Методическая статья

Обратный генетический подход к выявлению регуляторов пигментации с использованием рыбок данио-рерио

DOI:

10.3791/62955

⸱

1 марта 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology, 2Academy of Scientific and Innovative Research, 3Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Регуляторы функций меланоцитов регулируют видимые различия в результатах пигментации. Расшифровка молекулярной функции гена-кандидата в пигментацию представляет собой сложную задачу. Здесь мы демонстрируем использование модельной системы рыбок данио-рерио для идентификации кандидатов и классификации их по регуляторам содержания меланина и количества меланоцитов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Меланоциты представляют собой специализированные клетки, полученные из нервного гребня, присутствующие в эпидермальной коже. Эти клетки синтезируют пигмент меланин, который защищает геном от вредного ультрафиолетового излучения. Нарушения в функционировании меланоцитов приводят к пигментным нарушениям, таким как пипебалдизм, альбинизм, витилиго, меланодермия и меланома. Рыбки данио-рерио - отличная модельная система для понимания функций меланоцитов. Наличие заметных пигментированных меланоцитов, простота генетических манипуляций и наличие трансгенных флуоресцентных линий облегчают изучение пигментации. В этом исследовании используется использование линий рыбок данио-рерио дикого типа и трансгенных, которые управляют экспрессией зеленого флуоресцентного белка (GFP) под промоторами mitfa и tyrp1 , которые отмечают различные стадии меланоцитов.

Сайленсинг генов-кандидатов на основе морфолино достигается для оценки фенотипического результата при личиночной пигментации и применим для скрининга регуляторов пигментации. Этот протокол демонстрирует метод от микроинъекции до визуализации и рассечения фенотипов на основе флуоресцентно-активированной клеточной сортировки (FACS) с использованием двух генов-кандидатов, карбоангидразы 14 (Ca14) и варианта гистона (H2afv), для всесторонней оценки результата пигментации. Кроме того, этот протокол демонстрирует разделение генов-кандидатов на спецификаторы и дифференциаторы меланоцитов, которые избирательно изменяют количество меланоцитов и содержание меланина на клетку соответственно.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В то время как использование меланина для фотозащиты несколько раз развивалось в животном мире, позвоночные, по-видимому, усовершенствовали этот процесс. Специальные пигментные продуцирующие клетки со сложным механизмом синтеза и содержания меланина сохраняются от рыбы к человеку1. Тем не менее, результат пигментации сильно варьируется, варьируясь от цвета до взаимности и проявляясь в виде ярких узоров на кожных покровах, коже и волосах2. Несмотря на разнообразие, репертуар генов, участвующих в реакции пигментации, поразительно консервативен. Основные компоненты меланин-синтезирующего механизма, такие как ключевые меланин-синтезирующие ферменты, компоненты меланосом и восходящая связь с сигнальным путем, остаются по существу идентичными для всех организмов. Тонкие генетические различия приводят к резким изменениям в характере пигментации, наблюдаемых у разных видов3. Следовательно, обратный генетический подход в организме низших позвоночных, рыбок данио-рерио (Danio rerio), дает прекрасную возможность расшифровать участие генов в передаче пигментированного состояния4.

Эмбрионы рыбок данио-рерио развиваются от одноклеточной оплодотворенной зиготы до личинки в течение ~ 24 ч после оплодотворения (HPF)5. Поразительно, что клетки, эквивалентные меланоцитам - меланофоры - представляют собой крупные клетки, которые присутствуют в дерме и бросаются в глаза из-за содержания темного меланина6. Эти клетки, полученные из нервного гребня, излучают ~ 11 hpf и начинают пигментировать ~ 24 hpf 6,7. Консервативные модули экспрессии генов позволили идентифицировать ключевые факторы, которые управляют функциями меланоцитов, и привели к разработке трансгенных флуоресцентных репортерных линий Tg (sox10: GFP), Tg (mitfa: GFP) и Tg (ftyrp1: GFP) 8,9,10, которые маркируют селективные стадии развития меланоцитов. Использование этих трансгенных рыбных линий позволяет исследовать клеточную биологию меланоцитов на уровне организма в тканевом контексте с соответствующими сигналами в соответствии с временными линиями развития. Эти репортеры дополняют количественное определение меланоцитов на основе пигментов и позволяют четко оценить количество меланоцитов независимо от содержания меланина.

