения по гуманному уходу и использованию лабораторных животных.

1. Картридж датчика гидратации и подготовка пробирной среды

  1. За день до эксперимента добавьте 1 мл калибровочной среды в каждую лунку полезной пластины. Поместите крышку Hydro-Booster сверху и опустите картридж датчика через отверстие на крышке. Убедитесь, что датчик погружен в калибровочную среду. Инкубируйте картридж датчика в течение ночи в инкубаторе без CO2 при 37 °C для активации флуорофоров.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения испарения инкубатор увлажняют, держа внутри лоток с водой, а кассету с картриджем датчика оборачивают прозрачной полиэтиленовой пленкой.
  2. Подготовьте пробирную среду путем восстановления среды DMEM Seahorse с добавлением глюкозы, пирувата и глутамина до желаемых концентраций. В анализах, представленных в этой статье, конечная концентрация субстратов в пробирной среде составляет: 6 мМ глюкозы, 0,12 мМ пирувата и 0,5 мМ глутамина. Для каждой пробирной пластины в день эксперимента готовится 40 мл пробирной среды в свежем виде.
  3. Настройте программу анализа в анализаторе в соответствии с инструкцией производителя26. В анализе, показанном здесь, протокол устанавливается следующим образом: 5 циклов измерений для исходного уровня, затем ввод порта A, затем 4 цикла измерений, затем ввод порта B и последующие 4 цикла измерений. Каждый цикл состоит из смеси (3 мин), ожидания (2 мин) и измерения (3 мин).

2. Покрытие сетчатых вставок микропластины островкового захвата

  1. Приготовьте смесь покрытия, объединив 20 мкл клеточной присоединения среды (например, Cell-Tak) со 171 мкл бикарбоната натрия 0,1 М и 9 мкл 1 М NaOH.
  2. Откройте крышку кассеты, содержащей сетчатые вставки. Пипетку 8 мкл покрытия смешивают с каждой сетчатой вставкой. Используйте наконечник пипетки, чтобы аккуратно намазать / распределить каплю вокруг, чтобы равномерно распределить смесь покрытия по всей сетчатой вставке.
  3. Закройте кассету и дайте сетчатым вставкам инкубироваться при комнатной температуре в течение не менее 25 мин для адсорбции.
  4. Промыть сетчатую вставку, пипеткой 4 мл пробирной среды непосредственно на сетчатые вставки. Аккуратно встряхните кассету, чтобы убедиться, что все сетчатые вставки промыты пробирной средой.
  5. Держите сетчатую вставку в стороне. Он готов к использованию.

3. Приготовление инъекционных соединений

  1. Вынимайте запасные аликвоты Бам15 (10 мМ), Ротенона (10 мМ), Антимицина А (10 мМ) и 2-ДГ (500 мМ) из морозильной камеры -80 °С и оттаивайте при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Запас 2-DG готов к использованию. Остальные препараты нужно разбавить до рабочего запаса.
  2. Разогрейте 10 мл пробирной среды на водяной бане с температурой 37 °C.
  3. Разбавьте 10 мМ Bam15 до 50 мкМ рабочего материала с использованием двухэтапной процедуры разбавления: смешайте 20 мкл запаса 10 мМ с 20 мкл ДМСО для получения промежуточного запаса 5 мМ. Затем смешайте 10 мкл промежуточного материала выше 5 мМ с 990 мкл предварительно нагретой пробирной среды, чтобы получить конечный рабочий материал 50 мкМ.
  4. Разбавьте и смешайте 10 мМ ротенона и 10 мМ запаса антимицина А до 10 мкМ рабочего материала ротенона/антимицина А (Rot/AA) двумя этапами разведения: смешайте по 10 мкл из 10 мМ ротенона и 10 мМ запаса антимицина А с 80 мкл ДМСО для получения промежуточного запаса 1 мМ Рот/АА. Затем смешайте 10 мкл вышеуказанного промежуточного материала 1 мМ с 990 мкл предварительно нагретой пробирной среды, чтобы получить конечный рабочий материал Rot/AA 10 мкМ.
  5. Только что подготовьте вышеупомянутые рабочие запасы инъекционных соединений в день эксперимента и отложите их при комнатной температуре до загрузки в инжекционные отверстия картриджа датчика.

