Plaquing - это обычный метод, используемый для количественной оценки живых вирусов в популяции. Хотя плакуирование часто преподается в различных учебных программах по микробиологии с бактериями и бактериофагами, плакуирование вирусов млекопитающих является более сложным и трудоемким. Этот протокол описывает процедуры, которые надежно функционируют для регулярной работы с вирусами простого герпеса.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Заторможенность вирусов простого герпеса
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Существует множество опубликованных протоколов для успокаивания вирусов, включая ссылки в первичной литературе по методологии. Тем не менее, заражение вирусами может быть трудным для выполнения, требуя сосредоточения внимания на его спецификациях и уточнении. Это невероятно сложный метод для новых студентов, главным образом потому, что он требует тщательного внимания к самым мелким деталям. Эта демонстрация заторможенных вирусов простого герпеса должна помочь тем, кто на протяжении многих лет боролся с визуализацией метода, особенно его нюансов. Хотя эта рукопись основана на тех же принципах стандартной методологии упрочнения, она отличается тем, что содержит подробное описание (1) того, как лучше всего обрабатывать клетки-хозяева, чтобы избежать нарушения во время процесса, (2) более полезную вязкую среду, чем агароза, для ограничения диффузии вирионов и (3) простую процедуру фиксации и окрашивания, которая дает надежно воспроизводимые результаты. Кроме того, сопроводительное видео помогает продемонстрировать более тонкие различия в процессе, которые часто упускаются из виду при инструктаже других о проведении анализов бляшек.
Введение
Начало анализов вирусных бляшек восходит к первым открытиям вирусов в 1890-х годах1. Вирус табачной мозаики сначала был выделен и передан на листьях табака, где отдельные пятна инфекции могли быть распознаны и количественно определены как происходящие от одного живого вирусного образования2, позже идентифицированного как вирион2. Более поздние семенные исследования с бактериями и бактериофагами усовершенствовали методы, используемые для бляшек этих вирусов, включая бактерии в середине фазы роста, последовательное разбавление образцов бактериофагов и верхний агар с последующей визуализацией букваль....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры с клетками Vero и живыми герпесвирусами были одобрены Институциональным комитетом по биобезопасности Университета Тоусона. Обобщенная схема этих процедур представлена на рисунке 1.
1. Посев клеток Vero
- За день до начала анализа бляшек попробуйте клетки Vero и повторно суспендируйте их в обычной модифицированной среде Dulbecco Eagles Medium (DMEM) и добавьте в соответствии со стандартной методологией клеточной культуры19. Повторное суспендирование трипсинизированных клеток в 10 мл DMEM на колбу Т-75 сливающихся клеток Vero (~107 клеток).....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В таблице 1 показан эксперимент, который имеет оптимальные результаты. Все 10-кратные разведения следуют за примерно 10-кратным уменьшением количества бляшек. Эти виды данных также можно увидеть на рисунке 2, фактическом анализе бляшек, где счетное количество бляшек упало в диапазоне 10-4 для всех трех реплик. То же самое можно увидеть на рисунке 3, верхнем ряду, где счетное количество бляшек находилось в 10-3 разведении.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Хотя анализы бляшек почти так же стары, как и сама культура клеток млекопитающих, кажется, что каждая лаборатория имеет свой собственный набор протоколов для выполнения этого базового анализа5,6,10,11,12,13,14,15,16,20
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Мы благодарим бесчисленное количество студентов в наших лабораториях (PJD и BJM), которые работали с нами на протяжении многих лет, совершенствуя эти методы. Отдельное спасибо Стэну Персону, под опекой которого эта методика была впервые разработана. Эта работа была частично поддержана Фондом поддержки исследований бакалавриата Университета Тоусона Fisher College of Science and Math и грантом NIGMS Bridges to the Baccalaureate 5R25GM058264. Этот контент является исключительной ответственностью авторов и не обязательно представляет официальную точку зрения Национального института общих медицинских наук Национального института здравоохранения.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 12-луночные планшеты | Corning | 3512 | |
| 6-луночные планшеты | Corning | 3516 | |
| Alpha-MEM | Lonza | 12169F | |
| Антибиотик/антимикотик | Gibco | 15240096 | |
| кристаллический фиолетовый | Alfa Aesar | B2193214 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| PBS Дульбекко (без Mg++ или Ca++) | Gibco | 14190144 | |
| Сыворотка теленка | плода Millipore-Sigma | TMS-013-B | |
| L-аланил-L-глутамин (Глутамакс) | Gibco | GS07F161BA | |
| Гемацитометр | Thermo Fisher | 02-671-54 | |
| Метилцеллюлоза | Millipore-Sigma | 27-441-0 | |
| Четвертичный агент (Lysol I.C.) | Thermo Fisher | NC9645698 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Трипсин | Цитива | SH30042.01 | |
| Клетки Vero | ATCC | CCL-81 |
Ссылки
- Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. Introduction to Moden Virology. 6th end. , Wiley-Blackwell. (2007).
- Mahy, B., Collier, L. Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, Arnold. (1998).
- Anderson, B., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
