Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Обнаружение экспрессии рецепторов, связанных с G-белком, в афферентных нейронах вагусного нерва мыши с использованием мультиплексной гибридизации In Situ

3.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62945

⸱

20 сентября 2021 г.

 , 
1Center for Hypothalamic Research and Department of Internal Medicine, UTSouthwestern Medical Center at Dallas

В этой статье

Краткое содержание

Мультиплексная гибридизация in situ (ISH) использовалась для одновременной визуализации транскриптов для двух рецепторов, связанных с G-белком, и одного фактора транскрипции во всем вагусном ганглионном комплексе взрослой мыши. Этот протокол может быть использован для создания точных карт транскрипционных профилей вагусных афферентных нейронов.

Аннотация

В этом исследовании описывается протокол мультиплексной гибридизации in situ (ISH) яремно-узловатых ганглиев мышей с особым акцентом на обнаружение экспрессии рецепторов, связанных с G-белком (GPCR). Формалин-фиксированные яремно-узловатые ганглии обрабатывали с помощью технологии RNAscope для одновременного обнаружения экспрессии двух репрезентативных GPCR (холецистокининовых и грелиновых рецепторов) в сочетании с одним маркерным геном либо узелка (парно-подобный гомеобокс 2b, Phox2b), либо яремных афферентных нейронов (PR-домен цинкового белка пальца 12, Prdm12). Меченые ганглии были изображены с использованием конфокальной микроскопии для определения распределения и паттернов экспрессии вышеупомянутых транскриптов. Вкратце, было обнаружено, что афферентные нейроны Phox2b обильно экспрессируют рецептор холецистокинина (Cck1r), но не рецептор грелина (Ghsr). Было также обнаружено, что небольшое подмножество афферентных нейронов Prdm12 экспрессирует Ghsr и / или Cck1r. Обсуждаются потенциальные технические предостережения при проектировании, обработке и интерпретации мультиплексного ISH. Подход, описанный в этой статье, может помочь ученым в создании точных карт транскрипционных профилей вагусных афферентных нейронов.

Введение

Клеточные тела вагусных афферентов содержатся в яремных, петрозальных и узловыхганглиях 1,2,3. Их аксоны путешествуют вместе через несколько ветвей блуждающего нерва в краниоцервикальную, грудную и брюшную зоны4,5,6,7. Из своих висцеральных окончаний вагусные афференты могут реагировать на широкий спектр физиологических и вредных раздражителей8,9,10. Однако распределение сигнальных молекул и рецепторов, участвующих в вагусном зондировании, остается плохо охарактеризованным. Отчасти это связано с тем, что вагусные ганглии, несмотря на свои небольшие размеры, экспрессируют широкий спектр рецепторов, включая большое количество GPCR8,11,12,13. Кроме того, вагусные афферентные нейроны по своей природе неоднородны и имеют различные молекулярные профили14. Чтобы усложнить дело, яремные, петрозальные и узловые ганглии прикрепляются к мыши, образуя тем самым единую ганглионную массу. Наконец, у подмножества животных узелковый ганглий прикреплен к симпатическому верхнему шейному ганглию15.

В прошлом исследователи обращались к иммуногистохимии для изучения нейрохимического состава вагусных афферентных нейронов16,17,18. Хотя иммуногистохимия с использованием валидированных антител полезна, результаты иммуногистохимических исследований следует интерпретировать с осторожностью. Например, многочисленные усилия по выявлению специфических антител против GPCR потерпели неудачу19,20,21,22,23,24,25,что привело исследователей к выводу, что большинство антител против GPCR ненадежны. Чтобы обойти эти проблемы, количественная ПЦР (qPCR) широко используется для оценки экспрессии генов у ганглионной массы блуждающего блуждающего нерва26,27,28,29. Однако изучение экспрессии генов с помощью qPCR происходит за счет потери пространственной информации. В частности, невозможно предсказать, сколько клеток или какой тип (типы) клеток экспрессируют конкретный ген, представляющий интерес (например, узелковые или яремные клетки). Повторяющиеся проблемы также включают загрязнение соседними тканями и включение переменной длины блуждающего нерва, верхнего шейного отдела и яремных ганглиев во время рассечения15. В результате вышеуказанных трудностей споры окружают экспрессию и распределение нескольких GPCR в вагусных афферентных нейронах. Один особенно загадочный пример относится к рецептору грелина (Ghsr). В то время как некоторые исследования обнаружили широкую экспрессию этого рецептора в вагусных афферентных нейронах30,31,32,другие обнаружили, что мРНК Ghsr почти не обнаруживается в узловом ганглиях11,14. Поэтому детальное картирование мРНК Ghsr в ганглионной массе блуждающего нерва оправдано.