4. Рассечение сетчатки и подготовка перфоратора сетчатки

  1. Усыпление мыши путем удушья CO2 в соответствии с Руководящими принципами AVMA по эвтаназии27.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте животное в камере CO2 дольше, чем время, необходимое для эвтаназии.
  2. Энуклеат глаз и поместите в ледяной старый 1x PBS буфер в чашке Петри, а затем поместите его под рассеченный микроскоп.
  3. Аккуратно удалите, разрезав микросубчиками, лишние прямые мышцы, прикрепленные снаружи глазного яблока, и отрежьте зрительный нерв.
  4. Используйте иглу весом 30 г, чтобы пробить отверстие на краю роговицы (лимбус); он служит местом вставки для микросублиц. Затем используйте тонкие рассечение микросубчиками, чтобы сделать круговой разрез по краю роговицы, отделив ее от задней глазной чашки.
  5. Используйте острые рассеченные щипцы, чтобы удалить роговицу, хрусталик и стекловидное тело подальше от глазной чашки.
  6. Используйте тонкие рассеченные микросубчики, чтобы сделать несколько небольших разрезов на склеральном слое на краю глазной чашки. Избегайте разрезания слоя сетчатки. Используйте два острых рассеченных щипца, чтобы удержать склеральную ткань с каждой стороны разреза и очень осторожно потяните за склеральный слой, чтобы удалить его из нервной сетчатки. Повторяйте это вокруг глазной чашки до тех пор, пока не будут удалены все склеры и не будет получена неповрежденная чашка сетчатки.
  7. Используйте рассечение микросублицоров и сделайте радиальные надрезы на чашке сетчатки, чтобы сплющить ее и создать несколько отдельных секций.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от навыков рассечения и опыта человека в обращении со свежей тканью сетчатки, чашка сетчатки может быть разрезана для создания от 3 до 5 отдельных секций.
  8. Используйте перфоратор для биопсии диаметром 1 мм, чтобы вырезать один диск сетчатки из каждого участка уплощенной чашки сетчатки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует позаботиться о том, чтобы диски сетчатки были пробиты на равном расстоянии от головки зрительного нерва.
  9. Используйте щипцы для переноса предварительно покрытых сетчатых вкладышей в рассекающую чашку Петри. С помощью двух сверхтонких ресниц поместите перфоратор сетчатки на сетчатую вставку. Перфорационный диск сетчатки помещается в центре сетчатой вставки с ганглиозным клеточным слоем стороной вниз, касаясь сетки и слоя фоторецептора лицом вверх.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Часто некоторые клетки RPE остаются прикрепленными к фоторецепторам, и пигментация этих клеток может быть использована в качестве индикатора ориентации диска перфоратора сетчатки.

5. Загрузка портов впрыска картриджа датчика и калибровка

  1. Достаньте гидратированную кассету с картриджной пластиной датчика из инкубатора с температурой 37 °C. Снимите крышку Hydro-Booster и поместите картридж датчика обратно на пластину утилиты.
  2. Загрузите желаемый объем растворов рабочего сырья инжекционных составов в соответствующие порты. Держите наконечник пипетки под углом 45°. Вставьте наконечник пипетки наполовину в инжекционный порт со скосом наконечника у противоположной стенки инжекционного отверстия и осторожно загрузите соединение в каждый порт. Избегайте введения пузырьков воздуха.
  3. Обратитесь к руководству пользователя прибора для получения объема соединения, загруженного в каждый инжекционный порт для конкретного анализа. В экспериментах, представленных в данной работе, 68 мкл рабочего материала Bam15 50 мкМ (для анализа митохондриального стресса) или 68 мкл рабочего материала Rot/AA 10 мкМ (для анализа скорости гликолита) загружается в порт А; 75 мкл рабочего материала Rot/AA 10 мкМ (для анализа митохондриального стресса) или 75 мкл рабочего материала 500 мМ 2-DG (для анализа скорости гликолитизма) загружается в порт B.
  4. Нагрузите нагнетательные отверстия всех скважин плиты, включая фоновые коррекционные скважины и заготовки скважин для обеспечения правильной закачки. Загрузите соответствующий составной раствор в каждый порт для фоновых коррекционных скважин. Пробирная среда может быть замещена, вместо сложного раствора, в каждом из портов береговых скважин.
  5. Поместите нагруженную пластину картриджа датчика со снятой крышкой в анализаторную машину, чтобы начать калибровку перед запуском анализа. После завершения калибровки программа автоматически приостановит работу, ожидая замены полезной пластины на пластину захвата островка, содержащую перфораторы сетчатки.

