Методическая статья

Эксплантная система для покадровых исследований обонятельной кольцевой сборки у дрозофилы

1.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62983

⸱

13 октября 2021 г.

 , 
1Department of Biology, Howard Hughes Medical Institute, Department of Biology, Stanford University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает процедуру рассечения, состояние культуры и живую визуализацию системы эксплантов антенны-мозг для изучения сборки обонятельной цепи.

Аннотация

Нейроны точно связаны между собой, образуя цепи, необходимые для правильного функционирования мозга. Обонятельная система Drosophila обеспечивает отличную модель для исследования этого процесса, поскольку 50 типов обонятельных рецепторных нейронов (ORNs) от антенн и верхнечелюстных пальпов проецируют свои аксоны на 50 идентифицируемых клубочков в антеннальной доле и образуют синаптические связи с дендритами из 50 типов проекционных нейронов второго порядка (PNs). Предыдущие исследования в основном были сосредоточены на выявлении важных молекул, которые регулируют точное нацеливание в обонятельной цепи с использованием фиксированных тканей. Здесь описана эксплантная система антенны-мозг, которая повторяет ключевые вехи развития обонятельной сборки схем в культуре. Благодаря рассечению внешней кутикулы и очистке непрозрачных жировых тел, покрывающих развивающийся мозг куколки, высококачественные изображения отдельных нейронов из живого мозга могут быть собраны с помощью двухфотонной микроскопии. Это позволяет получать покадровую визуализацию одного аксона ORN из живой ткани. Такой подход поможет выявить важные клеточные биологические контексты и функции ранее идентифицированных важных генов и выявить механизмы, лежащие в основе динамического процесса сборки схем.

Введение

Нейроны точно связаны между собой, образуя цепи, необходимые для правильной функции мозга. На протяжении более 100 лет нейробиологи пытались понять, как нейриты распространяются к своим промежуточным и конечным целям с предельной точностью. В результате они идентифицировали важные гены, которые кодируют направляющие сигналы для развития нейронных процессов1. Обонятельная система Drosophila обеспечивает отличную модель для исследования этого процесса, поскольку обонятельные рецепторные нейроны (ORN, первичные сенсорные нейроны) проецируются на 50 идентифицируемых клубочков со стереотипным размером, формой и относительным положением, где они образуют синаптические связи с дендритами из 50 типов проекционных нейронов второго порядка (PN), каждый из которых посылает дендриты в один из 50 клубочков2 (рисунок 1AA). ). Поэтому относительно легко идентифицировать мутантные фенотипы с синаптическим (клубочковым) разрешением в обонятельной системе мух. Это привело к открытию важных генов, которые регулируют обонятельную цепь сборки3.

Сборка обонятельной цепи мухи опирается на временно и пространственно скоординированные процессы развития3. ОРН и ПН приобретают различные судьбы ячеек, которые создают программу для их специфики проводки. Далее PN дендриты препастернируют антеннальную долю (рисунок 1B). Затем аксоны ОРН обходят ипсилатеральную антеннальную долю и пересекают среднюю линию мозга, чтобы достичь контралатеральной антеннальной доли. Впоследствии аксоны ORN вторгаются как в ипси-, так и в контралатеральные антеннальные доли и образуют синапсы с дендритами своих партнерских PNs в специфических клубочках. Эта грубая модель для сборки обонятельных схем была предложена на основе характеристики фиксированных образцов из промежуточных временных точек во время разработки. Плохое временное разрешение и неспособность следовать одним и тем же нейронным процессам на протяжении всего развития из фиксированной ткани ограничивают механистическое понимание процесса сборки схемы.

Технически сложно жить изображениями ORN и PN процессов in vivo, поскольку процесс проводки происходит в первой половине стадии куколки, когда антеннальная доля окружена непрозрачным жирным телом внутри корпуса куколки. Поэтому невозможно непосредственно изобразить развивающуюся обонятельную цепь из неповрежденных куколок. Рассеченные ткани, культивируемые ex vivo, могут обходить тканевую непрозрачность и были успешно использованы для изучения нейронного развития 4,5,6. Проблема использования аналогичной стратегии ex vivo explant culture для изучения нейронной проводки в мозге куколки заключается в том, повторяет ли она точный нейрон, нацеленный в состоянии культуры. Основываясь на ранее сообщенном состоянии культуры ex vivo для комплексаглаз-мозг мухи 7, недавно был разработан эксплант, который содержит весь мозг куколки, антенны и неповрежденные соединительные антеннальные нервы, который сохраняет точное нацеливание обонятельной цепи и может подвергаться двухфотонной микроскопии на основе живой визуализации в течение 24 ч на частоте каждые 20 мин8 . Здесь описан подробный протокол эксплантной культуры и визуализации. Эксплантная система обеспечивает мощный метод изучения сборки обонятельной цепи и, возможно, других цепей в центральном мозге.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка реагентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы в этом протоколе выполняются при комнатной температуре (20-25 °C), если не указано иное.

  1. Чтобы подготовить чашку для культивирования для иммобилизации экспланта во время временной съемки, положите Сильвард толщиной 0,5 см (тщательно смешайте два жидких компонента в соотношении 10:1 перед использованием) на нижнюю поверхность чашки Петри размером 60 мм х 15 мм и дайте ей затвердеть в течение 48 ч при комнатной температуре (рисунок 2A, называемый пластиной Сильварда в следующем тексте).
  2. Чтобы подготовить микроштифты для иммобилизации экспланта на этой пластине, используйте пару щипцов, чтобы наклеить несколько микроштифтов на ленту с острыми концами, выровненными с одной стороны (рисунок 2B). Используйте ножницы, чтобы отрезать ~ 2 мм от острых концов микроштифтов (рисунок 2B'). Используйте щипцы, чтобы удерживать вырезанные микроштифты и вставлять в слой Sylgard готовую пластину Sylgard (рисунок 2C). Два микроштифта используются для иммобилизации одного эксплантата.
  3. Используйте щетку для сбора белых куколок, которые образуют пупарий в течение 1 ч, из hsFLP, гальки-GAL4/+; UAS-FRT100-stop-FRT 100-mCD8-GFP 8 генотипа и перенос их на новые флаконы. Тепловой удар в водяной бане при температуре 37 °C в течение 40 мин, чтобы вызвать разреженные клоны ORN из случайных типов. После теплового шока поставьте флаконы при 25 °C в течение 30 ч, в результате чего куколки состарятся через 30 ч после образования пупариума (APF).
  4. Чтобы подготовить культуральную среду для эксплантата, добавьте 5 мл пенициллина-стрептомицина (10 000 Ед/мл) к 500 мл среды дрозофилы Шнайдера. Отфильтруйте среду и сделайте 45 мл аликвот в конических пробирках по 50 мл. Среду можно хранить при 4 °C в течение 1-2 месяцев.
  5. В день визуализации возьмите одну трубку 45 мл среды Drosophila Schneider и добавьте 5 мл фетальной бычьей сыворотки (10% v/v), 125 мкл 4 мг/мл раствора человеческого инсулина (конечная концентрация 10 мкг/мл), 50 мкл 1 мг/мл 20-гидроксиэкдизонового раствора, растворенного в этаноле (конечная концентрация 1 мкг/мл). Хорошо перемешайте и переложите 15 мл полной среды в новую коническую трубку объемом 50 мл. Остальная часть полной среды может храниться при 4 °C в течение недели. Фетальная бычья сыворотка, раствор человеческого инсулина и 20-гидроксиэкдизоновый раствор аликотируются и хранятся при -20 °C.
  6. Насыщают кислородом полную среду объемом 15 мл, перекачивая пузырьки кислорода из кислородного баллона под поверхность жидкости через стерильный наконечник пипетки 5 мл со скоростью один пузырь/с в течение 20-30 мин. Используйте парафиновую пленку, чтобы закрыть отверстие трубки во время этого процесса.
  7. Стерилизуют поверхность рассеченной скважины и пластину Сильварда (с микроштырями, вставленными на слой Сильварда, приготовленные на стадиях А1 и А2) 70% этанолом. Дайте им высохнуть перед использованием.

2. Эксплантное рассечение

  1. С помощью щетки перенести 30 ч АПФ (через 30 ч после образования пупариума) куколок на бумажную салфетку и высушить наружную поверхность куколок в течение 5 мин.
  2. Положите кусок двусторонней ленты на стеклянную горку. Аккуратно прикрепите высушенные куколки к липкой поверхности ленты спинной стороной, обращенной вверх. Осторожно прижмите куколок щеткой, чтобы помочь вентральной стороне куколок хорошо прикрепиться к ленте (рисунок 3А). Не повреждайте куколку.
  3. Используйте пару щипцов, чтобы удалить коричневый корпус куколки, покрывающий спинную сторону головы (рисунок 3A,B). Вставьте один острый кончик щипцов между коричневым футляром куколки и куколкой с боковой стороны и осторожно разбейте коричневый футляр куколки через линию к заднему концу куколки (рисунок 3B, C). Откройте коричневый футляр для куколок. Используйте пару щипцов, чтобы осторожно удерживать куколку и хорошо переносить на рассечение 1 мл насыщенной кислородом полной среды. Погрузите плавающую куколку на среднюю поверхность, чтобы помочь ей опуститься на дно колодца (рисунок 3D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не вставляйте кончик щипцов слишком глубоко внутрь коричневого корпуса куколки, чтобы предотвратить травмирование куколки щипцами.
  4. Чтобы рассечение усиков-мозгового эксплантата от куколки, используйте щипцы, чтобы осторожно удерживать куколку одной рукой, и используйте пару микросублиц, чтобы вырезать небольшое отверстие с задней стороны куколки другой рукой (рисунок 3E). Это небольшое отверстие высвобождает высокое давление внутри куколки.
  5. Прорежьте вентральную среднюю линию куколки от отверстия до шейки (узкая структура, соединяющая голову и грудную клетку) с помощью микросублиц (рисунок 3F). Затем прорежьте окружность шеи, чтобы отделить голову от тела куколки (рисунок 3G). Извлеките тело и поместите его в другой колодец.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не режьте шею непосредственно с дорсальной/вентральной стороны куколки, которая может сдавить мозг.
  6. Вырежьте прозрачную кутикулу, которая покрывает дорсальную сторону мозга (рисунок 3H). Это обнажит жировое тело на вершине мозга. Держите немного кутикулы, к которой прикрепляются сетчатка и усики. Повторите ту же процедуру на вентральной стороне мозга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не вставляйте лезвие ножниц слишком глубоко под кутикулу, так как это приведет к разрыву антеннальных нервов, соединяющих усики и мозг (рисунок 3H').
  7. Используйте пипетку P10, чтобы аккуратно вымыть жировое тело, которое покрывает мозг и усики, пипетируя среду к открытым областям на спинной и вентральной сторонах головы (рисунок 3I).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте очень осторожны при пипетке среды, так как мозг может быть легко отделен от кутикулы. Убедитесь, что все жировое тело удалено на этом этапе. Замедленное развитие аксонов ORN наблюдалось, когда жировое тело плохо очищалось, вероятно, из-за плохого доступа кислорода из среды.
  8. Чтобы изучить взаимодействие двусторонних аксонов ORN или аксонов ORN с нацеливанием PN-дендрита, на этом этапе8 (рисунок 3J) разорвать один или два антенных нерва с микросублицаторами. Аккуратно поместите лезвия ножниц между кутикулой и мозгом и перережьте заинтересованные антеннальные нервы.
  9. Чтобы перенести рассеченный эксплант на пластину Сильварда, поместите каплю насыщенной кислородом полной среды (~ 200 мкл) на поверхность Сильварда. Покройте внутреннюю поверхность кончика пипетки шириной 200 мкл толстым телом из рассеченного ствола (шаг 1.6), несколько раз пипетировав жировое тело, что предотвращает экспланты от торчания наконечника пипетки во время переноса. Затем используйте этот широкий наконечник пипетки для переноса эксплантата из рассеченного колодца в среднюю каплю на культуральной пластине (рисунок 3K).
  10. Используйте щипцы, чтобы закрепить эксплант на слое Сильварда в двух оптических долях (рисунок 3L). Осторожно расположите пластину Сильварда на станции визуализации и обездвижите пластину лентами. Медленно добавьте 10 мл насыщенной кислородом полной среды к пластине Сильварда с помощью пипетки P1000.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте разрушения экспланта при добавлении среды к пластине Сильварда.

3. Двухфотонная микроскопия на основе живой визуализации

  1. Для выполнения покадровой визуализации используйте двухфотонный микроскоп, лазер Ti:Sapphire, 20-кратный объектив с погружением в воду (1,0 NA) и программное обеспечение для визуализации. Используйте длину волны возбуждения при 920 нм для визуализации белков GFP. Отрегулируйте время выдержки пикселя до 10 мкс.
  2. Отрегулируйте положение станции визуализации так, чтобы экспланты находились примерно под целью. Используйте 70% этанол для стерилизации хрусталика перед визуализацией. Медленно опустите цель под среду, близкую к эксплантам. Проверьте, есть ли пузырь на объективе объектива.
    1. Если это так, поднимите цель над средой и повторяйте это, пока пузырь не исчезнет. Найдите экспланты с помощью окуляра и центрируйте один эксплант в поле.
  3. Чтобы обеспечить эксплант с несколькими ORN, разреженно помеченными для замедленной съемки, каждый раз рассекайте ~ 10 эксплантов и выравнивайте по оси y на культуральной пластине. Экранируйте все экспланты, перемещая цель вдоль оси y, и выберите эксплант, в котором несколько одиночных аксонов ORN только что достигли антенной доли для визуализации (рисунок 4A).
    1. Распознайте антеннальную долю по ее овальной форме и аксонам ORN, которые начинают ее обходить. Изображение области ~150 мкм x 150 мкм в плоскости xy (3-кратный зум с 20-кратным объективом). Оцените границу двух антенных долей и центрируйте их в области визуализации.
  4. Выберите начальную область изображения вдоль оси z, определив нижнюю и верхнюю секции сканирования. Настройка области изображения вдоль оси z. Установите самый глубокий участок с сигналами аксона ORN в качестве первого сеанса визуализации и сеанс на 100 мкм выше (более поверхностная сторона) в качестве последнего сеанса визуализации (рисунок 4B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это оставляет некоторые участки на верхней (поверхностной стороне) аксонов ORN и позволяет избежать смещения аксонов ORN вверх за пределами области визуализации из-за роста мозга во время культивирования.
    1. Изображение с интервалом 2 мкм. Установите автоматическое сканирование изображений на частоте каждые 20 минут с помощью программного обеспечения для обработки изображений.
  5. Переместите область изображения на 20 мкм вверх вдоль оси z после первого 4-часового изображения и еще на 20 мкм вверх вдоль оси z после 16-часового изображения. Это может быть достигнуто путем установки сценария и различных стеков z в программном обеспечении для создания образов.
  6. Культивируйте эксплант в течение дополнительного периода после визуализации (до 24 ч ex vivo) перед фиксацией и окрашиванием N-кадгерином, маркером нейропила, чтобы выявить генетическую идентичность каждого отдельного ОРН по клубочку, на который он нацелен.

4. Обработка изображений

  1. Чтобы обработать изображения стека z из серий разделов, сделанных в каждой точке времени с помощью программного обеспечения Fiji, откройте серию разделов изображений, нажмите на Image | Стеки | Z проект [/].
  2. Чтобы исправить боковой дрейф образца во время культивирования, установите плагин TurboReg на Фиджи.
    1. Откройте серию изображений стека z и одно изображение стека z из серии. Открыть плагины | Регистрационный | ТурбоРег.
    2. Выберите серию изображений стека z в Source и одно изображение стека z в Target | Перевод. Нажмите на кнопку Batch , чтобы зарегистрировать все изображения из открытой серии изображений стека z.
  3. Чтобы максимизировать полезность образных образцов, отделяйте разреженно помеченные одиночные аксоны в непосредственной близости друг от друга от изображений стека z после разделов 3D-изображений.
    1. Чтобы извлечь отдельные аксоны ORN из нескольких аксонов в одном изображении, откройте серию разделов изображений, нажмите на Плагины | | сегментации Редактор сегментации [/]. Выберите инструмент «Кисть» и маскируйте интересующий orN аксон в рабочем окне редактора сегментации , используя кнопки «+» или «-» в каждом разделе изображения.
    2. Нажмите на | процесса Калькулятор изображений [/]. Выберите «Изображение X» на рисунке 1, « Умножение» в действии, «Изображение X. метки» на рисунке 2, [/]. При этом создается новый файл серии изображений только с заинтересованным аксоном. Выполните шаг 4.1 для обработки образа стека z. Повторите этот шаг для всех временных точек, чтобы создать файл изображения временных рядов.
  4. Чтобы псевдокрасить различные аксоны из одного и того же изображения, сначала выполните шаг 4.3, чтобы создать файл изображения временных рядов каждого аксона отдельно. Откройте файлы образов временных рядов для разных одиночных аксонов из одного и того же изображения необработанных данных. Нажмите на | изображений Цвет | Объединение каналов. Выберите разные файлы изображений временных рядов в разных цветовых каналах и нажмите кнопку «ОК».

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Аксоны ORN поступают в антенную долю между 18 ч и 36 ч APF. Затем они перемещаются по антенной доле, пересекают среднюю линию и иннервируют клубочки. Видео 1 представляет собой репрезентативное видео, показывающее весь процесс для нескольких индивидуально идентифицируемых аксонов, снятое с частотой каждые 20 минут в течение 24 часов. Перед регистрацией с помощью TurboReg аксоны демонстрируют некоторый боковой дрейф по мере развития мозга (первая половина видео). После регистрации дрифтинг исправляется (в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Drosophila antennae-brain explant сохраняет нормальное нацеливание обонятельной цепи. Мы заметили, что разработка в 2 раза медленнее ex vivo по сравнению с in vivo. Отмечается, что эксплантная система не удерживает верхнечелюстную пальпу, в которой размещены шесть типов ОРН. Чтобы обеспечить нормальное развитие ex vivo, необходимо избегать растяжения антеннальных нервов во время эксплантного рассечения. Во время культивирования ex vivo рост бактерий обычно вызывает замедленное...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Н. Озеля и Р. Хизингера за их советы по культуре экспланта; М. Вагнеру за техническую помощь в двухфотонной микроскопии; D.J. Luginbuhl для генерации трансгенных мух; Д. Фридманна за предложения по анализу программного обеспечения Фиджи; Y. Ge за помощь в работе на лету; К. Маклафлин и К.К.Л. Вонг за комментарии к рукописи. Л.Л. является исследователем Медицинского института Говарда Хьюза. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения 1K99DC01883001 (для T.L.) и R01-DC005982 (для L.L.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
20-гидроксиэкдизонSigmaH5142
Chameleon Ti:Сапфировый лазерКогерентныйкогерентный MRU X1
Фетальная бычья сывороткаThermo Fisher Scientific10082147
Человеческий инсулинThermo Fisher Научное12585014
программное обеспечение для визуализацииPrairie
Micro ScissorsWorld Precision Instruments501778
Minutien PinsFine Science Tools26002-10
Кислородный баллонPraxairOX M-E
Пенициллин-стрептомицинThermo Fisher Scientific15140122
Schneider' s Drosophila MediumThermo Fisher Scientific21720024
SYLGARD 184 Силиконовый эластомерThermo Fisher ScientificNC0162601
Двухфотонная микроскопияBruker
водно-иммерный объектив (20X)Zeiss421452-9800-000

Ссылки

  1. Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 3 (6), 001727(2011).
  2. Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annual Review Neuroscience. 30, 505-533 (2007).
  3. Hong, W., Luo, L. Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system. Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).
  4. Bentley, D., Caudy, M. Pioneer axons lose directed growth after selective killing of guidepost cells. Nature. 304 (5921), 62-65 (1983).
  5. Godement, P., Wang, L. C., Mason, C. A. Retinal axon divergence in the optic chiasm: dynamics of growth cone behavior at the midline. Journal of Neuroscience. 14 (11), Pt 2 7024-7039 (1994).
  6. Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo. Development. 101 (1), 123-133 (1987).
  7. Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, 10721(2015).
  8. Li, T., et al. Cellular bases of olfactory circuit assembly revealed by systematic time-lapse imaging. Cell. 184, 5107-5121 (2021).
  9. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998(2014).
  10. Liu, T. L., et al. Observing the cell in its native state: Imaging subcellular dynamics in multicellular organisms. Science. 360 (6386), (2018).
  11. Wang, K., et al. Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes. Nature Methods. 11 (6), 625-628 (2014).
  12. Kohl, J., et al. Ultrafast tissue staining with chemical tags. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111 (36), 3805-3814 (2014).
  13. Sutcliffe, B., et al. Second-Generation Drosophila Chemical Tags: Sensitivity, Versatility, and Speed. Genetics. 205 (4), 1399-1408 (2017).
  14. Grimm, J. B., Brown, T. A., English, B. P., Lionnet, T., Lavis, L. D. Synthesis of Janelia Fluor HaloTag and SNAP-Tag Ligands and Their Use in Cellular Imaging Experiments. Methods Molecular Biology. 1663, 179-188 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Drosophila

Похожие статьи