Гибридизация in situ (ISH) также использовалась для оценки паттернов экспрессии генов в вагусной ганглионной массе7,11,12,33,34,35. Поскольку методы на основе РНК остаются более надежными и специфичными, чем методы на основе антител в большинстве случаев36,37,исследования ISH оказались ценными для лучшего понимания нейрохимического кодирования вагусных афферентных нейронов. Тем не менее, традиционные техники ISH сами по себе не лишены предостережений. Радиоактивный ISH чувствителен, но генерирует фон и остается громоздким38. Нерадиоактивный ISH менее сложен, но именее чувствителен 38. Напротив, недавно разработанный метод RNAscope ISH является высокочувствительным и генерирует минимальный фон39. В текущем исследовании применялся мультиплексный флуоресцентный РНКАскоп для обнаружения GPCR в вагусных афферентных нейронах мыши. Мы сосредоточились на картировании распределения Ghsr и сравнили его распределение с распределением рецептора холецистокинина (Cck1r), другого GPCR, который, как известно, экспрессируется в узловом ганглии34. Наконец, два фактора транскрипции, пароподобный гомеобокс 2b (Phox2b) и PR-домен цинкового белка пальца 12 (Prdm12), были использованы в качестве селективных маркеров для узловых и яремных афферентных нейронов, соответственно14. Без визуализации Phox2b или Prdm12 было бы сложно с уверенностью идентифицировать яремные и узловатые афференты. Потенциальные технические подводные камни также обсуждаются на протяжении всей статьи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши, использованные в этом исследовании, были самцами дикого типа на чистом фоне C57BL/6J. В общей сложности 4 мыши были использованы для мультиплексного ISH. Всем мышам было примерно 8 недель на момент жертвоприношения. Один самец мыши (примерно годовалый) также использовался для демонстрации эндогенной флуоресценции, связанной со старением. Животные содержались в вентилируемых клетках в барьерном помещении с доступом ad libitum к пище и воде. Комитет по институциональному уходу и использованию животных Юго-Западного медицинского центра UT рассмотрел и одобрил процедуры, описанные ниже. Подробности о реагентах и инструментах можно найти в Таблице материалов.