6. Загрузка пластины захвата островка и запуск прогона

  1. Добавьте 607 мкл пробирной среды в каждую лунку островковой улавливающей пластины
  2. Используйте щипцы, чтобы захватить ободок сетчатой вставки, содержащей перфораторные диски сетчатки сверху, и вынуть его из чашки Петри. Слегка постучите по нижней части сетчатой вставки по впитывающей салфетке, чтобы удалить лишнюю жидкость, и поместите ее в колодец пластины захвата островка. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока все сетчатые вставки с перфораторами сетчатки не будут помещены в пластину захвата островка. Заполняйте фоновые корректирующие колодцы и пустые колодцы пустыми сетчатыми вставками.
  3. Используйте два щипца Graefe, чтобы осторожно и осторожно прижать обод каждой сетчатой вставки и убедиться, что они надежно вставлены в нижнюю часть пластины захвата островка.
  4. Поместите загруженную пластину захвата островка в инкубатор с температурой 37 °C на 5 минут для прогрева.
  5. Извлеките полезную пластину после завершения калибровки и замените ее пластиной захвата островка с отслойкой, содержащей перфораторы сетчатки.
  6. Возобновите прогон анализа.

7. Запуск терминации и хранения данных

  1. После завершения запуска извлеките картридж датчика и пластину захвата островка, содержащую перфораторы сетчатки. Данные автоматически сохраняются в виде файла .asyr.
  2. Используйте соответствующее программное обеспечение для анализа данных для просмотра и анализа данных в соответствии с руководством пользователя производителя26.
  3. Используйте функцию Export для экспорта .xslx файла данных, который можно просматривать и анализировать с помощью программного обеспечения для работы с электронными таблицами.

8. Сохранение образца перфоратора сетчатки

  1. После анализа выньте пластину из машины, извлеките картридж датчика и аккуратно извлеките пробирную среду из каждой лунки с помощью пипетки.
  2. Нанесите крышку обратно и запечатайте боковые стороны пластины полоской парапленки.
  3. Хранить при температуре -80 °C.
  4. Для нормализации количественно оцените общее содержание ДНК или белка в пунше в каждой лунке.

