Здесь описан подробный протокол для проведения анализа митохондриального стресса и анализа скорости гликолитизма в образцах ткани сетчатки ex vivo с использованием коммерческого биоанализатора.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Определение митохондриального дыхания и гликолиза в образцах ткани сетчатки ex vivo
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Митохондриальное дыхание является критическим энергетическим путем во всех клетках, особенно в фоторецепторах сетчатки, которые обладают высокоактивным метаболизмом. Кроме того, фоторецепторы также демонстрируют высокий аэробный гликолиз, как раковые клетки. Точные измерения этих метаболических активностей могут дать ценную информацию о клеточном гомеостазе в физиологических условиях и в болезненных состояниях. Высокопроизводительные микропластинчатые анализы были разработаны для измерения митохондриального дыхания и различных метаболических активностей в живых клетках. Тем не менее, подавляющее большинство из них разработаны для культивируемых клеток и не были оптимизированы для интактных образцов тканей и для применения ex vivo. Здесь описан подробный пошаговый протокол, использующий технологию флуоресценции на основе микропластин, для непосредственного измерения скорости потребления кислорода (OCR) в качестве индикатора митохондриального дыхания, а также скорости внеклеточного подкисления (ECAR) в качестве индикатора гликолиза в неповрежденной ex vivo ткани сетчатки. Этот метод был использован для успешной оценки метаболической активности в сетчатке взрослой мыши и демонстрации его применения в исследовании клеточных механизмов старения и заболеваний.
Введение
Митохондрии являются важными органеллами, которые регулируют клеточный метаболизм, передачу сигналов, гомеостаз и апоптоз, координируя несколько важных физиологических процессов1. Митохондрии служат электростанцией в клетке для генерации аденозинтрифосфата (АТФ) путем окислительного фосфорилирования (OXPHOS) и обеспечивают энергию, которая поддерживает почти все клеточные события. Большая часть клеточного кислорода метаболизируется в митохондриях, где он служит конечным акцептором электронов в цепи переноса электронов (ETC) во время аэробного дыхания. Низкие количества АТФ также могут быть получены в результате гликолиза в цитозоле, где глюкоза....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все мышиные протоколы были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Национального института глаз (NEI ASP# 650). Мыши содержались в 12-часовых светло-темных условиях и ухаживали за ними, следуя рекомендациям Руководства по уходу и использованию лабораторных животных, Института ресурсов лабораторных животных и Политики службы общественного здравоохранения по гуманному уходу и использованию лабораторных животных.
1. Картридж датчика гидратации и подготовка пробирной среды
- За день до эксперимента добавьте 1 мл калибровочной среды в каждую лунку полезной пластины. Поместите крышку Hydro-Booster сверху и опустите кар....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Данные, представленные здесь, представляют собой репрезентативный анализ митохондриального стресса, показывающий след OCR (рисунок 1), и анализ гликолитической скорости, показывающий след OCR и след ECAR (рисунок 2), которые были выполнены с использованием недавно рассеченных 1 мм перфорационных дисков сетчатки 4-месячной детей с трансгенной Nrl-L-EGFP36 (фон C57B / L6). Эти мыши экспрессируют GFP конкретно в палочковых фоторецеп.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь приведены подробные инструкции по проведению микропластинчатых анализов активности митохондриального дыхания и гликолиза с использованием ex vivo, свежерассеченных перфораторных дисков сетчатки. Протокол был оптимизирован для: 1) обеспечения использования подходящей среды для анализа ткани сетчатки ex vivo; 2) использовать надлежащий размер перфорационных дисков сетчатки для получения показаний OCR и ECAR, которые попадают в оптимальный диапазон обнаружения машины; 3) покрытие сетчатых вставок для.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа поддерживается Программой очных исследований Национального института глаз (ZIAEY000450 и ZIAEY000546).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1X PBS | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| 2-дезоксиглюкоза (2-DG), 500 мМ стоковый раствор | Sigma | D6134 | Растворить в среде Seahorse XF DMEM, заранее приготовить |
| иглу 30 калибра | BD Precision Glide | 305106 | |
| антимицин А, 10 мМ стоковый раствор | Sigma | A8674 | Растворить в ДМСО, заранее приготовить |
| Bam15, 10 мМ сток раствор | TimTec | ST056388 | Растворите в ДМСО, подготовьте заранее |
| Биопсийный перфоратор, 1 мм | Integra Miltex | 33-31AA | |
| Cell-Tak | Corning Life Sciences | CB40240 | |
| камера для удушья CO2 Щипцы | |||
| рассечения-Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-10 | Stright tip |
| Dissection щипцы-Dumont #7 | Fine Science Tools | 11274-20 | Изогнутый наконечник |
| Диссекционный микроскоп | |||
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Щипцы Graefe | Fine Science Tools | 11051-10 | Изогнутый зубчатый наконечник |
| Микроножницы | Fine Science Tools | 15004-08 | Изогнутый наконечник |
| раствор NaOH, 1 M | Sigma-Aldrich | S8263 | Водный раствор, приготовить заранее |
| Ротенон, 10 мМ стоковый раствор | Sigma | R8875 | Растворить в ДМСО, заранее приготовить |
| калибровочную среду для морского конька | Agilent | 100840-000 | |
| Морской конек XF 1,0 М глюкоза | Agilent | 103577-100 | |
| Морской конек XF 100 мМ пируват | Agilent | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200 мМ глютамин | Agilent | 103579-100 | |
| Seahorse XF DMEM medium | Agilent | 103575-100 | pH 7,4, с 5 мМ HEPES |
| Seahorse XFe24 Островковый захват FluxPak | Agilent | 103518-100 | содержащий сенсорный картридж и микропланшет для захвата островков |
| Seahorse XFe24, экстра-клеточный анализатор потоков | Agilent | ||
| раствор бикарбоната натрия, 0,1 M | Sigma-Aldrich | S5761 | Водный раствор, приготовленный заранее |
| Супертонкая кисть для ресниц | Ted Pella | 113 |
Ссылки
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye Brain. 2, 99-116 (2010).
- Yu, D. Y., Cringle, S. J.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