1. Сбор образцов

  1. В день жертвоприношения вводят мышам передозировку хлоралгидрата (500 мг/кг, т.п.). Перфьюзируйте глубоко обезболенных мышей транскардиально с помощью перистальтического насоса с 5 мл 1x фосфат-буферного физиологического раствора (PBS), за которым следует 50 мл 10% формалина при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это делается в вытяжном капюшоне, чтобы предотвратить вдыхание формалина.
  2. По мере того, как узелковые, петрозальные и яремные ганглии сливаются в единую ганглионную массу у мыши15,тщательно соберите всю вагусную ганглионную массу с каждой стороны (слева и справа) с помощью рассекающего прицела и тонких пружинных ножниц и щипцов (см. Таблицу материалов).
  3. При обезглавливании мыши парой больших ножниц (см. Таблицу материалов)избегайте раздавливания ствола мозга.
  4. Следуя подходу к рассечению, описанному ранее в крысе40,удаляют грудиногиоидные и омогиоидные мышцы, расположенные сбоку от трахеи, с помощьюнебольших щипцов (Таблица материалов), чтобыобнажить затылочную кость. Очистите всю область мышц, жировую ткань и соединительную ткань до тех пор, пока не будут видны сонная артерия, блуждающий нерв, подъязычный нерв и большое отверстие. Перережьте весь подъязычный нерв маленькими пружинными ножницами(Таблица материалов).
  5. Ищите узелковый ганглий в виде полупрозрачной массы, близкой к отверстию magnum15. Используя небольшие ножницы(Таблица материалов),аккуратно разбейте затылочную кость, чтобы еще больше обнажить яремный ганглий. Ищите черные меланоциты на поверхности югулара в качестве визуального ориентира.
  6. Разрежьте нервные соединения между вагусной ганглионной массой и извлеките всю ганглионную массу, осторожно потянув за периферический конец блуждающего нерва, одновременно разрезая яремный ганглий к стволу мозга небольшими пружинными ножницами(Таблица материалов).
  7. Максимально удалите соединительную ткань и жир, прилипший к блуждающему нерву и ганглионную массу.
  8. Поскольку легко потерять один ганглий во время переноса из одной трубки в другую, держите ~ 0,5 см блуждающего нерва, чтобы облегчить обработку и локализацию образцов.
  9. Поместите ганглии с помощью мелкодисперсных щипцов в микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл и инкубируйте при 4 °C в формалине в течение 24 ч и с 30% сахарозой еще 24 ч.
  10. Расположите ганглии внутри небольшой капли (~4 мм Ø) среды оптимальной температуры резания (OCT) на куске алюминиевой фольги. Далее заморозьте образец на ложе сухого льда.
  11. Разрежьте образцы с помощью криостата при -20 °C на участки толщиной 14 мкм и соберите на стеклах микроскопа в виде 3 серий на расстоянии 42 мкм друг от друга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте размещения секций близко к краям слайда. Чтобы сохранить реагенты, держите участки тканей как можно плотнее упакованными, но без перекрытия.
  12. Храните образцы в морозильной камере при температуре -80 °C до тех пор, пока это не понадобится для ISH в течение не менее 6 месяцев.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к рисунку 1 для поиска и устранения неисправностей для эндогенной флуоресценции.

2. Предварительная обработка и ISH