9. Анализ данных

  1. Анализ митохондриального стресса
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измеренное значение OCR (totalOCR) представляет общее потребление кислорода тканью. После инъекции Bam15 (разъединителя) OCR увеличивается с базального уровня (totalOCRbasal) до максимального уровня (totalOCRmax) и снижается после инъекции Rot/AA. Остаточное значение OCR после инъекции Rot/AA (totalOCRRot/AA) представляет собой немитохондриальное потребление кислорода.
    1. Рассчитайте потребление кислорода, связанное с митохондриями, следующим образом:
      figure-protocol-1 (Экв. 1) 28 См.
    2. Рассчитайте емкость митохондриального резерва (MRC) следующим образом:
      figure-protocol-2 (Экв. 2) 29 См.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Последнее чтение среди 5 измерений перед инъекцией Bam15 принимается за «базальное» значение (для totalOCRbasal и mitoOCRbasal). Самое высокое значение среди 4 измерений после инъекции Bam15 используется в качестве «максимального» значения (для totalOCRmax и mitoOCRmax). Самое низкое значение среди 4 измерений после инъекции Rot/AA используется как totalOCRRot/AA.
  2. Анализ гликолитической скорости
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измеренное значение ECAR (totalECAR) представляет собой полное подкисление среды метаболической активностью ткани. В целом, подкисление внеклеточной микросреды происходит в основном путем экструзии гликолитического продукта, лактата. Катаболизм субстратов в митохондриальном цикле ТЦА приводит к образованию CO2, который также подкисляет внеклеточную среду путем гидратации до бикарбоната.
    1. Субстрактные митохондриальные вещества способствовали подкислению среды (mitoECAR) из totalECAR для получения гликоЭКАР.
      figure-protocol-3 (Экв. 3) 28 См.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Митохондриальное дыхание и цикл ТЦА являются сильно связанными процессами. Производство CO2 из митохондрий является функцией скорости OXPHOS, которая измеряется с помощью mitoOCR.
    2. Рассчитайте mitoECAR как:
      figure-protocol-4 (Экв. 4) 28 См.
      где CCF (коэффициент вклада CO2 ) представляет собой эмпирически рассчитанное значение соотношения, представляющее величину вклада H+ от ПОДКИСЛЕНИЯ, опосредованного CO2, по отношению к каждому потреблению O2 от OXPHOS. CCF для этой системы предварительно определен как 0,6028. Точное измерение подкисления среды определяется буферной емкостью среды, чувствительностью приборного датчика рН и эффективной емкостью измерительной камеры. Здесь BF (Buffer Factor) является параметром экспериментальной буферной емкости in situ , представляющим количество H+ или OH- , добавленное в эффективную измерительную камеру для изменения уровня pH на 1 единицу. Когда используется индивидуальная среда для анализа, BF может быть определен путем титрования известных количеств кислоты в пробирную среду в соответствии с протоколом Buffer Factor30. Средняя рН Seahorse DMEM 7,4, используемая в этом протоколе, имеет заранее определенный BF 2,60 ммоль H + / L / pH. Пластина захвата островков, используемая в этом протоколе, имеет Volmicrochamber = 16,6 μL31. Коэффициент масштабирования объема, Kvol, является эмпирически определенной константой. Значение Kvol недоступно для пластины захвата островков, но может быть рассчитано из значения микропластины28, учитывающего разницу объема в их микрошаблонах, равным 0,41.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция Rot/AA отключает митохондриальное дыхание и заставляет ткань переключаться на гликолиз для производства АТФ, что приводит к более высокой экструзии лактата и увеличению измерения ECAR. Гликолиз прекращается при инъекции 2-DG, а остаточное измерение ECAR выявляет негликолитическое и немитохондриальное подкисление среды.
    3. Рассчитайте емкость запаса гликолитиков (GRC) следующим образом:
      figure-protocol-5 (Экв. 5) 32 См.
      где последнее показание среди 5 измерений перед инъекцией Rot/AA принимается за «базальное» значение (glycoECARbasal). Самое высокое значение среди 4 измерений после инъекции Rot/AA используется в качестве «максимального» значения (glycoECARmax). Самое низкое показание среди 4 измерений после инъекции 2-DG используется в качестве glycoECAR2-DG.
  3. Нормализация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нормализация необходима при сравнении показаний тканей сетчатки разных возрастных групп или между образцами дикого типа и патологическими/дегенеративными образцами, которые могут отличаться по количеству клеток.
    1. Используйте коммерчески доступные наборы для оценки содержания ДНК в каждом перфораторном диске сетчатки33,34.
    2. Альтернативно, используйте буфер радиоиммунопреципитации (буфер RIPA) для извлечения общего белка из пунша сетчатки и используйте содержание белка для нормализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ранее было определено, что площадь поверхности сетчатки взрослой мыши составляет около 20 мм2, и каждая сетчатка содержит ~ 6,5 миллиона клеток35. Следовательно, каждый перфоратор сетчатки диаметром 1 мм составляет ~ 1/25 одной сетчатки и содержит ~ 260K клеток. На эти цифры можно ссылаться при сравнении данных от пунша сетчатки с данными из других образцов тканей или культивируемых клеток;

