Методическая статья

Оптимизация мышиной модели окклюзии вен сетчатки для ограничения изменчивости

DOI:

10.3791/62980

⸱

6 августа 2021 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology & Cell Biology; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 2Department of Molecular Pharmacology and Therapeutics; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 3Department of Neurology; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 4The Taub Institute for Research on Alzheimer’s Disease and the Aging Brain; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем оптимизированный протокол окклюзии вен сетчатки с использованием розовой бенгальской розы и систему микроскопа визуализации сетчатки с лазерным наведением с рекомендациями по максимизации ее воспроизводимости в генетически модифицированных штаммах.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мышиные модели окклюзии вен сетчатки (RVO) часто используются в офтальмологии для изучения гипоксически-ишемического повреждения нервной сетчатки. В этом отчете подробный метод, указывающий на критические шаги, содержит рекомендации по оптимизации для достижения стабильно успешных показателей окклюзии у различных генетически модифицированных штаммов мышей. Модель мыши RVO состоит в основном из внутривенного введения красителя фотосенсибилизатора с последующей лазерной фотокоагуляцией с использованием микроскопа визуализации сетчатки, прикрепленного к офтальмологическому управляемому лазеру. Три переменные были идентифицированы как детерминанты консистенции окклюзии. Регулируя время ожидания после введения розовой бенгалии и балансируя исходный и экспериментальный лазерный выход, изменчивость между экспериментами может быть ограничена и достигнут более высокий уровень успеха окклюзий. Этот метод может быть использован для исследования заболеваний сетчатки, которые характеризуются отеком сетчатки и гипоксически-ишемическим поражением. Кроме того, поскольку эта модель вызывает повреждение сосудов, она также может быть применена для изучения нейроциркулятуры, гибели нейронов и воспаления.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Окклюзия вен сетчатки (RVO) является распространенным сосудистым заболеванием сетчатки, которое затронуло около 28 миллионов человек во всем мире в 2015году 1. RVO приводит к снижению зрения и потере у людей трудоспособного возраста и пожилых людей, представляя собой продолжающееся угрожающее зрению заболевание, которое, по оценкам, увеличится в течение ближайшего десятилетия. Некоторые из различных патологий RVO включают гипоксически-ишемическое повреждение, отек сетчатки, воспаление и потерю нейронов2. В настоящее время первая линия лечения этого расстройства заключается в введении ингибиторов фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). В то время как лечение анти-VEGF помогло улучшить отек сетчатки, многие пациенты все еще сталкиваются со снижением зрения3. Чтобы лучше понять патофизиологию этого заболевания и проверить потенциальные новые линии лечения, необходимо составить функциональный и подробный протокол мышиной модели RVO для различных штаммов мышей.

Мышиные модели были разработаны с реализацией того же лазерного устройства, которое используется у пациентов-людей, в сочетании с системой визуализации, масштабированной до правильного размера для мыши. Эта мышиная модель RVO была впервые зарегистрирована в 2007 году4 и далее установлена Ebneter и другими 4,5. В конце концов, модель была оптимизирована Fuma et al. для воспроизведения ключевых клинических проявлений RVO, таких как отек сетчатки6. С тех пор, как модель была впервые представлена, многие исследования использовали ее с использованием введения красителя фотосенсибилизатора с последующим фотокоагуляцией основных вен сетчатки с помощью лазера. Тем не менее, количество и тип вводимого красителя, мощность лазера и время воздействия значительно различаются в исследованиях, в которых использовался этот метод. Эти различия часто могут привести к увеличению изменчивости модели, что затрудняет ее тиражирование. На сегодняшний день нет опубликованных исследований с конкретными подробностями о потенциальных путях его оптимизации.

В настоящем отчете представлена подробная методология мышиной модели RVO в штамме C57BL/6J и тамоксифен-индуцируемом эндотелиальной каспазе-9 нокаутном штамме (iEC Casp9KO) с фоном C57BL/6J и имеющим отношение к патологии RVO в качестве эталонного штамма для генетически модифицированной мыши. Предыдущее исследование показало, что неапоптотическая активация эндотелиальной каспазы-9 вызывает отек сетчатки и способствует гибели нейронов8. Опыт использования этого штамма помог определить и дать представление о потенциальных модификациях для адаптации мышиной модели RVO, которая может быть применима к другим генетически модифицированным штаммам.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол следует заявлению Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) для использования животных в офтальмологических и зрительных исследованиях. Эксперименты на грызунах были одобрены и контролировались Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Колумбийского университета.