  1. Перед днем экспериментов автоклавная лабораторная посуда будет использоваться для ISH, включая окрашивание посуды и мытье буферных банок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как работа в условиях, свободных от RNase, не является критичной, носите перчатки в любое время. Держите бутылки с раствором для обеззараживания РНКазы(Таблица материалов)в пределах досягаемости на случай подозрения на загрязнение.
  2. В первый день доведите горки до комнатной температуры на скамейке, специально посвященной ISH. Промойте горки в 1x PBS и выпекайте их в течение 30 минут при 60 °C в духовке длявыпечки (Таблица материалов).
  3. Постфиксируйте слайды в 4% формалине в течение 15 мин при 4 °C.
  4. Доведите реагенты в мультиплексном наборе(Таблица материалов)до комнатной температуры.
  5. Обезвоживайте слайды в 50%, 70% и 100% этаноле в течение 5 мин каждый. Применяют растворH2O2 к образцам в течение 10 мин, а затем смывают в двойной дистиллированной воде (ddH2O).
  6. Обработайте образцы целевым реагентом извлечения в течение 5 мин, промойте в ddH2Oс последующим 100% этанолом и высушите на воздухе. Используя гидрофобную ручку, создайте барьер вокруг образцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не наносите гидрофобный барьер слишком близко к участкам тканей.
  7. Применяют протеазу в течение 30 мин при 40 °C в гибридизационнойпечи (Таблица материалов).
  8. Тем временем перед использованием прогрейте зонды при температуре 40 °C и охладите их при комнатной температуре. Инкубируйте слайды с желаемой комбинацией целевых зондов (Cck1r-C3, Ghsr-C1, Phox2b-C2; или Cck1r-C3, Ghsr-C1, Prdm12-C2) в течение 2 ч при 40 °C в гибридизационной печи.
  9. Инкубировать отрицательную контрольную ткань с дигидродипиколинатредуктазой (DapB) мишенью C1 в течение 2 ч при 40 °C в гибридизационной печи.
  10. Промойте слайды в буфере для стирки и храните на ночь в 5x физиологическом растворе цитрата натрия (SSC) при комнатной температуре. Для удобства разделите эксперимент на два дня. На следующий день промойте слайды с помощью промывочного буфера и инкубируйте их с помощью реагентов для усиления, перечисленных ниже (см. руководство пользователя в Таблице материалов).
  11. Применяют AMP1 (30 мин при 40 °C), AMP2 (30 мин при 40 °C) и AMP 3 (15 мин при 40 °C). Смойте в буфере для стирки между каждым шагом.
  12. Растворите каждый опаловый краситель(Таблица материалов)в диметилсульфоксиде и храните растворы при 4 °C до тех пор, пока это не понадобится.
  13. Для канала 1 инкубируют слайды с HRP-C1 (15 мин при 40 °C) и Opal 520 (зеленый цвет; разведение 1/1 500; 30 минут при 40 °C). Смойте в буфере для стирки между каждым шагом.
  14. Для канала 2 инкубируют слайды с HRP-C2 (15 мин при 40 °C) и Opal 570 (желтый цвет; разведение 1/1 500; в течение 30 мин при 40 °C). Смойте в буфере для стирки между каждым шагом.
  15. Для канала 3 инкубируют слайды с HRP-C3 (15 мин при 40 °C) и Opal 690 (дальний красный цвет; разведение 1/1 500; в течение 30 мин при 40 °C). Смойте в буфере для стирки между каждым шагом.
  16. Вымойте горки и подвергайте их воздействию 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в течение 30 с.
  17. Сразу же нанесите монтажную среду на каждый слайд и поместите крышку на участок ткани.
  18. Держите ткани горизонтально в держателе слайда при температуре 4 °C до получения изображения.