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Данные, представленные здесь, представляют собой репрезентативный анализ митохондриального стресса, показывающий след OCR (рисунок 1), и анализ гликолитической скорости, показывающий след OCR и след ECAR (рисунок 2), которые были выполнены с использованием недавно рассеченных 1 мм перфорационных дисков сетчатки 4-месячной детей с трансгенной Nrl-L-EGFP36 (фон C57B / L6). Эти мыши экспрессируют GFP конкретно в палочковых фоторецеп...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь приведены подробные инструкции по проведению микропластинчатых анализов активности митохондриального дыхания и гликолиза с использованием ex vivo, свежерассеченных перфораторных дисков сетчатки. Протокол был оптимизирован для: 1) обеспечения использования подходящей среды для анализа ткани сетчатки ex vivo; 2) использовать надлежащий размер перфорационных дисков сетчатки для получения показаний OCR и ECAR, которые попадают в оптимальный диапазон обнаружения машины; 3) покрытие сетчатых вставок для...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа поддерживается Программой очных исследований Национального института глаз (ZIAEY000450 и ZIAEY000546).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1X PBSThermo Fisher14190-144
2-дезоксиглюкоза (2-DG), 500 мМ стоковый растворSigmaD6134Растворить в среде Seahorse XF DMEM, заранее приготовить
иглу 30 калибраBD Precision Glide305106
антимицин А, 10 мМ стоковый растворSigmaA8674Растворить в ДМСО, заранее приготовить
Bam15, 10 мМ сток растворTimTecST056388Растворите в ДМСО, подготовьте заранее
Биопсийный перфоратор, 1 ммIntegra Miltex33-31AA
Cell-TakCorning Life SciencesCB40240
камера для удушья CO2 Щипцы
рассечения-Dumont #5Fine Science Tools11251-10Stright tip
Dissection щипцы-Dumont #7Fine Science Tools11274-20Изогнутый наконечник
Диссекционный микроскоп
DMSOSigmaD2438
Щипцы GraefeFine Science Tools11051-10Изогнутый зубчатый наконечник
МикроножницыFine Science Tools15004-08Изогнутый наконечник
раствор NaOH, 1 MSigma-AldrichS8263Водный раствор, приготовить заранее
Ротенон, 10 мМ стоковый растворSigmaR8875Растворить в ДМСО, заранее приготовить
калибровочную среду для морского конькаAgilent100840-000
Морской конек XF 1,0 М глюкозаAgilent103577-100
Морской конек XF 100 мМ пируватAgilent103578-100
Seahorse XF 200 мМ глютаминAgilent103579-100
Seahorse XF DMEM mediumAgilent103575-100pH 7,4, с 5 мМ HEPES
Seahorse XFe24 Островковый захват FluxPakAgilent103518-100содержащий сенсорный картридж и микропланшет для захвата островков
Seahorse XFe24, экстра-клеточный анализатор потоковAgilent
раствор бикарбоната натрия, 0,1 MSigma-AldrichS5761Водный раствор, приготовленный заранее
Супертонкая кисть для ресницTed Pella113
для ,

