Методическая статья

Проточный цитометрический анализ для идентификации врожденных и адаптивных иммунных клеток мышиных легких

DOI:

10.3791/62985

⸱

16 ноября 2021 г.

 ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology-Oncology, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 2Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 3Harvard College

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы представляем эффективный и воспроизводимый протокол для изоляции иммунных популяций дыхательной системы мышей. Мы также предоставляем метод идентификации всех врожденных и адаптивных иммунных клеток, которые находятся в легких здоровых мышей, с помощью 9-цветной панели проточной цитометрии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дыхательные пути находятся в непосредственном контакте с внешней средой и требуют точно регулируемой иммунной системы для обеспечения защиты при подавлении нежелательных реакций на антигены окружающей среды. Легкие содержат несколько популяций врожденных и адаптивных иммунных клеток, которые обеспечивают иммунный надзор, но также опосредуют защитные иммунные реакции. Эти клетки, которые поддерживают здоровую легочную иммунную систему в равновесии, также участвуют в нескольких патологических состояниях, таких как астма, инфекции, аутоиммунные заболевания и рак. Селективная экспрессия поверхностных и внутриклеточных белков обеспечивает уникальные иммунофенотипические свойства иммунным клеткам легкого. Следовательно, проточная цитометрия играет важную роль в идентификации таких клеточных популяций во время стационарных и патологических состояний. В этой статье представлен протокол, который описывает последовательный и воспроизводимый метод идентификации иммунных клеток, которые находятся в легких здоровых мышей в стационарных условиях. Тем не менее, этот протокол также может быть использован для выявления изменений в этих клеточных популяциях в различных моделях заболеваний, чтобы помочь идентифицировать специфические для заболевания изменения в иммунном ландшафте легких.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мышиные дыхательные пути содержат уникальную иммунную систему, отвечающую за борьбу с патогенами и поддержание иммунного гомеостаза. Легочная иммунная система состоит из клеточных популяций со значительной гетерогенностью по фенотипу, функции, происхождению и расположению. Резидентные альвеолярные макрофаги (АМ), происходящие в основном из моноцитов плода, находятся в альвеолярном просвете1, в то время как интерстициальные макрофаги (ИМ), полученные из костного мозга, находятся в паренхиме легких2. IM могут быть дополнительно подклассифицированы выражением CD206. CD206+ IM заполняют перибронхиальную и периваскулярную область, в то время как CD206-IM расположены в альвеолярном интерстиции3. Недавно было предложено несколько подклассификаций ИМ3,4,5,6. Хотя ИМ менее изучены, чем АМ, последние данные подтверждают их решающую роль в регуляции иммунной системы легких7. Кроме того, CD206 также выражается в альтернативно активированных AMs8.

Легочные дендритные клетки (ДК) являются еще одной гетерогенной группой иммунных клеток легких в отношении их функциональных свойств, местоположения и происхождения. В легких были описаны четыре подкатегории ДК: обычные CD103+ DC (также известные как cDC1), обычные CD11b+ DC (также известные как cDC2), моноцитарные ДК (MoDC) и плазмоцитоидные DC9,10,11,12,13. Первые три подкласса можно определить как основной комплекс гистосовместимости (MHC) II+CD11c+9,10,14,15. Плазмоцитоидные ДК экспрессируют MHC II и являются промежуточными положительными для CD11c, но экспрессируют высокие уровни B220 и PDCA-19,13,16. В наивных мышиных легких CD103 DC и CD11b DC расположены в интерстиции дыхательных путей, тогда как плазмоцитоидные ДК расположены в альвеолярном интерстиции17.

Две основные популяции моноцитов находятся в легких во время устойчивого состояния: классические моноциты и неклассические моноциты. Классические моноциты являются Ly6C+ и имеют решающее значение для первоначальной воспалительной реакции. Напротив, неклассические моноциты являются Ly6C- и широко рассматриваются как противовоспалительные клетки3,16,18. Недавно была описана дополнительная популяция моноцитов CD64 +CD16.2+, которые происходят из Ly6C-моноцитов и дают начало CD206+ IMs3.

Эозинофилы в основном появляются в легких во время гельминтной инфекции или аллергических состояний. Тем не менее, существует небольшое количество эозинофилов в легочной паренхиме во время устойчивого состояния, известных как резидентные эозинофилы. В отличие от резидентных эозинофилов, воспалительные эозинофилы обнаруживаются в интерстиции легких и бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ). В мышиных моделях клеща домашней пыли (HDM) воспалительные эозинофилы набираются в легкие после антиген-опосредованной стимуляции. Было высказано предположение, что резидентные эозинофилы могут играть регулирующую роль в аллергии, ингибируя сенсибилизацию Т-хелпера 2 (Th2) к HDM19.

В отличие от остальных легочных миелоидных клеток, нейтрофилы экспрессируют Ly6G, но не CD68, и характеризуются сигнатурой иммунофенотипа CD68-Ly6G+16,20,21. Исследования визуализации показали, что в установившемся состоянии легкое резервирует пул нейтрофилов во внутрисосудистом компартменте и содержит значительное количество внесосудистых нейтрофилов22. Подобно эозинофилам, нейтрофилы не обнаруживаются в БАЛ в установившемся состоянии; однако несколько форм иммунной стимуляции, таких как вызов ЛПС, астма или пневмония, загоняют нейтрофилы в альвеолярный просвет, что приводит к их присутствию в BAL21,22,23.

Значительное количество CD45+ клеток легких представляют собой естественный киллер (NK), Т-клетки и В-клетки и являются отрицательными для большинства миелоидных маркеров24. В легких наивных мышей эти три типа клеток могут быть идентифицированы на основе экспрессии CD11b и MHC II18. Около 25% легочных CD45+ клеток являются В-клетками, тогда как процент NK-клеток выше в легких, чем в других лимфоидных и нелимфоидных тканях24,25,26. Среди легочных Т-клеток значительную долю составляет CD4-CD8- и играет важную роль при респираторных инфекциях26.

Поскольку в легких находится очень сложная и уникальная иммунная система, было разработано несколько стратегий идентификации иммунных клеток легких16,18,20,27. Стратегия гатинга, описанная в настоящем описании, обеспечивает комплексный и воспроизводимый способ идентификации до 12 различных легочных миелоидных и немиелоидных иммунных популяций с использованием 9 маркеров. Для проверки результатов использовались дополнительные маркеры. Кроме того, предусмотрен подробный способ получения одноклеточной суспензии, которая минимизирует гибель клеток и позволяет идентифицировать наиболее полный профиль иммунно-клеточного компартмента легкого. Следует отметить, что идентификация неиммунных клеток легких, таких как эпителиальные клетки (CD45-CD326+CD31-), эндотелиальные клетки (CD45-CD326-CD31+) и фибробласты, требует иного подхода28,29. Идентификация таких популяций не включена в протокол и метод, описанные здесь.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все исследования и эксперименты, описанные в этом протоколе, были проведены в соответствии с руководящими принципами в соответствии с Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Медицинского центра Бет Исраэль Диаконисс. Для разработки этого протокола использовались мыши C57BL/6 любого пола в возрасте от шести до десяти недель.

1. Хирургическое иссечение и подготовка тканей

  1. Эвтаназить мышь путем внутрибрюшинного введения 1 мл трибромэтанола (приготовленного по стандартному протоколу; Таблица материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует избегать асфиксии CO2 в исследованиях легких, поскольку она может вызвать повреждение легких и изменить особенности и свойства иммунных клеток легких. Следует также избегать вывиха шейки матки, так как он может привести к механическому повреждению легкого.
  2. Перенесите мышь в чистую и выделенную область для хирургической операции.
  3. Стабилизируйте спинную сторону мыши вниз с помощью игл или ленты на четырех конечностях. Используйте 70% этанол для дезинфекции кожи вентральной области.
  4. Выполните разрез на коже, от шеи до живота. Аккуратно удалите кожу с грудного отдела.
  5. Осторожно удалите грудину и ребра.
  6. Промывайте легкие, вводя 10 мл холодного PBS непосредственно в правый желудочек, используя иглу 18-21 G, пока легкие не станут полностью белыми.
  7. Осторожно удалите тимус и сердце, не касаясь легких.
  8. Осторожно отделяют легкие от окружающих тканей и переносят их в трубку с холодным буфером BSA (табл. 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует приложить усилия, чтобы удалить весь соседний жир из легких перед дальнейшим приготовлением одноклеточной суспензии, так как это может привести к смещению показаний.