3. Микроскопия и анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Мультиплексные данные ISH могут быть визуализированы с помощью широкого спектра инструментов с соответствующими фильтрами. Однако предпочтительным методом визуализации является конфокальная микроскопия с 20x и 63x (масляными) объективами; обратитесь к обсуждению по причинам. Обратитесь к рисунку 2 для определения оптимального отношения сигнал/шум.

  1. Используйте конфокальный микроскоп, оснащенный лазерными линиями 488, 561 и 633 нм. Используйте следующие параметры сбора (см. таблицу 1):Opal 690 (HeNe 633 нм, дальность обнаружения 668-696 нм, мощность 2.0, коэффициент усиления 724); Opal 570 (DPSS лазер 561 нм, дальность обнаружения 579-627 нм, мощность < 15,0,
  2. Чтобы улучшить качество изображений, приобретайте с усреднением линии 4 и размером пикселя не менее 1024 x 1024.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенные выше параметры приведены только в качестве примера, и рекомендуются модификации в зависимости от одного инструмента, увеличения (20x или 63x), уровней экспрессии и эндогенных уровней флуоресценции для любой данной ткани.
  3. Убедившись в параметрах получения, собирайте изображения, используя те же настройки. Приписывайте ложные цвета каждому каналу для облегчения визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, красный (Phox2b или Prdm12), голубой (Cck1r), желтый (Ghsr) и серый (DAPI).
  4. Выполняйте подсчет клеток с помощью цифровых изображений, идентифицируя контур РНКАскоп-положительных профилей с одним ядром, слегка окрашенным DAPI. Рассчитайте процент положительных профилей RNAscope, выражающих каждую расшифровку [Рисунок 3A-C].
  5. Чтобы повысить строгость и точность оценок, подсчитайте не менее 2000 профилей нейронов по крайней мере от 4 различных животных. Выполняйте подсчет с левого и правого ганглиями отдельно.
  6. Введите данные в круговую диаграмму с общим количеством подсчитанных профилей.
  7. Используйте программное обеспечение для обработки изображений для получения изображений и сшивания 20-кратных изображений. Используйте ImageJ-Fiji и другое программное обеспечение для фото и дизайна для создания конечных пластин. Применяйте корректировки контраста и легкости равномерно ко всем изображениям.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В то время как RNAScope может применяться к животным любого возраста, пола или генетического фона, рекомендуется работать с молодыми людьми (<3 месяца). Это связано с тем, что флуоресцентные артефакты (например, липофусцин) являются общими находками в нейронах пожилых животных41. Формалин-фиксированные ганглии у старых мышей часто содержат удивительно интенсивную эндогенную флуоресценцию, которую можно легко принять за подлинное окрашивание(рисунок 1A,B).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Техника ISH была изобретена в конце 1960-х годов42года. Однако только в середине 1980-х годов он был применен для обнаружения мРНК в центральной и периферической нервной системах43,44. Учитывая неоднородность нервной системы и повторяющиеся проблемы с антителами, локализация того или иного транскрипта на клеточном уровне остается бесценным инструментом. Тем не менее, традиционные методы ISH остаются трудоемкими и переменно чувствительными....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Neuroanatomy/Histology/Brain Injection Core, финансируемой грантом NIH #5P01DK119130-02. Авторы хотели бы отметить помощь Юго-западного центра визуализации живых клеток UT (возглавляемого доктором Фелпсом) и его сотрудников (Абхиджит Бугде и Марсель Меттлен), частично поддерживаемых грантом NIH Grant #1S10OD021684-01, общим ресурсом Онкологического центра Гарольда С. Симмонса, частично поддерживаемым грантом поддержки онкологического центра NCI, P30 CA142543.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10xPBS Fisher ScientificBP399-4
20x SSCInvitrogenAM9763-80
° Морозильная камера CPHCBIMDF-DU901VHA-PA
Adobe Photoshop 2021Adobe программное обеспечение для фото и дизайна
Печь для выпечкиThermo ScientificМодель: 658
Конфокальный микроскопZeissLSM880 Airyscan
Cover GlassЛаборатории исследования мозга2460-1.5D
CryostatLeicaCM 3050 S Dumont
#5 ЩипцыF.S.T.11252-20
EcomountBiocare MedicalEM 897Lмонтажная среда
HybEZ печьдля гибридизации
Гидрофобная ручкаVector LaboratoriesH-4000
ImageJ-FijiNIH
Большие ножницыHenry Schein100-7561
Микроцентрифужные пробиркиVWR20170-333
Мининасос с переменным расходомFisher Scientific13-876-1
Опал 520Akoya biosciencesFP1 1487001KTФлуоресцентный биомаркер
Opal 570Akoya biosciencesFP1 1488001KTФлуоресцентный биомаркер
Opal 690Akoya biosciencesFP1 1497001KTФлуоресцентный биомаркер
ProLong Gold Antifade MountantМонтажная среда для флуоресцентно меченых клеток
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2ACD /Bio-Techne323100мультиплексный набор РНКоскоп
зонд Mouse Cck1r-C3ACD /Bio-Techne313751-C3
РНКоскоп зонд Mouse DapBACD /Bio-Techne310043
РНКскоп зонд Mouse GhsrACD /Bio-Techne
Зонд РНК Мышь Phox2b-C2ACD /Bio-Techne407861-C2
Зонд РНКоскопа Мышь Prdm12-C2ACD /Bio-Techne524371-C2
RnaseZapSigmaR2020Обеззараживающий раствор Rnase
Малые ножницы для препарированияСлайды
Superfrost PlusFisherbrand1255015
Tissue Tek OCT mediumSakura4583
Руководство пользователяACD323100 USM
Весенние ножницыVannas RobozRS 5620
ZEN Программное обеспечение для визуализацииZeiss
426141 Millipore Sigma Z265977

Ссылки

  1. Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience. 85 (1-3), 1-17 (2000).
  2. Kim, S. H., et al. Mapping of sensory nerve subsets within the vagal ganglia and the brainstem using reporter mice for Pirt, TRPV1, 5-HT3, and Tac1 expression. eNeuro. 7 (2), (2020).
  3. Atsumi, K., et al. Sensory neurons in the human jugular ganglion. Tissue and Cell. 64, 101344(2020).
  4. Mazzone, S. B., Undem, B. J. Vagal afferent innervation of the airways in health and disease. Physiological Reviews. 96 (3), 975-1024 (2016).
  5. Wang, F. B., Powley, T. L. Topographic inventories of vagal afferents in gastrointestinal muscle. Journal of Comparative Neurology. 421 (3), 302-324 (2000).
  6. Prechtl, J. C., Powley, T. L. The fiber composition of the abdominal vagus of the rat. Anatomy and Embryology. 181 (2), 101-115 (1990).
  7. Gautron, L., et al. Melanocortin-4 receptor expression in a vago-vagal circuitry involved in postprandial functions. Journal of Comparative Neurology. 518 (1), 6-24 (2010).
  8. Williams, E. K., et al. Sensory neurons that detect stretch and nutrients in the digestive system. Cell. 166 (1), 209-221 (2016).
  9. Chuaychoo, B., Hunter, D. D., Myers, A. C., Kollarik, M., Undem, B. J. Allergen-induced substance P synthesis in large-diameter sensory neurons innervating the lungs. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 116 (2), 325-331 (2005).
  10. Page, A. J., O'Donnell, T. A., Blackshaw, L. A. Opioid modulation of ferret vagal afferent mechanosensitivity. American Journal of Physiology and Gastrointestinal Liver Physiology. 294 (4), 963-970 (2008).
  11. Egerod, K. L., et al. Profiling of G protein-coupled receptors in vagal afferents reveals novel gut-to-brain sensing mechanisms. Molecular Metabolism. 12, 62-75 (2018).
  12. Wang, J., et al. Distinct and common expression of receptors for inflammatory mediators in vagal nodose versus jugular capsaicin-sensitive/TRPV1-positive neurons detected by low input RNA sequencing. PLoS One. 12 (10), 0185985(2017).
  13. Bai, L., et al. Genetic identification of vagal sensory neurons that control feeding. Cell. 179 (5), 1129-1143 (2019).
  14. Kupari, J., Haring, M., Agirre, E., Castelo-Branco, G., Ernfors, P. An atlas of vagal sensory neurons and their molecular specialization. Cell Reports. 27 (8), 2508-2523 (2019).
  15. Bookout, A. L., Gautron, L. Characterization of a cell bridge variant connecting the nodose and superior cervical ganglia in the mouse: Prevalence, anatomical features, and practical implications. Journal of Comparative Neurology. 529 (1), 111-128 (2021).
  16. Gautron, L., Lee, C. E., Lee, S., Elmquist, J. K. Melanocortin-4 receptor expression in different classes of spinal and vagal primary afferent neurons in the mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (17), 3933-3948 (2012).
  17. Broberger, C., Holmberg, K., Kuhar, M. J., Hokfelt, T. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript in the rat vagus nerve: A putative mediator of cholecystokinin-induced satiety. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (23), 13506-13511 (1999).
  18. Yamamoto, Y., Henrich, M., Snipes, R. L., Kummer, W. Altered production of nitric oxide and reactive oxygen species in rat nodose ganglion neurons during acute hypoxia. Brain Research. 961 (1), 1-9 (2003).
  19. Grimsey, N. L., et al. Specific detection of CB1 receptors; cannabinoid CB1 receptor antibodies are not all created equal. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 78-86 (2008).
  20. Morozov, Y. M., et al. Antibodies to cannabinoid type 1 receptor co-react with stomatin-like protein 2 in mouse brain mitochondria. European Journal of Neuroscience. 38 (3), 2341-2348 (2013).
  21. Jelsing, J., Larsen, P. J., Vrang, N. Identification of cannabinoid type 1 receptor expressing cocaine amphetamine-regulated transcript neurons in the rat hypothalamus and brainstem using in situ hybridization and immunohistochemistry. Neuroscience. 154 (2), 641-652 (2008).
  22. Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
  23. Hamdani, N., vander Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 403-407 (2009).
  24. Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 385-388 (2009).
  25. Goodman, S. L. The antibody horror show: an introductory guide for the perplexed. Nature Biotechnology. 45, 9-13 (2018).
