Использование фагового дисплея для разработки модуляторов вариантов убиквитина для лигазов E3

Summary

Убиквитинация является критической посттрансляционной модификацией белка, дисрегуляция которой была вовлечена в многочисленные заболевания человека. Этот протокол подробно описывает, как фаговый дисплей может быть использован для выделения новых вариантов убиквитина, которые могут связывать и модулировать активность лигазов E3, которые контролируют специфичность, эффективность и паттерны убиквитинирования.

Abstract

Убиквитин представляет собой небольшой белок 8,6 кДа, который является основным компонентом системы убиквитин-протеасома. Следовательно, он может связываться с разнообразным массивом белков с высокой специфичностью, но низкой аффинностью. С помощью фагового дисплея варианты убиквитина (UbV) могут быть спроектированы таким образом, что они демонстрируют улучшенное сродство к убиквитину дикого типа и сохраняют специфичность связывания с целевыми белками. Фаговый дисплей использует библиотеку фагемидов, в соответствии с которой белок оболочки pIII нитевидного бактериофага M13 (выбранный потому, что он отображается снаружи на поверхности фага) сливается с UbVs. Специфические остатки убиквитина дикого типа человека мягкие и рандомизированные (т.е. существует уклон в сторону нативной последовательности диких типов) для генерации UbV, чтобы избежать вредных изменений в конформации белка при одновременном введении разнообразия, необходимого для содействия новым взаимодействиям с целевым белком. Во время процесса отображения фагов эти UbV экспрессируются и отображаются на белках фаговой оболочки и сравниваются с интересующим белком. UbV, которые демонстрируют благоприятные связывающие взаимодействия с целевым белком, сохраняются, в то время как плохие связующие смываются и удаляются из библиотечного пула. Сохраненные UbV, которые присоединены к фаговой частице, содержащей соответствующий фагемид UbV, элюируют, усиливают и концентрируют таким образом, чтобы их можно было панорамировать против того же целевого белка в другом раунде фагового дисплея. Как правило, выполняется до пяти раундов отображения фагов, во время которых сильное давление отбора накладывается на UbV, которые связываются слабо и / или беспорядочно, так что те, у кого более высокое сродство, концентрируются и обогащаются. В конечном счете, UbV, которые демонстрируют более высокую специфичность и /или сродство к целевому белку, чем их аналоги дикого типа, выделяются и могут быть охарактеризованы с помощью дальнейших экспериментов.

Introduction

Понимание молекулярных деталей белково-белковых взаимодействий имеет решающее значение для определения механизмов сигнальной трансдукции биологических процессов, особенно тех, которые способствуют клинически важным заболеваниям. В последние годы фаговой дисплей использовался в качестве практичного и доступного метода выделения белков/пептидов с значительно улучшенным связыванием с желаемым целевым ^{белком1,2,3,4}, который, в свою очередь, может быть использован в качестве внутриклеточных зондов белково-белковых взаимодействий.

Убиквитинирование представляет собой каскад ферментативной активности (активирующий фермент E1 → конъюгирующий фермент E2 → лигазы E3), которые ковалентно конъюгируют убиквитин (Ub) с белковыми субстратами, чтобы нацелить их на деградацию или опосредовать изменения клеточной сигнализации. Кроме того, деубиквитиназы катализируют удаление убиквитина из белков. Таким образом, в клетках существуют тысячи Ub-зависимых белково-белковых взаимодействий, подавляющее большинство из которых распознают общую поверхность с низким сродством, но высокой специфичностью, чтобы обеспечить слабые взаимодействия через большие и разнообразные поверхности.