Ссылки

  1. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
  2. Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye Brain. 2, 99-116 (2010).
  3. Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution and consumption within the retina in vascularised and avascular retinas and in animal models of retinal disease. Progress in Retina and Eye Research. 20, 175-208 (2001).
  4. Barot, M., Gokulgandhi, M. R., Mitra, A. K. Mitochondrial dysfunction in retinal diseases. Current Eye Research. 36 (12), 1069-1077 (2011).
  5. Joyal, J. S., Gantner, M. L., Smith, L. E. H. Retinal energy demands control vascular supply of the retina in development and disease: The role of neuronal lipid and glucose metabolism. Progress in Retina and Eye Research. 64, 131-156 (2018).
  6. Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas. Journal of Neuroscience Research. 93 (7), 1079-1092 (2015).
  7. Haydinger, C. D., Kittipassorn, T., Peet, D. J. Power to see-Drivers of aerobic glycolysis in the mammalian retina: A review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1057-1071 (2020).
  8. Wright, A. F., et al. Lifespan and mitochondrial control of neurodegeneration. Nature Genetics. 36, 1153-1158 (2004).
  9. Bossy-Wetzel, E., Schwarzenbacher, R., Lipton, S. A. Molecular pathways to neurodegeneration. Nature Medicine. 10, Suppl 2-9 (2004).
  10. Leveillard, T., Philp, N. J., Sennlaub, F. Is retinal metabolic dysfunction at the center of the pathogenesis of age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), (2019).
  11. Vlachantoni, D., et al. Evidence of severe mitochondrial oxidative stress and a protective effect of low oxygen in mouse models of inherited photoreceptor degeneration. Human Molecular Genetics. 20 (2), 322-335 (2011).
  12. Grenell, A., et al. Loss of MPC1 reprograms retinal metabolism to impair visual function. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (9), 3530-3535 (2019).
  13. Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews in Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).
  14. Jarrett, S. G., Boulton, M. E. Consequences of oxidative stress in age-related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 399-417 (2012).
  15. Rozing, M., et al. Age-related macular degeneration: A two-level model hypothesis. Progress in Retina Eye Research. 76, 100825(2020).
  16. Yokosako, K., et al. Glycolysis in patients with age-related macular degeneration. Open Ophthalmology Journal. 8, 39-47 (2014).
  17. Bek, T. Mitochondrial dysfunction and diabetic retinopathy. Mitochondrion. 36, 4-6 (2017).
  18. Yumnamcha, T., Guerra, M., Singh, L. P., Ibrahim, A. S. Metabolic dysregulation and neurovascular dysfunction in diabetic retinopathy. Antioxidants. 9 (12), Basel. (2020).
  19. Futterman, S., Kinoshita, J. H. Metabolism of the retina. I. Respiration of cattle retina. Journal of Biological Chemistry. 234 (4), 723-726 (1959).
  20. Linsenmeier, R. A. Effects of light and darkness on oxygen distribution and consumption in the cat retina. Journal of General Physiology. 88 (4), 521-542 (1986).
  21. Medrano, C. J., Fox, D. A. Oxygen consumption in the rat outer and inner retina: light- and pharmacologically-induced inhibition. Experiments in Eye Research. 61 (3), 273-284 (1995).
  22. Kooragayala, K. Quantification of oxygen consumption in retina ex vivo demonstrates limited reserve capacity of photoreceptor mitochondria. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
  23. Adlakha, Y. K., Swaroop, A. Determination of mitochondrial oxygen consumption in the retina ex vivo: applications for retinal disease. Methods in Molecular Biology. 1753, 167-177 (2018).
  24. Agilent Mitocondrial stress test user guide. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Cell_Mito_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf (2021).
  25. Agilent Glycolytic rate assay user guide. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf (2021).
  26. Agilent wave 2.6 user guide. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/S7894-10000_Rev_C_Wave_2_6_User_Guide.pdf (2021).
  27. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. , Available from: https://www.avma.org/sites/default/files/2020-01/2020-Euthanasia-Final-1-17-20.pdf (2021).
  28. Improving Quantification of Cellular Glycolytic Rate Using Agilent Seahorse XF Technology. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/whitepaper/public/whitepaper-improve-quantification-of-cellular-glycolytic-rate-cell-analysis-5991-7894en-agilent.pdf (2021).
  29. Report Generator User Guide Agilent Seahorse XF Cell Mito Stress Test. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/Report_Generator_User_Guide_Seahorse_XF_Cell_Mito_Stress_Test_Single_File.pdf (2021).
  30. Agilent Seahorse XF Buffer Factor Protocol. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/usermanual-xf-buffer-factor-protocol-cell-analysis-S7888-10010en-agilent.pdf (2021).
  31. Agilent sensor cartridges and cell culture microplates. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf (2021).
  32. Agilent Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit User Guide. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf (2021).
  33. Fan, Y. Y. A bioassay to measure energy metabolism in mouse colonic crypts, organoids, and sorted stem cells. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309, 1-9 (2015).
  34. Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
  35. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  36. Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (10), 3890-3895 (2006).
  37. Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2014).
  38. Corso-Diaz, X., et al. Genome-wide profiling identifies DNA methylation signatures of aging in rod photoreceptors associated with alterations in energy metabolism. Cell Reports. 31 (3), 107525(2020).
  39. Berkowitz, B. A., et al. Mitochondrial respiration in outer retina contributes to light-evoked increase in hydration in vivo. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (15), 5957-5964 (2018).
  40. Joyal, J. S., et al. Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1. Nature Medicine. 22 (4), 439-445 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Измерение гликолизаскорость потребления кислородаскорость внеклеточного закисленияциркулярные вырезы сетчаткианализ Seahorseанализ митохондриального стрессаанализ скорости гликолизасетчатка ex vivo
Определение митохондриального дыхания и гликолиза в образцах ткани сетчатки ex vivo
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.