В этом протоколе представлены два метода выделения субклеточных компартментов фоторецепторов мышечных стержней для анализа белка. Первый способ использует живую сетчатку и целлюлозную фильтровальную бумагу для разделения наружных сегментов стержня, в то время как второй использует лиофилизированные сетчатки и клейкую ленту для удаления слоев внутреннего и наружного сегментов стержня.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Два метода пилинга для выделения компартментов фоторецепторных клеток в сетчатке мыши для анализа белка
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Палочковые фоторецепторы представляют собой высокополяризованные сенсорные нейроны с отчетливыми отсеками. Мышиные стержни длинные (~80 мкм) и тонкие (~2 мкм) и сбоку упакованы в самый внешний слой сетчатки, слой фоторецепторов, что приводит к выравниванию аналогичных субклеточных компартментов. Традиционно тангенциальное сечение замороженной плоской сетчатки использовалось для изучения движения и локализации белков в разных стержневых отсеках. Однако высокая кривизна стержневой доминантной сетчатки мыши затрудняет тангенциальное сечение. Мотивированные изучением транспорта белка между компартментами, мы разработали два метода пилинга, которые надежно изолируют стержневой внешний сегмент (АФК) и другие субклеточные компартменты для вестерн-блотов. Наши относительно быстрые и простые методы обеспечивают обогащенные и субклеточные специфические фракции для количественного измерения распределения и перераспределения важных белков фоторецепторов в нормальных палочках. Кроме того, эти методы изоляции также могут быть легко адаптированы для выделения и количественного исследования белкового состава других клеточных слоев как в здоровых, так и в дегенеративных сетчатках.
Введение
Палочковые фоторецепторные клетки, плотно упакованные в самый внешний слой нервной сетчатки, являются неотъемлемой частью зрения тусклого света. Чтобы функционировать как верные счетчики фотонов, палочки используют сигнальный путь на основе G-белка, называемый фототрансдукцией, для генерации быстрых, усиленных и воспроизводимых реакций на захват одного фотона. Эта реакция на свет в конечном итоге вызывает изменение тока на плазматической мембране и впоследствии сигнализируется остальной части зрительной системы1. Как следует из названия, каждая палочковая клетка имеет отличную палочковидную форму и демонстрирует высокополяризованную клеточную м....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты проводились в соответствии с местными институциональными руководящими принципами комитета по уходу за животными из Университета Южной Калифорнии (USC).
1. Метод пилинга сетчатки живыми клетками
- Приготовление буферов Эймса, пилинг бумаги и тарелки для вскрытия
- Используя ножницы с тупым наконечником радужной оболочки (или эквивалентные ножницы), разрежьте целлюлозную фильтровальную бумагу (марка 413) на прямоугольники размером примерно 5 мм х 2,5 мм. Храните черенки для будущего использования.
- Приготовьте 1 л буфера HEPES Эймса, соединив одну бутылку среды Эймса, 2,38 г HEPES и 0,....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Настоящие стратегии были разработаны для обеспечения относительно быстрых и простых методов выделения и анализа белков среди специфических стержневых субклеточных компартментов для анализа вестерн-блоттинга. Мы применили два метода последовательного пилинга (рисунок 1 и рисунок 2) с последующим иммуноблоттингом, чтобы продемонстрировать, что эти методы могут быть надежно использованы для обнаружения известного распределения стержневого трансдуцина (GNAT1) и арес.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Многие заболевания сетчатки поражают палочковые фоторецепторные клетки, приводя к гибели палочки и, в конечном счете, полной потере зрения37. Значительная часть генетического и механистического происхождения дегенерации сетчатки человека была успешно воспроизведена в многочисленных моделях мышей на протяжении многих лет. В этом контексте способность легко и избирательно отделять отдельные палочковые субклеточные компартменты от сетчатки маленьких мышей значительно улучшила бы наше понимание локали.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами NIH EY12155, EY027193 и EY027387 для JC. Мы благодарны доктору Спиридону Михалакису (Калтех, Пасадена, США) и Натали Чен (USC, Лос-Анджелес, США) за корректуру рукописи. Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Сета Раффинса (USC, Лос-Анджелес, США) и д-ра Яноша Пети-Петерди (USC, Лос-Анджелес, США) за предоставление необходимого оборудования для сбора предоставленных автором отснятого материала. Материал из: Kasey Rose et al, Разделение компартментов фоторецепторных клеток в сетчатке мыши для анализа белка, Молекулярная нейродегенерация, опубликовано [2017], [Springer Nature].
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Лабораторная или медиа-бутылка объемом 100 мл, оборудованная адаптером для крышки трубки | Н | /Д | |
| 100% O2 бак | N/A | N/A | |
| 1000mL Бутылочный фильтр, фильтрующий материал PES, 0,22 мкм; m | Genesee Scientific | 25-235 | |
| 4X SDS Буфер для проб | Millipore Sigma | 70607-3 | |
| 50 мл Falcon Tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 95% O2 и 5% CO2 бак | Н/ | Д | |
| AMES' Среда с L-глутамином, без бикарбоната | Sigma-Aldrich | A1420 | |
| CaCl2 (99%, дигидрат) | Sigma | C-3881 | |
| Drierite (безводный сульфат кальция, >98% CaSO4, >2% CoCl2) | WA Hammond Drierite Co LTD | 21005 | |
| Falcon Easy-Grip Чашка Петри (полистирол, 35 x 10 мм) | Falcon-Corning | 08-757-100A | |
| Чашка для культуры тканей Falcon (60 x 15 мм) | Falcon-Corning | 08-772F | |
| Скальпель из перьев (No 10, 40 мм) | VWR | 100499-578 | |
| Скальпель из перьев (No 11, 40 мм) | VWT | 100499-580 | |
| KCl (99%) | Sigma | P-4504 | |
| Пестик для гранул Kimble Kontes | Sigma | z359971 | |
| Быстрозамороженные колбы Labconco | N/A | ||
| LN2 + Фляга Дьюара или аналогичная вакуумная колба | N/A | N/A | |
| MgCl2 | Sigma | M-9272 | |
| Milli-Q/деионизированная вода | EMD Millipore | N/A | |
| 2HPO4 (порошок) | J.T. Baker | 4062-01 | |
| NaCl (кристалл) | EMD Millipore | Sx0420-3 | |
| NaHCO3 | Amresco | 0865 | |
| OmniPur EDTA | EMD | 4005 | |
| OmniPur HEPES, свободная кислота | EMD | 5320 | |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Reynolds Wrap Алюминиевая фольга | Reynolds Brands | N/A | |
| Scotch Magic Tape (12,7 мм x 32,9 м) | Scotch-3M | N/A | |
| Дезоксихолат натрия | Sigma-Aldrich | D67501 | |
| Мини-центрифуга Spectrafuge | Labnet International, Inc | C1301 | |
| Инкубационная камера для тканей (купленная или изготовленная на заказ) | Н/Д | Н/Д | |
| Tris-HCl | J.T.Baker | 4103-02 | |
| Triton X-100 | Signma-Aldrich | T8787 | |
| VirTis Настольный лиофилизатор 2K или аналогичная машина | SP Scientific | N/A | |
| VWR Grade 413 Filer Paper (диаметр 5,5 см, размер пор 5; m) | VWR | 28310-015 | |
| Качественная фильтровальная бумага Whatman Grade 1 (диаметр 9 см, размер пор 11; m) | Whatman/GE Healthcare | 1001-090 | |
| Широкопроходная передаточная трубка, Global Scientific | VWR | 76285-362 |
Ссылки
- Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. G proteins and phototransduction. Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).
- Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
- Koch, K. W., Dell'Orco, D.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