ПРИМЕЧАНИЕ: Во всех экспериментах использовались двухмесячные самцы мышей, которые весили примерно 20 г.

1. Получение и введение тамоксифена для индуцируемой генетической абляции флоксированных генов

ПРИМЕЧАНИЕ: На диаметр сосуда сетчатки может влиять вес животного. Убедитесь, что все животные, используемые для эксперимента, имеют одинаковый вес.

  1. Развести тамоксифен в кукурузном масле до концентрации 20 мг/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тамоксифен является токсичным веществом и светочувствительным. Защитите от света, например, алюминиевой фольгой.
  2. Вихрь раствора на пару секунд.
  3. Оставить в духовке при 55 °C в течение 15 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что тамоксифен полностью растворился. Может потребоваться дополнительное вихрь.
  4. Хранить раствор при температуре 4 °C до 1 недели.
  5. Используйте шприц объемом 1 мл, снабженный иглой 26 г для инъекций тамоксифена. Очистите область инъекции 70% этанолом.  Вводят 2 мг тамоксифена (100 мкл 20 мг/мл) внутрибрюшинно (IP) один раз в день в течение установленного времени в соответствии со специфической индуцируемой линией Cre.
  6. Дайте животным два дня отдыха перед началом экспериментов.

2. Подготовка реагентов к лазерной фотокоагуляции

  1. Роза бенгальская
    ПРИМЕЧАНИЕ: Роза бенгальская светочувствительна. Хранить в темноте до использования и готовить свежим для достижения наилучших результатов.
    1. Приготовьте бенгальскую розу, разбавляя ее до 5 мг/мл в стерильном физиологическом растворе и фильтруйте через шприцевой фильтр 0,2 мкм.
    2. Приготовьте шприц объемом 1 мл, снабженный иглой 26 г с розовой бенгальской розой.
  2. Кетамин/ксилазин
    1. Разбавляют кетамин и ксилазин в стерильном физиологическом растворе соответственно для следующих концентраций: кетамин (80-100 мг/кг) и ксилазин (5-10 мг/кг).
  3. Карпрофен
    1. Развести карпрофен до 1 мг/мл в стерильном физиологическом растворе.
    2. Приготовьте шприц объемом 1 мл, снабженный иглой 26 г с карпрофеном.
  4. Стерильный физиологический раствор
    1. Приготовьте шприц объемом 5 мл, снабженный иглой 26 г со стерильным физиологическим раствором.

3. Настройка лазера

  1. Аккуратно обработайте оптоволоконный кабель и подключите его к лазерному блоку управления и лазерному адаптеру микроскопа визуализации сетчатки.
  2. Включите лампу микроскопа для визуализации сетчатки.
  3. Включите компьютер и откройте программу создания образов.
  4. Отрегулируйте баланс белого, используя лист белой бумаги, поместив его перед окуляром мыши и щелкнув Кнопка «Настроить » в программе обработки изображений.
  5. Включите лазерный блок управления, повернув ключ и следуя инструкциям на экране лазерного блока управления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лазер, используемый в этом эксперименте, относится к классу 3B и может вызвать повреждение глаз. Носите защитные очки при работе с лазером.
  6. Проверьте базовую мощность лазера.
    1. Используйте лазерный измеритель мощности.
    2. Отрегулируйте экран лазерного блока управления на следующие параметры: 50 мВт и 2000 мс.
    3. Включите лазер и поместите измеритель мощности перед окуляром.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что свет микроскопа выключен при тестировании базовой мощности лазера.
    4. Нажмите на педаль ножного переключателя, чтобы активировать лазер.
    5. Стремитесь к тому, чтобы показания мощности лазера составляли 13-15 мВт.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Считывание мощности лазера определит успешность окклюзии вен сетчатки. Если показания мощности лазера слишком низкие, можно внести коррективы в мощность и время воздействия лазера. Рекомендации см. в таблице 1 .
  7. Отрегулируйте мощность экспериментального лазера, настроив экран лазерного блока управления на следующие параметры: 100 мВт, 1000 мс.
  8. Выключите лазер.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для безопасности и предотвращения перегрева лучше всего держать лазер выключенным между мышами.

4. Инъекция вену мышиного хвоста бенгальской розы

  1. Налейте 300 мл воды в стакан емкостью 500 мл.
  2. Разогрейте стакан в микроволновой печи в течение 1 мин.
  3. Положите марлю в теплую воду в стакан.
  4. Положите мышь в ограничитель.
  5. Осторожно вдавите марлю в хвост мыши и найдите расширенные вены. Продезинфицируйте место инъекции спиртовой салфеткой после расширения теплой воды.
  6. Вставьте иглу в место инъекции и потяните за шприц, чтобы убедиться, что вы находитесь в вене. Затем вводят в вену хвоста мыши, вводя правильное количество в соответствии с весом животного (37,5 мг / кг). Надавите на место инъекции, чтобы избежать гематомы или кровотечения. Очистите сайт.
  7. Отпустите мышь от ограничителя и верните ее в клетку.
  8. Дайте 8 мин, чтобы бенгальская роза циркулировала перед инъекцией анестетиков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечит в общей сложности 10 минут между инъекцией бенгальской розы и лазерным облучением.

5. Окклюзия крупных вен

  1. Включите нагретую платформу мыши.
  2. Добавьте по одной капле фенилэфрина и тропикамида в каждый глаз.
  3. Вводят 150 мкл анестетиков, кетамина (80-100 мг/кг) и ксилазина (5-10 мг/кг) ИП.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этой процедуры мышке было дано две IP-инъекции. Следовательно, стороны чередовались. Инъекция ИП для анестезии вводилась в нижний правый брюшной квадрант, а физиологический раствор вводили в нижний левый брюшной квадрант. Натягивание шприца перед инъекцией рекомендуется для того, чтобы игла находилась в брюшной полости, а не в каких-либо органах.
  4. Ущипните животное, чтобы определить глубину анестезии, и подождите, пока оно не перестанет реагировать.
  5. Добавьте по одной капле гидрохлорида пропаракаина на глаз (анальгетик).
  6. Добавить гелевую мазь на оба глаза.
  7. Вводят 150 мкл карпрофена подкожно между ушами.
  8. Разместите мышь на платформе.
  9. Отрегулируйте платформу до тех пор, пока вид глазного дна сетчатки не станет четким и сфокусированным.
  10. Подсчитайте вены сетчатки и сделайте снимок глазного дна.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вены сетчатки темнее и шире, чем артерии. Вены и артерии чередуются; однако иногда может быть разветвленная артерия рядом с зрительным нервом, а значит, и две смежные артерии.
  11. Включите лазер и направляйтесь в вену сетчатки примерно на расстоянии 375 мкм от диска зрительного нерва.
  12. Облучают сосуд нажатием на ножной переключатель и слегка перемещая лазерный луч до 100 мкм. Повторите этот шаг три раза и перемещайте лазерный луч после каждого импульса, чтобы облучение не было сфокусировано в одном месте.
  13. Повторное облучение на другие крупные сосуды для достижения 2-3 окклюзий.

6. Установление количества закупоренных вен на 0 день

  1. Выключите лампу после облучения сосудов и подождите 10 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Воздействие света может вызвать повреждение и воспаление сетчатки; выключите лампу во время ожидания, чтобы свести к минимуму экспозицию7.
  2. Снова включите лампу и подсчитайте количество закупоренных вен.
  3. Сделайте снимок глазного дна.

7. Последующий уход

  1. Вводят 1 мл стерильного физиологического раствора IP.
    ПРИМЕЧАНИЕ: См. подробности внедрения IP в разделе 5, шаг 3.
  2. Добавьте смазочные глазные капли в оба глаза.
  3. Добавить гелевую мазь на оба глаза.
  4. Наблюдайте за мышью, как она восстанавливается после анестезии, и не возвращайте ее в клетку с другими животными, пока она полностью не выздоровеет. Карпрофен (5 мг/кг) можно давать ежедневно до 2 дней после процедуры. При применении к людям боль не является симптомом RVO.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте животных без присмотра до тех пор, пока они полностью не восстановятся после анестезии.

8. Оценка отека сетчатки методом оптической когерентной томографии (ОКТ)

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть выполнен в точке интереса следователя. Пик отека сетчатки у мыши C57BL/6J приходится на 1 день после процедуры RVO. Этот момент времени может варьироваться в зависимости от фона мыши.

  1. Включите световой короб микроскопа визуализации сетчатки, машину OCT и платформу мыши с подогревом.
  2. На следующий день после окклюзии выполните шаги с 5,2 по 5,7, чтобы подготовить животное.
  3. Откройте программное обеспечение для создания образов и центр развертывания Office.
  4. В программе центра развертывания Office отрегулируйте подталкивание на 5.
  5. Принимайте ОКТ на расстоянии 75 мкм дистально от ожога или 4 щелчка.
  6. Сделайте снимки OCT в четырех квадрантах сетчатки.
  7. Анализируйте изображения центра развертывания Office с помощью программного обеспечения трассировки.
  8. Сравните толщину сетчатки при предварительно облученных мерах с 1 днем после RVO или в точке интереса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При анализе данных учитывайте количество облученных вен, так как это может повлиять на развитие отека сетчатки. Затем животных усыпляют путем введения анестетика с последующей перфузионной операцией, не связанной с выживанием.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мышиная модель RVO направлена на успешное достижение окклюзии в венах сетчатки, приводящей к гипоксически-ишемическому повреждению, разрушению кровяного барьера сетчатки, гибели нейронов и отеку сетчатки8. На рисунке 1 показана временная шкала шагов для обеспечения воспроизводимости, схема экспериментального проекта и намечены этапы, которые могут быть дополнительно оптимизированы в зависимости от экспериментальных вопросов. Тремя основными шагами, которые могут быть ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Модель RVO для мышей предоставляет возможность для дальнейшего понимания патологии RVO и тестирования потенциальных терапевтических средств. В то время как модель RVO мыши широко используется в полевых условиях, существует потребность в текущем подробном протоколе модели, который учитывает ее изменчивость и описывает оптимизацию модели. Здесь мы предоставляем руководство с примерами из опыта о том, что может быть изменено, чтобы получить наиболее последовательные результаты в когорте экспериментальных животных и предоста...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Эта работа была поддержана Программой стипендий для выпускников Национального научного фонда (NSF-GRFP) DGE - 1644869 (для CCO), Национальным институтом глаз (NEI) 5T32EY013933 (для AMP) и Национальным институтом по проблемам старения (NIA) R21AG063012 (для CMT).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
КарпрофенРимадилНАДА #141-199держать при 4 ° C
Кукурузное маслоSigma-AldrichC8267
Волоконный патч-кабельThor LabsM14L02
GenTealAlcon00658 06401
Кетамина гидрохлоридScheinNDC: 11695-0702-1
LasercheckCoherent1098293
фенилэфринAkornNDCL174478-201-15
Phoneix Micron IV с Meridian,  StreamPix и модули ОКТPhoenix Technology Group
Пропаракаина гидрохлоридAkornNDC: 17478-263-12держать на уровне 4 ° C
RefreshAllergan94170
Розовый бенгальскийSigma-Aldrich330000-5G
ТамоксифенSigma-AldrichT5648-5Gсветочувствительный
ТропикамидAkornNDC: 174478-102-12
КсилазинAkornNDCL 59399-110-20
Henry

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors. Journal of Global Health. 9 (1), 010427(2019).
  2. Ehlers, J. P., Fekrat, S. Retinal vein occlusion: beyond the acute event. Survey of Ophthalmology. 56 (4), 281-299 (2011).
  3. Iftikhar, M., et al. Loss of peak vision in retinal vein occlusion patients treated for macular edema. American Journal of Ophthalmology. 205, 17-26 (2019).
  4. Zhang, H., et al. Development of a new mouse model of branch retinal vein occlusion and retinal neovascularization. Japanese Journal of Ophthalmology. 51 (4), 251-257 (2007).
  5. Ebneter, A., Agca, C., Dysli, C., Zinkernagel, M. S. Investigation of retinal morphology alterations using spectral domain optical coherence tomography in a mouse model of retinal branch and central retinal vein occlusion. PLoS One. 10 (3), 0119046(2015).
  6. Fuma, S., et al. A pharmacological approach in newly established retinal vein occlusion model. Scientific Reports. 7, 43509(2017).
  7. Zhang, C., et al. Activation of microglia and chemokines in light-induced retinal degeneration. Molecular Vision. 11, 887-895 (2005).
  8. Avrutsky, M. I., et al. Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion. Nature Communications. 11 (1), 3173(2020).
  9. Nicholson, L., et al. Diagnostic accuracy of disorganization of the retinal inner layers in detecting macular capillary non-perfusion in diabetic retinopathy. Clinical & Experimental Ophthalmology. 43 (8), 735-741 (2015).
  10. Moein, H. R., et al. Optical coherence tomography angiography to detect macular capillary ischemia in patients with inner retinal changes after resolved diabetic macular edema. Retina. 38 (12), 2277-2284 (2018).
  11. Hirabayashi, K., et al. Development of a novel model of central retinal vascular occlusion and the therapeutic potential of the adrenomedullin-receptor activity-modifying protein 2 system. American Journal of Pathology. 189 (2), 449-466 (2019).
  12. Martin, G., Conrad, D., Cakir, B., Schlunck, G., Agostini, H. T. Gene expression profiling in a mouse model of retinal vein occlusion induced by laser treatment reveals a predominant inflammatory and tissue damage response. PLoS One. 13 (3), 0191338(2018).
  13. Drechsler, F., et al. Effect of intravitreal anti-vascular endothelial growth factor treatment on the retinal gene expression in acute experimental central retinal vein occlusion. Ophthalmic Research. 47 (3), 157-162 (2012).
  14. Genevois, O., et al. Microvascular remodeling after occlusion-recanalization of a branch retinal vein in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (2), 594-600 (2004).
  15. Khayat, M., Lois, N., Williams, M., Stitt, A. W. Animal models of retinal vein occlusion. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (14), 6175-6192 (2017).
  16. Nguyen, V. P., Li, Y., Zhang, W., Wang, X., Paulus, Y. M. High-resolution multimodal photoacoustic microscopy and optical coherence tomography image-guided laser induced branch retinal vein occlusion in living rabbits. Scientific Reports. 9 (1), 10560(2019).
  17. Sayyed, S. A. A. R., Beedri, N. I., Kadam, V. S., Pathan, H. M. Rose Bengal sensitized bilayered photoanode of nano-crystalline TiO2-CeO2 for dye-sensitized solar cell application. Applied Nanoscience. 6 (6), 875-881 (2015).
  18. Emmart, E. W. Observations on the absorption spectra of fluorescein, fluorescein derivatives and conjugates. Archives of Biochemistry and Biophysics. 73 (1), 1-8 (1958).
  19. Yu, L., Liu, Z., Liu, S., Hu, X., Liu, L. Fading spectrophotometric method for the determination of polyvinylpyrrolidone with eosin Y. Chinese Journal of Chemistry. 27 (8), 1505-1509 (2009).
  20. MacDonald, D. The ABCs of RVO: a review of retinal venous occlusion. Clinical & Experimental Optometry. 97 (4), 311-323 (2014).
  21. Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
  22. LaVail, M. M., Gorrin, G. M., Repaci, M. A. Strain differences in sensitivity to light-induced photoreceptor degeneration in albino mice. Current Eye Research. 6 (6), 825-834 (1987).
  23. Jeffery, G. The albino retina: an abnormality that provides insight into normal retinal development. Trends in Neurosciences. 20 (4), 165-169 (1997).
  24. Kinnear, P. E., Jay, B., Witkop, C. J. Albinism. Survey of Ophthalmology. 30 (2), 75-101 (1985).
  25. Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи