Мультиплексная гибридизация in situ (ISH) использовалась для одновременной визуализации транскриптов для двух рецепторов, связанных с G-белком, и одного фактора транскрипции во всем вагусном ганглионном комплексе взрослой мыши. Этот протокол может быть использован для создания точных карт транскрипционных профилей вагусных афферентных нейронов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Обнаружение экспрессии рецепторов, связанных с G-белком, в афферентных нейронах вагусного нерва мыши с использованием мультиплексной гибридизации In Situ
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В этом исследовании описывается протокол мультиплексной гибридизации in situ (ISH) яремно-узловатых ганглиев мышей с особым акцентом на обнаружение экспрессии рецепторов, связанных с G-белком (GPCR). Формалин-фиксированные яремно-узловатые ганглии обрабатывали с помощью технологии RNAscope для одновременного обнаружения экспрессии двух репрезентативных GPCR (холецистокининовых и грелиновых рецепторов) в сочетании с одним маркерным геном либо узелка (парно-подобный гомеобокс 2b, Phox2b), либо яремных афферентных нейронов (PR-домен цинкового белка пальца 12, Prdm12). Меченые ганглии были изображены с использованием конфокальной микроскопии для определения распределения и паттернов экспрессии вышеупомянутых транскриптов. Вкратце, было обнаружено, что афферентные нейроны Phox2b обильно экспрессируют рецептор холецистокинина (Cck1r), но не рецептор грелина (Ghsr). Было также обнаружено, что небольшое подмножество афферентных нейронов Prdm12 экспрессирует Ghsr и / или Cck1r. Обсуждаются потенциальные технические предостережения при проектировании, обработке и интерпретации мультиплексного ISH. Подход, описанный в этой статье, может помочь ученым в создании точных карт транскрипционных профилей вагусных афферентных нейронов.
Введение
Клеточные тела вагусных афферентов содержатся в яремных, петрозальных и узловыхганглиях 1,2,3. Их аксоны путешествуют вместе через несколько ветвей блуждающего нерва в краниоцервикальную, грудную и брюшную зоны4,5,6,7. Из своих висцеральных окончаний вагусные афференты могут реагировать на широкий спектр физиологических и вредных раздражителей8,9,10.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши, использованные в этом исследовании, были самцами дикого типа на чистом фоне C57BL/6J. В общей сложности 4 мыши были использованы для мультиплексного ISH. Всем мышам было примерно 8 недель на момент жертвоприношения. Один самец мыши (примерно годовалый) также использовался для демонстрации эндогенной флуоресценции, связанной со старением. Животные содержались в вентилируемых клетках в барьерном помещении с доступом ad libitum к пище и воде. Комитет по институциональному уходу и использованию животных Юго-Западного медицинского центра UT рассмотрел и одобрил процедуры, описанные ниже. Подробности о реагентах и инструментах можно найти в
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В то время как RNAScope может применяться к животным любого возраста, пола или генетического фона, рекомендуется работать с молодыми людьми (<3 месяца). Это связано с тем, что флуоресцентные артефакты (например, липофусцин) являются общими находками в нейронах пожилых животных41. Формалин-фиксированные ганглии у старых мышей часто содержат удивительно интенсивную эндогенную флуоресценцию, которую можно легко принять за подлинное окрашивание(рисунок 1A,B).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Техника ISH была изобретена в конце 1960-х годов42года. Однако только в середине 1980-х годов он был применен для обнаружения мРНК в центральной и периферической нервной системах43,44. Учитывая неоднородность нервной системы и повторяющиеся проблемы с антителами, локализация того или иного транскрипта на клеточном уровне остается бесценным инструментом. Тем не менее, традиционные методы ISH остаются трудоемкими и переменно чувствительными........
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана Neuroanatomy/Histology/Brain Injection Core, финансируемой грантом NIH #5P01DK119130-02. Авторы хотели бы отметить помощь Юго-западного центра визуализации живых клеток UT (возглавляемого доктором Фелпсом) и его сотрудников (Абхиджит Бугде и Марсель Меттлен), частично поддерживаемых грантом NIH Grant #1S10OD021684-01, общим ресурсом Онкологического центра Гарольда С. Симмонса, частично поддерживаемым грантом поддержки онкологического центра NCI, P30 CA142543.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 10x | PBS Fisher Scientific | BP399-4 | |
| 20x SSC | Invitrogen | AM9763-80 | |
| ° Морозильная камера C | PHCBI | MDF-DU901VHA-PA | |
| Adobe Photoshop 2021 | Adobe программное обеспечение для фото и дизайна | ||
| Печь для выпечки | Thermo Scientific | Модель: 658 | |
| Конфокальный микроскоп | Zeiss | LSM880 Airyscan | |
| Cover Glass | Лаборатории исследования мозга | 2460-1.5D | |
| Cryostat | Leica | CM 3050 S Dumont | |
| #5 Щипцы | F.S.T. | 11252-20 | |
| Ecomount | Biocare Medical | EM 897L | монтажная среда |
| HybEZ печь | для гибридизации | ||
| Гидрофобная ручка | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ImageJ-Fiji | NIH | ||
| Большие ножницы | Henry Schein | 100-7561 | |
| Микроцентрифужные пробирки | VWR | 20170-333 | |
| Мининасос с переменным расходом | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
| Опал 520 | Akoya biosciences | FP1 1487001KT | Флуоресцентный биомаркер |
| Opal 570 | Akoya biosciences | FP1 1488001KT | Флуоресцентный биомаркер |
| Opal 690 | Akoya biosciences | FP1 1497001KT | Флуоресцентный биомаркер |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Монтажная среда для флуоресцентно меченых клеток | ||
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | ACD /Bio-Techne | 323100 | мультиплексный набор РНКоскоп |
| зонд Mouse Cck1r-C3 | ACD /Bio-Techne | 313751-C3 | |
| РНКоскоп зонд Mouse DapB | ACD /Bio-Techne | 310043 | |
| РНКскоп зонд Mouse Ghsr | ACD /Bio-Techne | ||
| Зонд РНК Мышь Phox2b-C2 | ACD /Bio-Techne | 407861-C2 | |
| Зонд РНКоскопа Мышь Prdm12-C2 | ACD /Bio-Techne | 524371-C2 | |
| RnaseZap | Sigma | R2020 | Обеззараживающий раствор Rnase |
| Малые ножницы для препарирования | Слайды | ||
| Superfrost Plus | Fisherbrand | 1255015 | |
| Tissue Tek OCT medium | Sakura | 4583 | |
| Руководство пользователя | ACD | 323100 USM | |
| Весенние ножницы | Vannas Roboz | RS 5620 | |
| ZEN Программное обеспечение для визуализации | Zeiss |
Ссылки
- Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience. 85 (1-3), 1-17 (2000).
- Kim, S. H., et al. Mapping of sensory nerve subsets withi....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