2. Приготовление одноклеточной суспензии

  1. Переложите легкие в пустую чашку Петри и измельчите их двумя тонкими скальпелями. Переложите все кусочки измельченного легкого в новую коническую трубку объемом 50 мл. Используйте 5 мл буфера пищеварения, чтобы промыть пластину и добавить ее в 50 мл пробирку, содержащую измельченное легкое (таблица 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер пищеварения должен быть приготовлен непосредственно перед использованием. Используйте 5 мг/мл коллагеназы28. Сочетание 1 или 5 мг коллагеназы с буфером BSA или безбелковым PBS не улучшило результаты (дополнительный рисунок S1).
  2. Закрепите крышку трубки и переваривайте легкое в течение 30 мин на орбитальном шейкере со скоростью 150 об/мин при 37 °C. Остановите реакцию, добавив 10 мл холодного буфера BSA.
  3. После пищеварения используйте иглу 18 г, чтобы смешать и растворить кусочки легких. Поместите фильтрующий фильтр 70 мкм в верхнюю часть новой конической трубки объемом 50 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование меньшего микронного фильтра может привести к потере основных миелоидных популяций.
  4. Медленно перенесите переваренную легочную смесь непосредственно на ситечко. Используйте резиновую сторону плунжера шприца объемом 10 мл, чтобы разбить оставшиеся легкие куски на фильтре. Промывайте обработанный материал на фильтре с буфером BSA.
  5. Центрифугируют одноэлементную суспензию при 350 × г в течение 8 мин при 4 °С.
  6. Осторожно отбросьте супернатант и повторно суспендируйте клетки в 1 мл буфера лизиса ACK. Хорошо перемешать, используя пипетку объемом 1 мл, и инкубировать в течение 90 с при комнатной температуре.
  7. Добавьте 10 мл холодного буфера BSA, чтобы остановить реакцию, и центрифугу при 350 × г в течение 7 мин при 4 °C. Осторожно выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу в буфер окрашивания для подсчета клеток с помощью гемоцитометра.
  8. Повторно суспендируют клетки в концентрации 5 × 106 клеток/мл и используют их для окрашивания поверхности (см. раздел 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого поместите клетки в 96-луночную пластину с круглым дном с последующим окрашиванием антителами и промывкой. Если пластинчатая центрифуга недоступна, используйте проточные трубки вместо пластин. С помощью этого протокола ~ 15-20 × 106 клеток на легкое может быть получено от 6-10-недельной мыши C57BL/6 среднего размера.

3. Окрашивание поверхности антителами

  1. Перенесите 1 × 106 ячеек по 200 мкл на скважину в 96-луночную пластину. Центрифугировать пластину при 350 × г в течение 7 мин при 4 °C. Тем временем готовят раствор Fc-блока путем разбавления антитела анти-16/32 (1:100) в буфере окрашивания (таблица 1).
  2. Повторно суспендируют клетки в 50 мкл предварительно приготовленного Fc-блокирующего раствора (Таблица материалов) и инкубируют в течение 15-20 мин при 4 °С или на льду.
  3. Добавьте 150 мкл окрашивающего буфера и центрифугируйте пластину при 350 × г в течение 5 мин при 4 °C. Тем временем готовят коктейль поверхностных антител путем разбавления поверхностных антител (1:100; Таблица 2) в буфере окрашивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: (i) Антитело анти-16/32 для Fc-блокировки может быть использовано с поверхностными антителами в той же смеси. ii) Если используется краситель для поправимой жизнеспособности, добавьте его в коктейль поверхностных антител в разведении 1:1000.
  4. Повторно суспендируют клетки в 50 мкл предварительно приготовленного поверхностного коктейля антител и инкубируют в течение 30-40 мин при 4 °С в темноте. Дважды промыть клетки с помощью окрашивающего буфера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если внутриклеточное окрашивание не требуется, повторно суспендируют клетки в 200 мкл окрашивающего буфера и приступают непосредственно к сбору данных о проточном цитометре. Альтернативно, ячейки могут быть зафиксированы и сохранены при 4 °C для последующего приобретения. Мы рекомендуем использовать клетки для проточной цитометрии в течение 24 ч.

4. Клеточная фиксация и внутриклеточное окрашивание

  1. Подготовьте буфер фиксации/пермеабилизации (Fix/Perm Buffer) путем смешивания трех частей концентрата фиксации/пермеабилизации и 1 части разбавителя фиксации/пермеабилизации набора буферов окрашивания FoxP3/транскрипционного фактора (таблица 1).
  2. Повторно суспендируют клетки в 50 мкл предварительно подготовленного буфера Fix/Perm на скважину 96-луночной пластины, где клетки были покрыты, как описано в разделе 3, и инкубируют их в течение 20-25 мин при 4 °C в темноте.
  3. Разбавьте 10-кратный буфер пермеабилизации как 1:10 в очищенной деионизированной воде для приготовления 1x буфера пермеабилизации.
  4. Вымойте ячейки один раз с помощью 1x буфера пермеабилизации. Тем временем готовят коктейль внутриклеточных антител путем разбавления внутриклеточных антител (1:100) в 1 мл буфера пермеабилизации.
  5. Повторно суспендируют клетки, используя 50 мкл предварительно подготовленного коктейля поверхностных антител на клетку 96-луночной пластины, и инкубируют в течение 40 мин при 4 °C в темноте.
  6. Промыть клетки один раз с буфером пермеабилизации и один раз с буфером окрашивания. После окончательной промывки повторно суспендируйте клетки в 200 мкл окрашивающего буфера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если проточный цитометр с пластинчатым считывателем отсутствует, перенесите клетки в проточные цитометрические трубки.
  7. Приобретите минимум 1,5 × 106 клеток на образец на проточном цитометре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для одиночных цветов и неиспорченных контрольных образцов будет достаточно 0,5-1 × 106 ячеек на образец. Рекомендуется титровать отдельные антитела, используемые для достижения оптимального окрашивания и снижения затрат. Данный протокол оптимизирован с использованием Fix/Perm Buffer, подготовленного с использованием набора буферов окрашивания FoxP3. Поскольку CD68 является цитоплазматическим, а не ядерным маркером, могут быть достаточными другие растворы для пермеабилизации, такие как низкая концентрация параформальдегида или наборы цитофикса / цитоперма от различных поставщиков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стратегия гейтинга
Первым шагом нашей стратегии гаширования является исключение мусора и дублетов (рисунок 1А). Тщательное исключение дублетов имеет решающее значение для предотвращения ложноположительных популяций (дополнительный рисунок S2). Затем иммунные клетки идентифицируются с использованием CD45+, маркера для кроветворных клеток (рисунок 1B). Живое мертвое пятно может быть добавлено, чтобы исключить мертвые...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Идентификация легочных иммунных клеток может быть сложной задачей из-за нескольких типов иммунных клеток, находящихся в легких, и их уникальных иммунофенотипических характеристик по сравнению с их аналогами, находящимися в других тканях. При некоторых патологических состояниях клетки с отчетливыми фенотипическими особенностями появляются в легких. Например, повреждение легких, вызванное блеомицином, приводит к набору циркулирующих макрофагов, полученных из моноцитов, в альвеолярном пространстве, где они могут оставаться ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

V.A.B. имеет патенты на путь PD-1, лицензированные Bristol-Myers Squibb, Roche, Merck, EMD-Serono, Boehringer Ingelheim, AstraZeneca, Novartis и Dako. Авторы не заявляют о каких-либо других конкурирующих финансовых интересах.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами NIH R01CA238263 и R01CA229784 (VAB).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Поршень шприца 10 млEXELINT26265
18 G иглыBD Precision Glide Needle305165
21 G иглыBD Precision GlideNeedle 305195
50 мл конические трубкиFalcon3520
70; m клеточный фильтрThermoFisher22363548
96-луночные планшетыFalcon/corning3799
ACK лизирующий буферThermoFisherA10492-01
антимышиный CD11bBiolegend101215Подробнее смотрите в таблице 2
антимышиный CD11cBiolegend117339/117337Подробнее смотрите в таблице 2
антимышиный CD45Biolegend103115Подробнее см. Таблицу 2
антимышь CD64Biolegend139319Таблица 2
антимышь CD68Biolegend137009Таблица 2
антимышь GR-1Biolegend108433Таблица 2
антимышь Siglec FBiolegend155503Таблица 2
АВЕРТИНСигма-Олдрич240486
В220Биолегенда103228Подробнее см. Таблицу 2
Бычий сывороточный альбумин (БСА)Сигма-Олдрич9048-46-8
CD103Биолегенда121405/121419Подробнее см. Таблицу 2
CD24Биолегенда138503Подробнее см. Таблицу
2 CD3Биолегенда100205Подробнее см. Таблица 2
Центрифуга
Коллагеназа Тип 1Worthington Biochemical CorpLS004196
CX3CR1Biolegend149005Подробнее см. Таблица 2
DNase IMillipore Sigma10104159001
Этанол
F4/80Biolegend123133Подробнее см. Таблицу 2
FcBlock (CD16/32)Biolegend101301Подробнее см. Таблицу 2
Фетальная бычья сывороткаR& D Systems
Тонко зазубренные щипцыRoboz Surgical Instrument Co
Foxp3 / Буферный набор для окрашивания транскрипционного фактораThermoFisher00-5523-00
Futura Safety ScalpelMerit Medical SystemsSMS210
Живой/мертвый исправимый далеко читаемый набор для окрашивания мертвых клетокThermoFisherL34973Подробнее см. Таблицу 2
MERTKBiolegend151505Подробнее см. Таблицу 2
MHC-IIBiolegend107621Подробнее см. Таблицу 2
NK1.1Biolegend108705Подробнее см. Таблицу 2
Орбитальный шейкерVWRModel 200
Чашка ПетриFalcon351029
Охлаждаемая настольная центрифугаSORVAL ST 16R
Маленькие изогнутые ножницыRoboz Surgical Instrument Co

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. Journal of Experimental Medicine. 210 (10), 1977-1992 (2013).
  2. Tan, S. Y., Krasnow, M. A. Developmental origin of lung macrophage diversity. Development. 143 (8), 1318-1327 (2016).
  3. Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nature Communications. 10 (1), 3964(2019).
  4. Gibbings, S. L., et al. Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).
  5. Ural, B. B., et al. Identification of a nerve-associated, lung-resident interstitial macrophage subset with distinct localization and immunoregulatory properties. Science Immunology. 5 (45), 8756(2020).
  6. Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), (2019).
  7. Liegeois, M., Legrand, C., Desmet, C. J., Marichal, T., Bureau, F. The interstitial macrophage: A long-neglected piece in the puzzle of lung immunity. Cellular Immunology. 330, 91-96 (2018).
  8. Stouch, A. N., et al. IkappaB kinase activity drives fetal lung macrophage maturation along a non-M1/M2 paradigm. Journal of Immunology. 193 (3), 1184-1193 (2014).
  9. Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).
  10. Plantinga, M., et al. Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen. Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).
  11. Liu, H., et al. Dendritic cell trafficking and function in rare lung diseases. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (4), 393-402 (2017).
  12. Cook, P. C., MacDonald, A. S. Dendritic cells in lung immunopathology. Seminars in Immunopathology. 38, 449-460 (2016).
  13. Guilliams, M., Lambrecht, B. N., Hammad, H. Division of labor between lung dendritic cells and macrophages in the defense against pulmonary infections. Mucosal Immunology. 6 (3), 464-473 (2013).
  14. Nobs, S. P., et al. PPARγ in dendritic cells and T cells drives pathogenic type-2 effector responses in lung inflammation. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 3015-3035 (2017).
  15. Aegerter, H., et al. Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection. Nature Immunology. 21 (2), 145-157 (2020).
  16. Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (4), 503-510 (2013).
  17. Hoffmann, F. M., et al. Distribution and interaction of murine pulmonary phagocytes in the naive and allergic lung. Frontiers in Immunology. 9, 1046(2018).
  18. Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606(2016).
  19. Mesnil, C., et al. Lung-resident eosinophils represent a distinct regulatory eosinophil subset. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3279-3295 (2016).
  20. Zaynagetdinov, R., et al. Identification of myeloid cell subsets in murine lungs using flow cytometry. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 180-189 (2013).
  21. Tavares, A. H., Colby, J. K., Levy, B. D., Abdulnour, R. E. A model of self-limited acute lung injury by unilateral intra-bronchial acid instillation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60024(2019).
  22. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  23. Krishnamoorthy, N., et al. Neutrophil cytoplasts induce TH17 differentiation and skew inflammation toward neutrophilia in severe asthma. Science Immunology. 3 (26), (2018).
  24. Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. Journal of Leukocyte Biology. 84 (6), 1400-1409 (2008).
  25. Wang, J., et al. Lung natural killer cells in mice: phenotype and response to respiratory infection. Immunology. 137 (1), 37-47 (2012).
  26. Cowley, S. C., Meierovics, A. I., Frelinger, J. A., Iwakura, Y., Elkins, K. L. Lung CD4-CD8- double-negative T cells are prominent producers of IL-17A and IFN-gamma during primary respiratory murine infection with Francisella tularensis live vaccine strain. Journal of Immunology. 184 (10), 5791-5801 (2010).
  27. Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and characterization of mononuclear phagocytes in the mouse lung and lymph nodes. In Lung innate immunity and inflammation. Methods in Molecular Biology. Alper, S., Janssen, W. 1809, Humana Press. New York, NY. (2018).
  28. Singer, B. D., et al. Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), 796-801 (2016).
  29. Matsushima, S., et al. CD248 and integrin alpha-8 are candidate markers for differentiating lung fibroblast subtypes. BMC Pulmonary Medicine. 20 (1), 21(2020).
  30. Cong, J., Wei, H. Natural killer cells in the lungs. Frontiers in Immunology. 10, 1416(2019).
  31. Daubeuf, F., et al. A fast, easy, and customizable eight-color flow cytometric method for analysis of the cellular content of bronchoalveolar lavage fluid in the mouse. Current Protocols in Mouse Biology. 7 (2), 88-99 (2017).
  32. Yi, S., et al. Eosinophil recruitment is dynamically regulated by interplay among lung dendritic cell subsets after allergen challenge. Nature Communications. 9 (1), 3879(2018).
  33. Langlet, C., et al. CD64 expression distinguishes monocyte-derived and conventional dendritic cells and reveals their distinct role during intramuscular immunization. Journal of Immunology. 188 (4), 1751-1760 (2012).
  34. Moran, T. P., Nakano, H., Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A., Cook, D. N. Epigenetic control of Ccr7 expression in distinct lineages of lung dendritic cells. Journal of Immunology. 193 (10), 4904-4913 (2014).
  35. Schyns, J., Bureau, F., Marichal, T. Lung interstitial macrophages: past, present, and future. Journal of Immunology Research. 2018, 5160794(2018).
  36. Krljanac, B., et al. RELMalpha-expressing macrophages protect against fatal lung damage and reduce parasite burden during helminth infection. Science Immunology. 4 (35), (2019).
  37. Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
  38. Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. 20 (5), 571-580 (2019).
  39. Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).
  40. Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. Journal of Experimental Medicine. 214 (8), 2387-2404 (2017).
  41. Koch, C. M., Chiu, S. F., Misharin, A. V., Ridge, K. M. Lung Interstitial Macrophages: Establishing Identity and Uncovering Heterogeneity. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 7-9 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи