Иммунофлуоресценция, очистка и многофотонная микроскопия цельных яичников для количественного 3D-анализа развивающегося овариального резерва у мышей

Ruby Boateng; Nathaniel Boechat; Philipp P. Henrich; Ewelina Bolcun-Filas

doi:10.3791/62972

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Иммунофлуоресценция, очистка и многофотонная микроскопия цельных яичников для количественного 3D-анализа развивающегося овариального резерва у мышей

4.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62972

⸱

3 сентября 2021 г.

Ruby Boateng¹ , Nathaniel Boechat¹ , Philipp P. Henrich¹ , Ewelina Bolcun-Filas¹

¹The Jackson Laboratory

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем оптимизированный протокол для визуализации целых яичников для количественного и качественного анализа с использованием полноразмерного иммуноокрашивания, многофотонной микроскопии и 3D-визуализации и анализа. Этот протокол обеспечивает высокопроизводительную, надежную и повторяемую обработку, которая применима для токсикологии, клинической диагностики и геномных анализов функции яичников.

Аннотация

Женская фертильность и репродуктивная продолжительность жизни зависят от качества и количества ооцитарного резерва яичников. По оценкам, 80% женских половых клеток, входящих в мейотическую профазу I, устраняются во время истощения ооцитов плода (FOA) и первой недели послеродовой жизни. Три основных механизма регулируют количество ооцитов, которые выживают во время развития и устанавливают овариальный резерв у самок, вступающих в период полового созревания. В первой волне потери ооцитов 30-50% ооцитов элиминируются во время ранней FOA, явление, которое объясняется высокой экспрессией long interspersed nuclear element-1 (LINE-1). Второй волной потери ооцитов является устранение ооцитов с мейотическими дефектами контрольной точкой мейотического качества. Третья волна потери ооцитов происходит перинатально во время формирования первичного фолликула, когда некоторые ооциты не образуют фолликулов. Остается неясным, что регулирует каждую из этих трех волн потери ооцитов и как они формируют овариальный резерв у мышей или людей.

Иммунофлуоресценция и 3D-визуализация открыли новый путь для изображения и анализа развития ооцитов в контексте всего яичника, а не в менее информативных 2D-разделах. В этой статье представлен комплексный протокол для иммуноокрашивания и оптической очистки всего яичника, дающий подготовку к визуализации с использованием многофотонной микроскопии и 3D-моделирования с использованием коммерчески доступного программного обеспечения. Он показывает, как этот метод может быть использован для отображения динамики истощения ооцитов во время развития яичников у мышей C57BL/6J и количественной оценки потери ооцитов во время трех волн элиминации ооцитов. Этот протокол может быть применен к пренатальным и ранним постнатальным яичникам для визуализации и количественной оценки ооцитов, а также к другим количественным подходам. Важно отметить, что протокол был стратегически разработан для обеспечения высокопроизводительной, надежной и повторяемой обработки, которая может удовлетворить потребности в токсикологии, клинической диагностике и геномных анализах функции яичников.

Введение

Большинство самок млекопитающих рождаются с конечным числом мейотически остановленных ооцитов, хранящихся в первичных фолликулах, составляющих овариальный резерв (OR)^1,2. ОПЕРАЦИОНН определяет общую продолжительность репродуктивной жизни и здоровье женщин³. ОПЕРАЦИОНН обычно уменьшается в размерах со старением и может быть преждевременно истощена при воздействии определенных генотоксических агентов (лучевая / химиотерапия) и экологических стрессов (недоедание), что приводит к бесплодию ^4,5,6. И....