  26. Liu, C., et al. PPARgamma in vagal neurons regulates high-fat diet induced thermogenesis. Cell Metabolism. 19 (4), 722-730 (2014).
  27. Zeeni, N., et al. A positive change in energy balance modulates TrkB expression in the hypothalamus and nodose ganglia of rats. Brain Research. 1289, 49-55 (2009).
  28. Kentish, S. J., Frisby, C. L., Kennaway, D. J., Wittert, G. A., Page, A. J. Circadian variation in gastric vagal afferent mechanosensitivity. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19238-19242 (2013).
  29. Peiser, C., et al. Dopamine D2 receptor mRNA expression is increased in the jugular-nodose ganglia of rats with nitrogen dioxide-induced chronic bronchitis. Neuroscience Letters. 465 (2), 143-146 (2009).
  30. Date, Y., et al. The role of the gastric afferent vagal nerve in ghrelin-induced feeding and growth hormone secretion in rats. Gastroenterology. 123 (4), 1120-1128 (2002).
  31. Meleine, M., et al. Ghrelin inhibits autonomic response to gastric distension in rats by acting on vagal pathway. Scientific Reports. 10 (1), 9986(2020).
  32. Zhang, W., et al. Functional interaction between Ghrelin and GLP-1 regulates feeding through the vagal afferent system. Scientific Reports. 10 (1), 18415(2020).
  33. Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal sensory neuron subtypes that differentially control breathing. Cell. 161 (3), 622-633 (2015).
  34. Broberger, C., Holmberg, K., Shi, T. J., Dockray, G., Hokfelt, T. Expression and regulation of cholecystokinin and cholecystokinin receptors in rat nodose and dorsal root ganglia. Brain Research. 903 (1-2), 128-140 (2001).
  35. Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Research. 1319, 60-69 (2010).
  36. Hankin, R. C. In situ hybridization: principles and applications. Laboratory Medicine. 23, 764-770 (1992).
  37. Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
  38. Dagerlind, A., Friberg, K., Bean, A. J., Hokfelt, T. Sensitive mRNA detection using unfixed tissue: combined radioactive and non-radioactive in situ hybridization histochemistry. Histochemistry. 98 (1), 39-49 (1992).
  39. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostic. 14 (1), 22-29 (2012).
  40. Norgren, R., Smith, G. P. A method for selective section of vagal afferent or efferent axons in the rat. American Journal of Physiology. 267 (4), Pt 2 1136-1141 (1994).
  41. Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 719-730 (1999).
  42. Pardue, M. L., Gall, J. G. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 64 (2), 600-604 (1969).
  43. Villar, M. J., et al. Upregulation of nitric oxide synthase and galanin message-associated peptide in hypothalamic magnocellular neurons after hypophysectomy. Immunohistochemical and in situ hybridization studies. Brain Research. 650 (2), 219-228 (1994).
  44. McAllister, L. B., Scheller, R. H., Kandel, E. R., Axel, R. In situ hybridization to study the origin and fate of identified neurons. Science. 222 (4625), 800-808 (1983).
  45. Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. 8 (55), 93392-93403 (2017).
  46. Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
  47. D'Autreaux, F., Coppola, E., Hirsch, M. R., Birchmeier, C., Brunet, J. F. Homeoprotein Phox2b commands a somatic-to-visceral switch in cranial sensory pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20018-20023 (2011).
  48. Staib-Lasarzik, I., et al. Anesthesia for euthanasia influences mRNA expression in healthy mice and after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (19), 1664-1671 (2014).
  49. Avau, B., et al. Ghrelin is involved in the paracrine communication between neurons and glial cells. Neurogastroenterology and Motility. 25 (9), 599-608 (2013).
  50. Settell, M. L., et al. Functional vagotopy in the cervical vagus nerve of the domestic pig: implications for the study of vagus nerve stimulation. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026022(2020).
  51. Nyborg, N. C. B., et al. Cholecystokinin-1 receptor agonist induced pathological findings in the exocrine pancreas of non-human primates. Toxicology and Applied Pharmacology. 399, 115035(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Gin situRNAscopePhox2b
Обнаружение экспрессии рецепторов, связанных с G-белком, в афферентных нейронах вагусного нерва мыши с использованием мультиплексной гибридизации In Situ
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.