В этой статье представлен подробный протокол расшифровки биологии меланоцитов путем оценки двух критических параметров, а именно содержания меланина и количества меланоцитов. В то время как первый является общим функциональным считыванием, исходящим из реакции гипопигментации, второй связан со снижением спецификации или выживаемости меланоцитов и часто связан с генетическими или приобретенными состояниями депигментации. Общая стратегия этого обратного генетического скрининга состоит в том, чтобы заставить замолчать выбранные гены с помощью морфолино и исследовать специфические для меланоцитов результаты. Содержание меланина анализируется с использованием количественного определения средних значений серого на основе изображений с последующим подтверждением с помощью анализа содержания меланина. Количество меланоцитов на различных стадиях созревания анализируется с помощью количественного определения на основе изображений и дополнительно подтверждается с помощью анализа FACS. Здесь протокол скрининга демонстрируется с использованием двух генов-кандидатов, а именно карбоангидразы 14, участвующей в меланогенезе, и варианта гистона H2AFZ.2, участвующего в спецификации меланоцитов из популяции предшественников нервного гребня. В то время как первый изменяет содержание меланина, а не количество меланоцитов, второй изменяет количество определенных меланоцитов и, следовательно, содержание меланина в эмбрионе. В целом, этот метод предоставляет подробный протокол для определения роли гена-кандидата в пигментации и различения его роли в контроле количества меланоцитов по сравнению с содержанием меланина.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эксперименты с рыбками данио-рерио проводились в строгом соответствии с институциональным одобрением этики животных (IAEC) CSIR-Института геномики и интегративной биологии (IGIB), Индия (предложение No 45a). Были приложены все усилия, чтобы свести к минимуму страдания животных.

1. Введение морфолино эмбрионам рыбок данио-рерио

  1. Используя стандартный игольчатый съемник, нарисуйте очень острые пипетки с закрытыми наконечниками.
  2. Загрузите раствор, содержащий морфолино, в микропипетки с помощью наконечника микрозагрузчика и вставьте его в аппарат микроинжектора. Правильно затяните винт, чтобы зафиксировать микропипетку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необходима стандартизация дозировки морфолино. Подходящая дозировка имеет выживаемость >70% и специфический фенотип при 24 hpf.
  3. Отрежьте кончик микропипетки с помощью тонких щипцов и откалибруйте его11.
  4. Для калибровки вводят 1 объем раствора морфолино в капиллярную трубку из микропипетки, выдерживая время введения на уровне 1 с. Повторите это пять раз. Используя стандарт 1 мм = объем 30 нл, найдите объем, введенный за 5 с, поднеся капиллярную трубку к измерительной шкале. Используя приведенную выше информацию, рассчитайте время (в секундах), необходимое для введения 1-3 нл на инъекцию12.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стандарт 1 мм = 30 нл зависит от настроек давления в микроинжекторе и диаметра капилляра, используемого для калибровки. В идеале инъекция должна быть сделана в границу раздела желток-клетка, которая образуется в течение 15-20 минут после оплодотворения. Чтобы облегчить многократные инъекции, развитие можно немного задержать, поддерживая эмбрионы при более низкой температуре (18 ° C). Однако это должно быть сведено к минимуму и не должно превышать 30 минут из-за сложного эффекта более низкой температуры на изменения экспрессии генов.
  5. Установите эмбрионы на чашку Петри с агарозным литием (60 мм). Плотно уложите зародыши в гребни. Используя отполированные стеклянные пипетки, выровняйте их в правильной ориентации для инъекций.
  6. Под микроскопом используйте манипуляторы, чтобы приблизить микропипетку к эмбриону и ввести внутрь границы раздела желток-клетка, нажав ножной переключатель.
  7. Вводите все эмбрионы одинаково; собрать их в чашку Петри, содержащую свежую среду для зародышей, и инкубировать при температуре 28 °C.
  8. Проверьте инъецированные эмбрионы через 6-8 ч. Удалите все мертвые эмбрионы, которые можно идентифицировать из-за их высокой непрозрачности, и продолжайте менять воду для эмбрионов не реже одного раза в день, чтобы избежать инфекции.

2. Анализ пигментации

  1. Подготовка к подсчету латеральных срединных меланофоров у 3 эмбрионов рыбок данио-рерио
    1. Обработайте эмбрионы 0,016% нервно-мышечным анестетиком, чтобы обездвижить их.
    2. Чтобы смонтировать эмбрионы для визуализации, добавьте несколько миллилитров 1,5-2% метилцеллюлозы в чашку Петри (60 мм), чтобы она образовала тонкий слой. Используя пипетку Пастера, выберите эмбрионы и осторожно поместите их в метилцеллюлозу, чтобы ограничить дальнейшее движение во время визуализации.
    3. Отрегулируйте их положение для оптимального латерального (дорсальная полоса, вентральная полоса, желточная полоса и срединные меланофоры) или дорсального (меланофоры на дорсальной части головы) визуализации. Для лучшего разрешения соседних меланофоров изображение с большим увеличением (>5x)
  2. Визуализация светлого поля
    ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация светлого поля выполняется с помощью стереомикроскопа с 8-10-кратным увеличением.
    1. Поместите чашку Петри, содержащую эмбрионы рыбок данио, под микроскоп. С помощью манипулятора отрегулируйте рыбу в такой ориентации так, чтобы были видны все пять эмбриональных полос меланоцитов (спинная, вентральная, две боковые, желток) одновременно (рис. 1В). Быстро делайте снимки с помощью программного обеспечения для сбора данных. В случае, если животное восстанавливает движение до того, как оно будет изображено, повторно погрузите его в анестетик и приступайте к визуализации, как только оно будет достаточно иммобилизовано.
    2. Повторите это со всеми рыбами и убедитесь, что увеличение остается одинаковым для каждого изображения.
  3. Расчет среднего значения серого с помощью программного обеспечения ImageJ
    1. Сделайте дорсальные и боковые снимки 2 эмбрионов рыбок данио.
    2. Откройте изображение, подлежащее количественной оценке, в ImageJ с помощью инструмента «Открыть ». Используйте инструмент « Фигура от руки », чтобы обвести область для анализа. Перейдите к опции « Установить измерения » и выберите «Среднее значение серого | область». Нажмите клавишу M (или Analyze | Measure), чтобы вычислить среднее значение серого для выбранной области.
    3. Сохраняя площадь, подлежащую анализу, постоянной, рассчитайте среднюю серую область для каждого животного отдельно.
    4. Постройте гистограмму с полученными данными (рис. 2F).
  4. Анализ на содержание меланина
    1. При 2 dpf используйте стеклянную пипетку Пастера, чтобы собрать ~ 25 эмбрионов рыбок данио.
    2. Выполните ручное дехорионирование с помощью инсулиновых игл объемом 1 мл и добавьте их в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл.
    3. Осторожно выбросьте среду эмбриона и добавьте 1 мл ледяного буфера лизиса (20 мМ фосфата натрия (pH 6,8), 1% Triton X-100, 1 мМ PMSF, 1 мМ ЭДТА) с коктейлем ингибитора протеазы и приготовьте белковые лизаты с помощью ультразвука.
    4. Растворяют лизаты в 1 мл 1 N NaOH и инкубируют образцы при 100 °C в течение 50 мин на водяной бане. Периодически встряхивайте его, чтобы полностью гомогенизировать лизаты.
    5. Снимите показания поглощения образцов на длине волны 490 нм с помощью спектрофотометра.
    6. Рассчитайте содержание меланина, сравнив поглощение образца со стандартной кривой известных концентраций синтетического меланина (рис. 2G).

3. Количество меланофоров

ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентный анализ у трансгенных эмбрионов рыбок данио-рерио может быть выполнен двумя методами: 1) подсчет GFP-положительных клеток; 2) измерение интенсивности флуоресценции.

  1. Подготовка к подсчету GFP-положительных клеток на основе FACS ранних эмбрионов рыбок данио-рерио
    1. Соберите 200-250 эмбрионов ftyrp:GFP и промойте их в ситечке с использованием простой воды для эмбрионов. В качестве отрицательного контроля обработайте GFP-отрицательные эмбрионы дикого типа (Assam Wildtype)12.
    2. В зависимости от интересующей стадии перенесите эмбрионы в чашку Петри, содержащую 0,6 мг/мл проназы. Через 5-10 минут с помощью пастеровской пипетки перенесите дехорионированные эмбрионы в свежую чашку Петри, содержащую простую эмбриональную воду. Используя стеклянную пипетку Пастера, соберите ~ 100 эмбрионов и перенесите их в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл.
    3. Тщательно откажитесь от среды и добавьте 200 мкл ледяного раствора Рингера (буфер для дежелтка). Держа тюбик на льду, пипеткой взбивайте содержимое вверх и вниз ~20 раз, пока желток не растворится. Центрифугируют пробирки при 100 × г в течение 1 мин в настольной центрифуге при температуре 4 °C. Снова центрифугу и аккуратно выбросьте надосадочную жидкость.
    4. С помощью пипетки объемом 1 мл перенесите дежелтованные эмбрионы в чашку Петри, содержащую 10 мл раствора трипсина (буфер диссоциации клеток). Выполняйте его в нескольких чашках Петри, чтобы избежать скученности эмбрионов и неэффективной трипсинизации. Используйте пипетку объемом 1 мл, смешайте раствор, содержащий тела эмбриона, один или два раза, чтобы уменьшить агрегацию.
    5. Инкубируйте чашки Петри при комнатной температуре в течение 15 мин (<24 эмбриона hpf) или 30 мин (24-30 эмбрионов hpf). Время от времени аспирируйте и дозируйте суспензию с помощью пипетки объемом 1 мл, чтобы способствовать распаду клеток.
    6. Во время инкубационного периода инициализируйте проточный цитометр для подсчета клеток.
    7. Поместите клеточный сетчатый фильтр размером 70 мкм над конической трубкой объемом 50 мл и пропустите трипсинизированную суспензию через сетчатый фильтр, чтобы получить одноклеточную суспензию. Вымойте чашки Петри той же суспензией несколько раз, чтобы удалить прилипшие к поверхности клетки.
    8. Отжим образцов при 450 × г, 4 °C в течение 5 мин в роторе качающегося ковша.
    9. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 1 мл ледяного 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
    10. Снова отжим при 450 × г, 4 °C в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость.
    11. Наконец, ресуспендируйте гранулу в PBS + 5% эмбриональной бычьей сыворотке и держите ее на льду до запуска FACS.
  2. Подготовка проточного цитометра
    1. Включите проточный цитометр и начните запуск.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед включением машины опорожните мусорное ведро и заполните бак для жидкости в оболочке.
    2. Нормализуйте поток потока для сопла 70 мкм (или 85 мкм). Оставьте его нетронутым на 10-15 минут, если он нестабилен.
  3. Подсчет флуоресцентно меченных клеток с помощью проточного цитометра
    1. Инициализируйте новую папку эксперимента и составьте точечную диаграмму прямого рассеяния и бокового рассеяния и гистограмму интенсивности флуоресцеина изотиоцианата (FITC).
    2. Сначала загрузите ячейки дикого типа, чтобы установить передние и боковые ворота рассеяния (чтобы исключить дублеты и мусор) и порог FITC.
    3. После того, как ворота установлены, удалите образец и загрузите клетки, выделенные из эмбрионов Tg (ftyrp1: GFP), для подсчета меланоцитов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, поскольку ftyrp1: GFP специфически маркирует зрелые меланоциты, количество GFP-положительных клеток под воротами FITC будет соответствовать количеству меланоцитов.
    4. Повторите описанный выше шаг с образцами, введенными морфолино, чтобы оценить и сравнить количество меланоцитов с контролем.
  4. Измерение интенсивности флуоресценции у эмбрионов рыбок данио-рерио
    1. Используя стеклянную пипетку Пастера, соберите 100-120 эмбрионов и перенесите их в чашку Петри, содержащую простую воду для эмбрионов.
    2. При ~ 10-12 hpf перенесите эмбрионы на 0,003% 1-фенил-2-тиомочевины, чтобы ингибировать пигментацию.
    3. Выполните ручное дехорионирование с использованием инсулиновых игл для визуализации эмбрионов <48 hpf.
    4. Чтобы обездвижить эмбрионы, обработайте их 0,016% трикаином.
    5. Чтобы смонтировать эмбрионы для визуализации, поместите несколько мл 1,5-2% метилцеллюлозы в чашку Петри (60 мм) так, чтобы она образовала тонкий слой. Добавьте эмбрионы в метилцеллюлозу, чтобы ограничить любое дальнейшее движение во время визуализации. Поместите чашку Петри с образцами под микроскоп. С помощью наконечника пипетки отрегулируйте животное в нужной ориентации.