Ernst et al. ввели мутации в известные области связывания Ub, чтобы увидеть, могут ли они повысить сродство связывания с интересующим белком, сохраняя при этом высокую селективность5. Была разработана комбинаторная библиотека из более чем 10 миллиардов (7,5 x ¹⁰¹⁰) вариантов Ub (UbV) с мутациями в положениях по всей поверхности Ub, которые опосредуют известные взаимодействия Ub-белка. Эта библиотека состояла из фагемидов, которые экспрессируют белок оболочки бактериофага PIII M13, слитый с диверсифицированными UbV. Таким образом, отдельные UbV могут отображаться на поверхности фага через белок оболочки при экспрессии. Во время процесса селекции фаг, который отображает UbV со значительными связывающими взаимодействиями с целевым белком, будет сохранен и обогащен в последующих раундах отображения фагов, тогда как фаг, отображающий UbV, которые плохо связываются с целевым белком, смывается и удаляется из фагового пула. Сохраненные фаговые частицы содержат фагемид, соответствующий их отображаемому UbV, что позволяет секвенировать их и дополнительно характеризовать после выделения.

Используя эту стратегию белковой инженерии, ингибиторы UbV были разработаны для человеческих деубиквитиназ5 и вирусных протеаз6. Важно отметить, что мы создали ингибирующие UbV для человеческих лигазов E3 семейства HECT путем захвата сайта связывания E2 и активации UbV, которые занимают Ub-связывающий экзозит на домене ^HECT7. Мы также можем ингибировать мономерные RING-семейства E3s, нацеливаясь на сайт связывания E2 и индуцируя димеризацию UbV для активации гомодимерного RING ^E3s8. Для многосубъединичных RING E3s UbV могут достигать ингибирования путем нацеливания на субъединицу RING (например, для комплекса APC/^C9) или нарушения образования комплекса (например, для SCF ^E3s10). В совокупности UbV могут быть использованы для систематического опроса белково-белковых взаимодействий в системе Ub-протеасом (UPS), чтобы мы могли лучше расшифровать биохимические механизмы ферментов UPS, а также идентифицировать и проверить функциональные сайты для терапевтического вмешательства.

Следующий протокол описывает, как использовать ранее сгенерированную фаговую отображаемую библиотеку UbV для нацеливания на интересующий белок и как обогатить связующие вещества UbV, которые взаимодействуют с целевым белком посредством последовательных раундов отображения фагов.

Protocol

1. Подготовка реагентов

1. PBS (фосфатно-буферный физиологический раствор): Смешайте 50 мл 10-кратного раствора PBS с 450 мл сверхчистого _H2O. Стерилизуйте фильтрацией и храните при 4 °C или комнатной температуре (~20-25 °C).
2. 10% BSA (бычий сывороточный альбумин): Медленно добавляйте 1 г BSA к 7 мл сверхчистого _H2O и перемешивайте до полного растворения (без сгустков). Доливайте ультрачистым _H2O до окончательного объема 10 мл. Стерилизуют путем фильтрации и хранят при температуре 4 °C.
3. Буфер PB (PBS, дополненный 1% BSA): Медленно добавляйте 5 г BSA к 400 мл сверхчистого _H2O и 50 мл PBS и перемешивайте до полного растворения (без сгустков). Доливайте ультрачистым _H2O до окончательного объема 500 мл. Стерилизуют путем фильтрации и хранят при температуре 4 °C.
4. Буфер PBT (PBS, дополненный 1% BSA и 0,05% Tween 20): Медленно добавьте 5 г BSA к 400 мл сверхчистого _H2O и 50 мл PBS и перемешайте до полного растворения (без сгустков). Добавьте 250 мкл Tween 20. Доливайте ультрачистым _H2O до окончательного объема 500 мл. Стерилизуют путем фильтрации и хранят при температуре 4 °C.
5. БУФЕР PT (PBS с добавлением 0,05% Tween 20): Смешайте 1 мл Tween 20 с 400 мл PBS. Долить ультрачистым _H2O до конечного объема 2 л. Стерилизовать фильтрацией и хранить при температуре 4 °C или комнатной температуре (~20-25 °C).
6. 2YT бульон: Добавьте 16 г триптона, 10 г дрожжевого экстракта и 5 г NaCl до 800 мл ультрачистого _H2O и перемешайте до полного растворения (без комков). Доливать ультрачистым _H2O до конечного объема 1 л. Стерилизовать автоклавом и хранить при комнатной температуре (~20-25 °C).
7. Пластины LB/carb: Добавьте 12,5 г готовой смеси LB и 7,5 г агара до 400 мл _H2O. Добавьте ультрачистый _H2O до конечного объема 500 мл и стерилизуйте автоклавированием. Убедитесь, что агар полностью растворен, и подождите, пока он остынет до температуры ниже 60 °C. Добавьте 500 мкл 100 мг мг карбенициллина, хорошо перемешайте и разлейте в тарелку. Хранить при температуре 4 °C.
8. Пластины LB/tet: Добавьте 12,5 г готовой смеси LB и 7,5 г агара в 400 мл сверхчистого _H2O. Добавьте ультрачистой _H2O до конечного объема 500 мл и стерилизуйте автоклавированием. Убедитесь, что агар полностью растворен, и подождите, пока он остынет до температуры ниже 60 °C. Добавьте 500 мкл 10 мг мл тетрациклина, хорошо перемешайте и вылейте в тарелку. Хранить при температуре 4 °C.
9. 20% ПЭГ (полиэтиленгликоль)/2,5 М NaCl: Добавьте 50 г ПЭГ-8000 и 36,5 г NaCl к 200 мл сверхчистого _H2O. Смешайте до полного растворения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это может занять некоторое время; отопление может помочь. Доливайте ультрачистым _H2O до окончательного объема 250 мл. Стерилизуют путем фильтрации или автоклавирования.
10. 0,1 M HCl: Смешайте 20 мл 1 M HCl со 180 мл сверхчистого _H2O. Стерилизуйте фильтрацией и храните при комнатной температуре (~20-25 °C).
11. 1 M Tris (pH 11,0): Добавьте 6,1 г основы Tris к 40 мл сверхчистого _H2O. Отрегулируйте pH до 11,0 с HCl и перемешайте до полного растворения Tris. Доливайте ультрачистым _H2O до окончательного объема 50 мл. Стерилизовать фильтрацией и хранить при комнатной температуре (~20-25 °C).
12. 100 мг/мл (1000x) карбенициллина: Добавьте 2 г соли динатрия карбенициллина к 20 мл сверхчистого _H2O. Перемешайте до полного растворения. Стерилизуют фильтрацией и хранят при -20 °C.
13. 50 мг/мл (1000x) канамицина: Добавьте 1 г канамицина сульфата к 20 мл сверхчистого _H2O. Перемешайте до полного растворения. Стерилизуют фильтрацией и хранят при -20 °C.
14. 10 мг/мл (1000x) тетрациклина: Добавьте 0,2 г тетрациклина гидрохлорида к 20 мл 70% этанола. Перемешать до полного растворения. Стерилизуют фильтрацией и хранят при -20 °C.

2. Белковый препарат

1. Определяют концентрацию целевого запаса белка в мкМ. Наиболее удобным способом оценки концентрации белка является измерение абсорбции белкового запаса при 280 нм. Если концентрация известна в мг/мл, преобразуйте ее в мкМ, используя молекулярную массу белка-мишени. В зависимости от интересующего белка может быть использован ряд методов; подробности см. в разделе Обсуждение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если белок усечен (специфический белковый домен/мотив) или помечен, не забудьте учесть эти изменения молекулярной массы при преобразовании из мг/мл в мкМ.
2. Подготовьте три микроцентрифужные трубки с надписями «круглый 1», «круглый 2/3» и «круглый 4/5».
   1. Рассчитайте объем белка, необходимый для разбавления его до 1 мкМ в 800 мкл PBS и аликвотировать этот объем в пробирки без добавления PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если количество доступного целевого белка низкое, концентрация может быть снижена до 0,25 мкМ.

3. Подготовка к первому раунду отбора

1. Подготовьте посевную культуру для культивирования фагового ввода для второго раунда селекции.
   1. Инокулируют 5 мл 2YT/tet хорошо изолированной колонией Escherichia coli и инкубируют ночью при 37 °C с орбитальным сотрясением 200 об/мин.
2. Нанесите покрытие на тарелку для первого раунда отбора.
   1. Разбавьте целевой белок в «круглой 1» трубке с соответствующим количеством PBS и аликвотой 100 мкл в восемь лунок 96-луночной связующей пластины (т.е. целевой пластины).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фаговой дисплей может быть выполнен для четырех различных белков одновременно на одной пластине путем покрытия колодцев в углах пластины.
   2. Необязательный контроль: Если целевой белок помечен, например, GST или MBP (мальтозосвязывающий белок), покройте восемь лунок в другой 96-луночной связывающей пластине 100 мкл раствора 1 мкМ, содержащего соответствующую эпитопную метку. Это будет использоваться для удаления нежелательных фагов, которые связываются с тегом неспецифично.
   3. Встряхните пластину (пластины) в течение ночи при 4 °C с орбитальным встряхиванием 200 об/мин.

4. Первый раунд отбора

1. Подготовьте вход второго раунда.
   1. Инокулируют 30 мл 2YT/tet 200 мкл семенной культуры со стадии 3.1.
   2. Инкубировать при 37 °C с орбитальным встряхиванием 200 об/мин до тех пор, пока бактерии не окажутся в средней фазе (_OD600 0,6 - 0,8). Это занимает примерно три часа.
2. Блок целевой пластины.
   1. Снимите раствор покрытия с пластины или с обеих пластин, если была изготовлена контрольная пластина, путем инвертирования и встряхивания раковины. Вытрите насухо на бумажных полотенцах.
   2. Добавьте 300 мкл буфера ПБ к каждому покрытому колодцу.
   3. Удалите буфер PB, как показано на шаге 4.2.1, и добавьте еще 200 мкл буфера PB.
   4. Инкубировать при комнатной температуре (~20-25 °C) в течение 1 ч с орбитальным встряхиванием 300 об/мин.
3. Подготовьте фаговую библиотеку.
   1. Разморозьте библиотеку фагов на льду и разбавьте ее в 100 раз больше библиотечного разнообразия в PBS. Например, если разнообразие библиотек составляет 1 x ¹⁰¹⁰ , а концентрация библиотеки 1 x ¹⁰¹³, разбавьте библиотеку так, чтобы концентрация составляла 1 x ¹⁰¹². Для библиотек, используемых здесь, разбавьте их в 10 раз в PBS, объединив 1 мл библиотеки с 9 мл PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Библиотечное разнообразие должно было быть определено во время создания библиотеки и не может быть легко оценено иначе. Концентрацию библиотеки можно определить путем инокуляции клеток кишечной палочки в средней фазе (_OD600 0,6 - 0,8) и нанесения покрытия на LB/carb.
   2. Добавить 1/5 объема ПЭГ/NaCl. Например, для 10 мл ранее разбавленной библиотеки добавьте 2 мл PEG/NaCl.
   3. Инкубировать на льду в течение 30 мин.
   4. Центрифуга при 11 000 х г в течение 30 мин при 4 °C, отбросьте супернатант и недавняя рифмуга в течение 2 мин, чтобы вытащить оставшийся супернатант.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите трубку в ротор в ту же ориентацию во второй раз, что и в первый раз, чтобы держать гранулу в том же месте, чтобы сделать ее более заметной.
   5. Осторожно повторно суспендировать гранулу фага в 1 мл ПБТ на белок. Для четырех белков повторно суспендируют гранулу в 4 мл ПБТ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь не трогать гранулы и не вводите пузырьки воздуха.
4. Покажите фаг целевому белку (белкам).
   1. Дополнительное управление: Добавьте 100 мкл библиотеки фагов в каждый хорошо покрытый на контрольной пластине. Инкубируют при комнатной температуре (~20-25 °C) в течение 1 ч с орбитальным встряхиванием 300 об/мин и переносят библиотеку с управляющей пластины на целевую пластину. Пропустите шаг 4.4.2.
   2. Удалите буфер ПБ с целевой пластины, как показано на этапе 4.2.1, и добавьте 100 мкл библиотеки фагов в каждый хорошо покрытый.
   3. Инкубировать при комнатной температуре (~20-25 °C) в течение 1 ч с орбитальным встряхиванием 300 об/мин.
5. Элют вокруг одного фага.
   1. Извлеките библиотеку фагов и четыре раза вымойте покрытые оболочкой колодцы ПТ-буфером. Переверните тарелку и нажмите на бумажное полотенце, чтобы удалить последние капли.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если на одной пластине покрыты несколько белков-мишеней, постарайтесь свести к минимуму поток всех последующих растворов между скважинами.
   2. Добавьте 100 мкл 0,1 М HCl к каждой хорошо покрытой оболочке и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин с орбитальным встряхиванием 300 об/мин.
   3. Нейтрализуют рН, добавляя 12,5 мкл 1 М Трис-HCl (рН 11) к каждому хорошо покрытому.
   4. Объедините элюированный фаг из всех 8 скважин в одну микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Пипетка вверх и вниз во время переноса, чтобы сделать растворы однородными и аспирировать всю жидкость из скважин.
   5. Добавьте 10% BSA к объединенному элюированному фагу до конечной концентрации 1%. Для типичного круглого элюционного объема 950 мкл добавьте 95 мкл 10% BSA. Хранить при температуре 4 °C. Это круглый выход.

5. Подготовка к последующим раундам отбора

1. Подготовьте посевную культуру для культивирования фагового ввода для следующего раунда отбора, как показано на шаге 3.1.
2. Покройте пластину для третьего раунда отбора, как на этапе 3.2, с изменениями, указанными ниже.
   1. Только покрывайте четыре лунки на белок в 96-луночной связывающей пластине. Используйте половину содержимого «круглых 2/3» или «круглых 4/5» трубок для соответствующего раунда. Разбавьте содержимое этих пробирок по мере необходимости, чтобы избежать оседания белков из раствора.
3. Подготовьте фаговые входные данные для следующего раунда отбора.
   1. Используйте половину круглого одного выхода из шага 4.5.5 для прививки 3 мл среднелогарифмических фазовых ячеек с шага 4.1. Для типичного круглого выхода инокулируют 500 мкл выхода.
   2. Инкубировать при 37 °C в течение 30 мин с орбитальным встряхиванием 200 об/мин.
   3. Добавьте вспомогательный фаг M13K07 до конечной концентрации 1 x ¹⁰¹⁰ PFU/мл.
   4. Инкубировать при 37 °C в течение 1 ч с орбитальным встряхиванием 200 об/мин.
   5. Переведите все 3 мл культуры в 30 мл 2YT/углевод/кан. Расти ночью при 37 °C с орбитальным встряхиванием 200 об/мин.
   6. На следующий день переложите культуру в центрифужную трубку объемом 50 мл и центрифугу при 11 000 х г в течение 10 мин при 4 °C до осаждения клеток.
   7. Наполнителе в новую 50-литровую центрифужную трубку, смешайте с 8 мл ПЭГ/NaCl и инкубируйте на льду в течение 10 мин.
   8. Центрифуга при 11 000 х г в течение 10 мин при 4 °C, выбросьте супернатант и снова центрифугируйте в течение 2 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите трубку в ротор в ту же ориентацию во второй раз, что и в первый раз, чтобы держать гранулу в том же месте, чтобы сделать ее более заметной.
   9. Повторно суспендируйте гранулу фага в 800 мкл ПБТ, чтобы она была полностью однородной и не было видно сгустков.
   10. Переложите фаговый раствор в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и центрифугу при 16 200 х г в течение 4 мин при 4 °C в гранулированный мусор.
   11. Перенесите супернатант в новую микроцентрифужную трубку. Это входные данные для следующего раунда отбора.
4. Дополнительно: Титр входных и выходных решений.
   1. Используйте 500 мкл посева семян E. coli для прививки 5 мл 2YT/тет и инкубации при 37 °C с орбитальным встряхиванием 200 об/мин до тех пор, пока бактерии не окажутся в средней фазе (_OD600 0,6 - 0,8). Это занимает примерно 1 ч.
   2. Разбавляют фаговые входные/выходные растворы до ^{10-3 - 10-5} в PBS и добавляют 10 мкл каждого разведения к 90 мкл культивируемых клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте разбавленные фаговые растворы немедленно, потому что фаг будет адсорбироваться в трубке с течением времени, и превращения могут привести к ложноотрицательным результатам.
   3. Инкубировать при 37 °C в течение 20 мин с орбитальным встряхиванием 200 об/мин.
   4. Пластина 5 мкл на отдельных пластинах LB/carb.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество покрытия варьируется в зависимости от предыдущих результатов / личных предпочтений.

6. Последующие раунды отбора

1. Выполните все последующие раунды вместе с подготовкой, как это было сделано на шагах 3 и 4, соответственно, с различиями, указанными ниже.
   1. Используйте входные данные, полученные в предыдущем раунде, в качестве фагового источника вместо библиотеки. Покрыть 4 лунки на целевой белок 100 мкл фагового входа, полученного из предыдущего раунда. Храните оставшиеся фаговые входы при 4 °C.
   2. Делайте шаг стирки в 4.5.1 более строгим с каждым раундом выбора. Первый раунд требует стирки 4 раза, второй раунд требует 6 раз, третий раунд требует 8 раз, а раунды четыре и пять требуют стирки 10 раз.
   3. Уменьшите некоторые объемы по сравнению с теми, которые используются в первом раунде, потому что последующие раунды покрывают только четыре скважины вместо восьми. Например, на стадии 4.5.5 только 45 мкл 10% BSA добавляют к выходу фага, а на стадии 5.3.1 только 250 мкл фагового выхода используется для инокуляции клеток.

7. Обработка после отбора и выделение фагов

1. Титруйте входные и выходные решения для четвертого и пятого раундов.
   1. Если это еще не сделано на этапе 5.4, выполните те же шаги, чтобы титровать круги четырех и пяти фаговых выходов, в идеале производя диапазон в 30-300 колоний на нескольких пластинах.
2. Культивировать и выделять фаги.
   1. Aliquot 450 мкл 2YT/carb/M13K07 в каждую трубку 96 мини-ящика для культуры.
   2. Выберите хорошо изолированные колонии из любой из пластин на этапе 7.1, чтобы привить каждую трубку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте верхнюю половину коробки для выходов четвертого раунда и нижнюю половину для выходов пятого раунда.
   3. Насиживайте в течение ночи при 37 °C с орбитальным встряхиванием 200 об/мин.
   4. Центрифуга при 1 200 х г в течение 10 мин при 4 °C.
   5. Перенесите как можно больше супернатанта в новую коробку для культуры mini tube 96, не нарушая гранулу клетки, и выбросьте старую. Хранить при температуре 4 °C.
   6. Из новой коробки переложите 100 мкл из каждой трубки в 96 луночную несвязывающую пластину, содержащую 100 мкл 50% глицерина во всех скважинах. Хорошо перемешайте и храните при -80 °C в качестве резервного запаса.

Results

Связующие вещества, полученные из фагового дисплея, могут быть проверены и проанализированы различными способами. Рекомендуется сначала приступить к секвенированию фага с помощью праймеров, которые обрамляют диверсифицированную вставку в библиотеке фагемид. Идеальный эксперимент с отображением фагов покажет явный уклон в сторону нескольких последовательностей (рисунок 1). Другие последовательности также будут присутствовать, но с меньшим количеством, появляясь больше как фоновый шум. В приве...

Discussion

Как упоминалось на этапе 2.1 (получение белка), для оценки концентрации белка могут быть использованы различные методы, и каждый из них будет иметь уникальные преимущества и недостатки, основанные на конкретном целевом белке, используемом для отображения фагов. Источник подробных описаний и протоколов для популярных методов был предоставлен ^ранее11.

Использование фага, сохраненного предыдущим раундом отображения фагов, в качестве входных данных для последующего раунда о...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axygen Mini Tube System (0,65 мл, стерильный, 96/штатив, 10 штативов/упаковка)	Fisher Scientific	14-222-198	Культивирование выходов фагов после фагового дисплея.
BD Difco Обезвоженные питательные среды: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	Fisher Scientific	DF0446-17-3	Подготовка тарелок для титрования.
Бычий сывороточный альбумин (БСА), Фракция V	BioShop Canada	ALB001	Буферный компонент.
Карбенициллина динатриевая соль 89,0-100,5% безводная	Millipore-Sigma	C1389-5G	Культивирование клеток, инфицированных фагемидами.
Компактный цифровой шейкер для микропланшетов	Fisher Scientific	11-676-337	Встряхивание планшетов во время инкубации с библиотекой фагов.
Corning Microplate Алюминиевая уплотнительная лента	Fisher Scientific	07-200-684	Герметизация фаговых глицериновых запасов.
Обезвоженный агар	Фишер Scientific	DF0140-01-0	Подготовка тарелок к титрованию.
DS-11 Спектрофотометр/флуориметр	DeNovix	DS-11 FX +	Измерение концентрации белка.
Greiner Bio-One CellStar 96-луночный, необработанный, с U-образным дном микропланшет	Fisher Scientific	7000133	хранения запасов фагового глицерина.
Соляная кислота	Fisher Scientific	A144-500	Фаговое элюирование.
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Химически компетентный E. coli	Fisher Scientific	C854003	Бактериальный штамм для фаговой инфекции.
Канамицина сульфат	AAJ1792406	Фишера Культивирование клеток-хелперов M13K07, инфицированных фагами.
M13KO7 Вспомогательный фаг	Новая Англия Биолаборатории	N0315S	Разрешить упаковку и секрецию фагмидов.
MaxQ 4000 Настольный орбитальный шейкер	Fisher Scientific	11-676-076	Бактериальная клеточная культура.
Nunc MaxiSorp 96 луночный микропланшет, плоское дно	Life Technologies	44-2404-21	Иммобилизующие белки.
Фосфатно-солевой буфер (PBS) 10X Solution	Fisher Scientific	BP3994	Буферный компонент/фаговая ресуспензионная среда.
Полиэфирные пленки для ИФА и инкубации	VWR	60941-120	Покрытие микропланшетов во время инкубации.
Полиэтиленгликоль 8000 (ПЭГ)	Fisher Scientific	BP233-1	Фаговый осадок.
Хлорид натрия	Millipore-Sigma	S3014	Фаговое осаждение.
Стерильные пластиковые пробирки для культивирования: полупрозрачный полипропилен	Fisher Scientific	14-956-1D	Культивирование фаговых входов.
Тетрациклина гидрохлорид	Fisher Scientific	BP912-100	Культивирование E. coli OmniMax.
Tris Base	Fisher Scientific	BP1525	Нейтрализующий элюированный фаговый раствор.
Триптонный порошок	Fisher Scientific	BP1421-2	Компонент клеточной питательной среды.
Tween 20	Fisher Scientific	BP337500	Буферный компонент.
Дрожжевой экстракт	Fisher Scientific	BP1422-2	Компонент клеточной питательной среды.