    6. Получение изображений с помощью программного обеспечения для сбора данных. Для эмбрионов <24 hpf захватите весь эмбрион сразу под 10-кратным увеличением. Для ступеней >24 hpf приобретите несколько полей сканирования, а затем соберите (сшите) их вместе.
    7. Повторите это со всеми рыбами и убедитесь, что установка для приобретения остается постоянной на протяжении всего эксперимента.
  5. Квантификация
    1. Проанализируйте изображение с помощью программного обеспечения ImageJ.
    2. Откройте изображение, подлежащее количественной оценке, в ImageJ с помощью инструмента «Открыть ».
    3. Используйте инструмент «Фигура от руки », чтобы наметить область для анализа (рис. 3E).
    4. Нажмите клавишу M (или Analyze | Measure), чтобы получить выбранное измерение интенсивности области.
    5. Сохраняя площадь, подлежащую анализу, постоянной, рассчитайте среднюю интенсивность на площадь для каждого животного отдельно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рабочий процесс, описанный на рисунке 1 , был использован для выполнения генетического возмущения на основе морфолино на стадии одной клетки рыбок данио. Анализ пигментации проводился с использованием различных методов, как указано ниже. Чтобы проиллюстрировать репрезентативные результаты, стандартизированные объемы антисмысловых морфолиногенов, нацеленных на гены h2afv и ca14 , вводили в желтковую или одноклеточную стадию эмбриона рыбки данио. Первоначальное фенотипировани...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фенотип пигментации часто проявляется в виде изменения содержания меланина или количества пигментсодержащих меланоцитов. Способ, описанный в настоящем описании, позволяет вскрывать эту дихотомию и позволяет проводить как качественную, так и количественную оценку содержания меланина и количества меланофоров на эмбрион, независимо от содержания меланина. Высокая плодовитость рыбок данио, видимая природа пигментированных меланоцитов и отсутствие переноса меланосом позволяют анализировать биологию меланоцитов с использование...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы выражаем признательность Совету по научным и промышленным исследованиям за финансовую поддержку проекта MLP2008 и Департамента науки и технологий проекта GAP165 за поддержку работы, представленной в этой рукописи. Мы благодарим Джеяшри Ренгараджу и Четана Мишру за помощь в проведении экспериментов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 мл МикропробиркиAxygenMCT-150-AДля приготовления раствора MO
2 мл МикропробиркиAxygenMCT-200-CДля промывки ступеней в протоколе FACS
AgaroseSigma-AldrichA-9539-500GДля микроинъекций
BD FACSAria IIBD BiosciencesNAДля сортировки клеток
Капиллярная трубкаDrummond1-000-0010
Сетчатый фильтр для клетокCorningCLS431751Для изготовления суспензии одиночных клеток
DMEM High Glucose MediaSigma-AldrichD5648FACS протокол
Этил3-аминобензоат метансульфоната (трикаин)Sigma-AldrichE10521-50Gдля иммобилизации ZF для визуализации
Этилендиаминтетрауксусная кислота динатриевая соль дигидрат (ЭДТА)Sigma-AldrichE5134Для холодного лизиса буферные
трубки FACSBD-Biosciences342065протокол FACS
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Invitrogen10270протокол FACS
Программное обеспечение для призмGraphpad Graphstats TechnologiesNAДля представления данных
ImageJ Программное обеспечениеНациональный институт здравоохраненияNAДля анализа изображений
Инсулиновые шприцы (1 мл)DispoVanNAДля ручной дехорионизации
Меланин, синтетическийSigma-AldrichM8631Для анализа содержания меланина
МетилцеллюлозаSigma-AldrichM7027-250Gдля иммобилизации ZF для визуализации
наконечников MicroloaderEppendorf5242956003Для микроинъекций
MorpholinoGene-toolsNAДля нокдаун-экспериментов
N-фенилтиомочевина (PTU)Sigma-AldrichP7629для ингибирования образования меланина
Needle pullerSutter InstrumentP-97Для микроинъекций
Nunc 15 мл Конические стерильные полипропиленовые центрифужные пробиркиThermo Fisher Scientific339650FACS протокол
Petridish (60 мм)Tarsons460090Для эмбриональные пластины
ФенилметилсульфонилфторидSigma-Aldrich10837091001Для холодного лизиса буфер
Фосфатный буфер физиологического раствора (PBS)HiMediaTL1099-500mLДля промывки клеток
ПроназаSigma-Aldrich53702Для дехорионации
коктейль ингибиторов протеазыSigma-AldrichP8340Для холодного лизиса буфер
Оболочка жидкостьBD FACSlowTM342003протокол FACS
Фосфат натрияMerck7558-79-4Буфер для холодного лизиса
Triton X-100Sigma-AldrichT9284-500MLДля буфера холодного лизиса
TrypLEGibco1677119Для трипсинизации

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kelsh, R. N. Genetics and evolution of pigment patterns in fish. Pigment Cell Research. 17 (4), 326-336 (2004).
  2. Jablonski, N. G. The evolution of human skin and skin color. Annual Review of Anthropology. 33, 585-623 (2004).
  3. Hoekstra, H. Genetics, development and evolution of adaptive pigmentation in vertebrates. Heredity. 97 (3), 222-234 (2006).
  4. Quigley, I. K., Parichy, D. M. Pigment pattern formation in zebrafish: a model for developmental genetics and the evolution of form. Microscopy Research and Technique. 58 (6), 442-455 (2002).
  5. Meyers, J. R. Zebrafish: development of a vertebrate model organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 16 (1), 19(2018).
  6. Kelsh, R. N., Schmid, B., Eisen, J. S. Genetic analysis of melanophore development in zebrafish embryos. Developmental Biology. 225 (2), 277-293 (2000).
  7. Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
  8. Carney, T. J., et al. A direct role for Sox10 in specification of neural crest-derived sensory neurons. Development. 133 (23), 4619-4630 (2006).
  9. Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neural crest by regulation of Mitf. Developmental Biology. 332 (2), 408-417 (2009).
  10. Zou, J., Beermann, F., Wang, J., Kawakami, K., Wei, X. The Fugu tyrp1 promoter directs specific GFP expression in zebrafish: tools to study the RPE and the neural crest-derived melanophores. Pigment Cell Research. 19 (6), 615-627 (2006).
  11. Xu, Q. Microinjection into zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, 125-132 (1999).
  12. Hermanson, S., Davidson, A. E., Sivasubbu, S., Balciunas, D., Ekker, S. C. Sleeping Beauty transposon for efficient gene delivery. Methods in Cell Biology. 77, 349-362 (2004).
  13. Stainier, D. Y., et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. 13 (10), 1007000(2017).
  14. Wu, N., et al. The progress of CRISPR/Cas9-mediated gene editing in generating mouse/zebrafish models of human skeletal diseases. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 954-962 (2019).
  15. Affenzeller, S., Frauendorf, H., Licha, T., Jackson, D. J., Wolkenstein, K. Quantitation of eumelanin and pheomelanin markers in diverse biological samples by HPLC-UV-MS following solid-phase extraction. PLoS One. 14 (10), 0223552(2019).
  16. Fernandes, B., Matamá, T., Guimarães, D., Gomes, A., Cavaco-Paulo, A. Fluorescent quantification of melanin. Pigment Cell & Melanoma Research. 29 (6), 707-712 (2016).
  17. Hultman, K. A., Johnson, S. L. Differential contribution of direct-developing and stem cell-derived melanocytes to the zebrafish larval pigment pattern. Developmental Biology. 337 (2), 425-431 (2010).
  18. Mort, R. L., Jackson, I. J., Patton, E. E. The melanocyte lineage in development and disease. Development. 142 (4), 620-632 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Reverse GeneticsZebrafish PigmentationMelanocyte BiologyMorpholino SilencingFluorescence ImagingFlow CytometryMelanin QuantificationTransgenic ZebrafishMelanophore StripesCRISPR Technology

Похожие статьи