Микроструктурирование просвечивающих электронных микроскопических сеток для прямого позиционирования клеток в рабочих процессах криоэлектронной томографии цельноклеточной криоэлектронной томографии

С развитием, расширением и универсальностью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) исследователи изучили широкий спектр биологических образцов в почти нативном состоянии от макромолекулярного (~ 1 нм) до высокого (~ 2 Å) разрешения. Методы крио-ЭМ и электронной дифракции одной частиц лучше всего применять к очищенным макромолекулам в растворе или в кристаллическом состоянии, ^{соответственно1,2}. Принимая во внимание, что криоэлектронная томография (крио-ЭТ) уникально подходит для почти нативных структурных и ультраструктурных исследований крупных, гетерологичных объектов, таких как бактерии, плеоморфные вирусы и эукариотические ^{клетки3}. В крио-ET трехмерная (3D) информация получается путем физического наклона образца на ступени микроскопа и получения серии изображений через образец под разными углами. Эти изображения, или серии наклона, часто охватывают диапазон +60/-60 градусов с шагом от одного до трех градусов. Затем клон-ряд может быть вычислительно реконструирован в 3D-том, также известный как ^{томограмма4}.

Все крио-ЭМ методы требуют, чтобы образец был встроен в тонкий слой аморфного, некристаллического стекловидного льда. Одним из наиболее часто используемых методов криофиксации является погружная заморозка, где образец наносится на эм-сетку, промокает и быстро погружается в жидкий этан или смесь жидкого этана и пропана. Этот метод достаточен для витрификации образцов толщиной от <100 нм до ~10 мкм, включая культивируемые клетки человека, такие как ^HeLa5,6. Более толстые образцы, такие как мини-органоиды или биопсия тканей, толщиной до 200 мкм, могут быть остеклованы замораживанием под высоким ^{давлением7}. Однако из-за повышенного рассеяния электронов более толстых образцов толщина образца и льда для крио-ET ограничена ~0,5 - 1 мкм в просвечивающих электронных микроскопах 300 кВ. Таким образом, цельноклеточный крио-ET многих эукариотических клеток ограничен клеточной периферией или расширениями клеток, если не используются дополнительные этапы подготовки образца, такие как криосекционирование8 или фрезерование пучка фокусировки ионов9,10,11.

Ограничением многих экспериментов по визуализации цельноклеточного крио-ET является пропускная способность сбора ^{данных12}. В отличие от крио-ЭМ с одной частицей, где тысячи изолированных частиц часто могут быть изображены из одного квадрата сетки ТЭМ, клетки большие, разбросанные и должны выращиваться при достаточно низкой плотности, чтобы ячейки могли сохраняться в тонком слое стекловидного льда. Часто область интереса ограничивается определенным признаком или подобластью ячейки. Дальнейшим ограничением пропускной способности является склонность клеток к росту на участках, которые не поддаются визуализации ТЕА, например, на стержнях сетки ТЕА или вблизи них. Из-за непредсказуемых факторов, связанных с клеточной культурой в сетках ТЕА, необходимы технологические разработки для повышения доступности образцов и пропускной способности для сбора данных.

Микроструктурирование субстрата с помощью адгезивных белков внеклеточной матрицы (ECM) является хорошо зарекомендовавшим себя методом световой микроскопии живых клеток для направления роста клеток на жесткие, прочные и оптически прозрачные поверхности, такие как стеклянные и другие субстраты для культуры ^{тканей13,14}. Микроструктурирование также выполнялось на мягких и/или трехмерных (3D) поверхностях. Такие методы не только позволяют точно позиционировать клетки; они также поддерживают создание многоклеточных сетей, таких как узорчатые нейронно-клеточные ^цепи15. Внедрение микроструктурирования в крио-ИНОПЛАНЕТЯН не только увеличит пропускную способность, но также может открыть новые исследования для изучения сложных и динамических клеточных микросред.

В последнее время несколько групп начали использовать методы микроструктурирования на сетках ТЕА с помощью нескольких ^{подходов16,17}. Здесь описано использование метода фотоструктурирования без маски для сеток TEM с использованием системы микроструктурирования Alvéole PRIMO, которая отличается высоким разрешением и бесконтактным рисунком. С помощью этой системы микроструктурирования на верхнюю часть подложки наносится противообрастающий слой, за которым следует нанесение фотокатализатора и абляция противообрастающего слоя в пользовательских узорах с помощью УФ-лазера. Затем белки ECM могут быть добавлены к образцам для соответствующей клеточной культуры. Этот метод был использован несколькими группами для крио-ET исследований пигментного эпителия сетчатки-1 (RPE1), собачьей почки-II Мадина-Дарби (MDCKII), фибробласта крайней плоти человека (HFF) и эндотелиальных клеточных линий16,17,18. Эта система микроструктурирования совместима с несколькими противообрастающими слоями подложек, а также с жидким или гелевым реагентом фотокатализатора. Различные белки ECM могут быть выбраны и адаптированы к специфичности клеточной линии, обеспечивая универсальность для пользователя.

Микроструктурирование успешно применяется в ряде проектов в рамках ^{лаборатории19}. Здесь представлен протокол микроструктурирования, включающий специфические адаптации для изучения культивируемых клеток HeLa, инфицированных респираторно-синцитиальным вирусом (RSV) клеток BEAS-2B и первичных личиночных нейронов Drosophila melanogaster20.

Протокол, описанный здесь, представляет собой компиляцию клеточной культуры, микроструктурирования и методов визуализации, используемых лабораторией Райта и Исследовательским центром Крио-ЭМ в Университете Висконсина, Мэдисон. Рабочий процесс представлен на рисунке 1. Дополнительные учебные и инструктивные материалы доступны на следующих сайтах: https://cryoem.wisc.edu или https://wrightlab.wisc.edu

1. Подготовка сеток для выкройки

1. Переложите сетки ТЭМ на чистый стеклянный слайд, карбон стороной вверх (стандартная толщина углеродной фольги составляет 12 нм). Используя углеродный испаритель ACE600, испаряйте 5-8 нм дополнительного углерода на решетки для увеличения общей долговечности углеродной пленки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не является обязательным для сеток _SiO2 . Этот шаг также может быть сделан заранее; хранить сетки с покрытием в среде с низкой влажностью, такой как вакуумный осушитель.
2. Перенесите сетки в держатель для подготовки сетки и разряжайте тлеющие решетки углеродной стороной вверх. Используя систему тлеющего разряда, тлеющий разряд сетки на 60 с при 10 мА с рабочим расстоянием 80 мм и вакуумным давлением 1,0 х ^10-3 мбар. Сделайте это в течение 15-30 минут после следующего шага.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держатели для приготовления сетки можно купить в продаже или сделать самостоятельно с кусочком фильтровальной бумаги на небольшой чашке Петри.

2. Нанесение противообрастающего слоя

ПРИМЕЧАНИЕ: При обращении с сетками следует использовать надлежащую стерильную технику, и все растворы должны быть стерильными и/или стерилизованными фильтрами.

1. Переложите сетки (карбоновую стороной вверх) на чистую стеклянную горку или крышку с расстоянием между сетками не менее 1 см. Пипетка 10 мкл 0,05% поли-L-лизина (ФАПЧ) на каждую сетку. Инкубируйте сетки во влажной камере, такой как закрытая пластиковая коробка с влажными бумажными полотенцами, в течение не менее 30 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть продлен до ночи. Убедитесь, что уровень влажности в камере достаточен, чтобы предотвратить высыхание сеток.
2. Вымойте каждую сетку три раза с 15 мкл 0,1 М HEPES pH 8,5. Для каждой стирки удаляйте большую часть жидкости из сетки пипеткой, не давая сетке высохнуть. Добавьте 15 мкл свежего буфера, инкубируйте в течение не менее 30 с и повторите. Оставьте каждую сетку в 15 мкл 0,1 М HEPES после окончательной промывки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе и в будущих шагах важно держать сетку влажной и избегать контакта между пипеткой и сеткой.
3. Готовят 10 мкл 100 мг/мл полиэтиленгликоля-сукцинимидила валерата (ПЭГ-СВА) в 0,1 М HEPES рН 8,5 для каждой сетки. PEG-SVA быстро растворяется при мягком перемешивании, в результате чего получается прозрачный раствор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не готовьте раствор PEG-SVA заранее. ПЭГ-СВА имеет период полувыведения 10 мин при рН 8,5. Избегайте чрезмерной влажности материала PEG-SVA, храня его в сушилке или сухой среде при -20 °C и нагревая до комнатной температуры перед открытием.
4. Сразу после приготовления раствора PEG-SVA удалите 15 мкл капли HEPES pH 8,5 из каждой сетки (следя за тем, чтобы не высушить сетку) и добавьте каплю 10 мкл раствора PEG-SVA. Инкубируют сетки во влажной камере не менее 1 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть продлен до ночи. Убедитесь, что влажность в камере достаточна для предотвращения высыхания сеток.
5. Вымойте каждую сетку три раза 15 мкл стерильной воды. Для каждой промывки извлекайте большую часть жидкости из сетки пипеткой, не давая сетке высохнуть, добавляйте 15 мкл пресной воды, инкубируйте не менее 30 с и повторяйте. Оставьте каждую сетку в 15 мкл воды после окончательной стирки.

3. Нанесение геля PLPP

1. Подготовьте чистую крышку микроскопа для каждой сетки. Выполните следующие шаги для каждой сетки, по одной сетке за раз, чтобы свести к минимуму вероятность высыхания сетки.
2. Поместите каплю воды объемом 1,0 мкл в центр крышки, чтобы помочь разместить сетку на крышке и сохранить сетку влажной. Осторожно перенесите сетку с капли воды 15 мкл на каплю воды 1,0 мкл на крышке. Обязательно разместите сетку углеродной стороной вверх.
3. Осторожно поместите трафарет полидиметилсилоксана (PDMS) над сеткой, заботясь о том, чтобы сетка была центрирована и свела к минимуму контакт трафарета с углеродной фольгой сетки.
4. Добавьте в сетку 1,0 мкл геля 4-бензоилбензил-триметиламмонийхлорида (PLPP). Пипетку аккуратно перемешать (не трогать сетку кончиком пипетки).
5. Переместите крышку с сеткой в темное место для высыхания. Гель высохнет примерно через 15-30 минут.

4. Калибровка и проектирование микрошаблона

1. Окрасьте одну сторону стеклянной крышки маркером. Добавьте черные линии от перманентного маркера с тонким наконечником, чтобы облегчить фокусировку. Поместите крышку на микроскоп так, чтобы цветная сторона была обращена к объективу. Используя режим яркого поля, сосредоточьтесь на маркере.
2. Убедитесь, что микроскоп и система микроструктурирования включены, и установлен правильный световой путь. Откройте Micromanager и программное обеспечение Leonardo (плагины > Leonardo) на компьютере микроскопа.
3. Выберите Калибровка и следуйте инструкциям на экране. Отрегулируйте фокус микроскопа таким образом, чтобы изображение, проецируемое на слайд, находилось в фокусе. Время экспозиции, возможно, потребуется уменьшить. После калибровки выберите Шаблон сейчас.
4. Запишите соотношение микрометр/пиксель (мкм/px), указанное в калибровочных данных в левом верхнем окне программы (рисунок 2, область 1). Используйте это соотношение, чтобы определить количество пикселей, используемых на микрометр при проектировании шаблона.
5. После калибровки убедитесь, что программное обеспечение теперь открыто с живым видом на яркое поле из микроскопа. Загрузите подготовленную сетку на крышку (секция 3) на сцену сеткой, обращенной к объективу. Расположите рабочую область и отрегулируйте фокус так, чтобы сетка была видна в окне программного обеспечения.
6. Измерьте размер квадратов сетки и полос сетки в микрометрах. Программа включает в себя линейку, активируемую кнопкой в левом нижнем углу для измерения сетки (рисунок 2, область 2). Например, шаблоны, используемые здесь для сетки 200 ячеек, соответствуют ~87 × квадратам сетки 87 мкм и ~36 мкм сетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение обеспечивает гибкость в изменении размеров шаблонов на лету, поэтому незначительные неточности в измерении могут быть допущены.
7. Основываясь на измерениях и соотношениях выше, создайте шаблон(ы) с помощью любого программного обеспечения для создания изображений. Минимальный размер объекта с объективом 20× составляет 1,2 мкм. Шаблоны должны быть сохранены в виде несжатых 8-битных .tiff файлов.
   1. Убедитесь, что программное обеспечение не изменяет масштаб изображений до другого размера пикселя при сохранении. Узор должен помещаться в поле размером 800 × 800 пикселей, что достаточно для покрытия четырех квадратов сетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пиксели со значением 255 (белый) будут иметь наибольшую интенсивность (суммарная доза лазера), а пиксели со значением ноль (черный) не будут узорчатыми. Любые пиксели с промежуточным значением будут смоделированы с дозой приблизительно (X/255)*общая доза. На рисунке 3A для узоров оттенков серого использовались значения пикселей 255 и 129. После того, как шаблон разработан, его можно сохранить и повторно использовать без изменений.

5. Микроструктурирование

1. После калибровки убедитесь, что программное обеспечение теперь открыто с живым видом на яркое поле из микроскопа. Загрузите подготовленную сетку на крышку (секция 3) на сцену сеткой, обращенной к объективу. Расположите сцену и отрегулируйте фокус, чтобы увидеть сетку в программном обеспечении.
2. Для первоначального запуска разработайте новый шаблон. В программном обеспечении выберите Добавить рентабельность инвестиций (не показано, в расположении на рисунке 2 области 3) и выберите круг 3000 мкм. Расположите окупаемость инвестиций по кругу над сеткой, используя изображение яркого поля на экране в качестве ориентира. Нажмите кнопку блокировки, чтобы обеспечить окупаемость инвестиций.
3. После блокировки ROI на месте выберите Add Pattern (не показано в расположении на рисунке 2 области 3). Выберите шаблон, разработанный в разделе 4. Разделите сетку на шесть областей, чтобы обеспечить независимую фокусировку и позиционирование в каждом регионе для учета неравномерных сеток. 8 × 8 квадратов сетки для каждого угла сетки и 2 × 8 квадратных областей сетки с каждой стороны центра, оставляя четыре квадрата сетки центра нетронутыми (рисунок 2, центральное изображение).
4. Используйте параметры репликации (рисунок 2, область 4) для создания копий исходного шаблона, чтобы достичь желаемого количества общих копий шаблона. При необходимости отрегулируйте интервал между копиями в соответствии с интервалом между квадратами сетки.
5. Установите общую дозу для шаблона. 30 мДж/^мм2 является хорошей отправной точкой. Более подробную информацию см. в разделе обсуждения.
6. В разделе Параметры эксперта (рисунок 2, область 4) отрегулируйте угол области в соответствии с углами квадратов сетки. Области можно перемещать с помощью мыши. Соотношение (размер) паттернов также может быть скорректировано. Итерация путем настройки угла, положения, пространства между и соотношения узоров до тех пор, пока узоры не выровняются с квадратами сетки. Переместите область микроскопа, чтобы изменить область сетки на ярком дисплее.
7. Нажмите кнопку Блокировка , чтобы сохранить изменения, внесенные в регион.
8. Чтобы скопировать область, нажмите кнопку Дублировать (рисунок 2, область 5, значок двух листов бумаги) рядом с ее названием на панели «Действия» слева. Чтобы переместить, переименовать или отредактировать копию, нажмите на ее имя на панели «Действие».
9. Повторите шаги 5.4-5.9, если это необходимо, чтобы заполнить все нужные области.
10. После того, как полный шаблон разработан и размещен, сохраните файл шаблона в программном обеспечении (рисунок 2, область 6, панель со значком стрелки вверх на верхней панели инструментов).
11. При загрузке ранее сохраненного шаблона (полоса со значком стрелки вниз) центрируйте ROI над сеткой и нажмите кнопку Lock. Нажмите на каждую область на панели действий , чтобы изменить угол, положение, дозу и / или файл шаблона.
12. После размещения шаблона и шаблонов снимите флажки со всех областей, кроме одной, на панели действий в программном обеспечении.
13. Используйте стадию микроскопа, чтобы переместиться в эту область и сосредоточиться на углеродной фольге. Щелкнув значок Eyeball на панели «Действие» (рисунок 2, область 5), вы включите или выключите отображение наложения узора.
14. Как только сетка будет в фокусе, закройте затвор brightfield и нажмите значок воспроизведения в правом нижнем углу программного обеспечения, чтобы начать процесс создания шаблонов, который можно контролировать в режиме реального времени.
15. На панели действий выберите поле для следующего региона. Откройте затвор яркого поля так, чтобы сетка была видна, и центрируйте эту область с помощью сцены микроскопа. Повторите шаги 5.13–5.14 для каждого региона на панели действий.
16. Снимите крышку с сеткой из микроскопа и сразу же выложите на сетку 10 мкл стерильного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
17. Через 10 мин снимите трафарет пинцетом, затем промыть сетку 3x 15 мкл PBS. После окончательной стирки поместите каждую сетку в 15 мкл PBS и переместите сетки в темное место.

6. Отложение белков ECM

1. Для культивируемых клеток выполните шаги 6.2-6.5; для первичных нейронов дрозофилы выполните шаги 6.6-6.10.
2. Подготовьте не менее 15 мкл ECM для каждой сетки. Для клеток BEAS-2B готовят конечную концентрацию 0,01 мг/мл бычьего фибронектина и 0,01 мг/мл флуорофор-конъюгированного фибриногена в стерильном PBS. Для клеток HeLa получают 0,01 мг/мл бычьего коллагена I и 0,1 мг/мл флуорофор-конъюгированного фибриногена в стерильном PBS.
3. Удалите большую часть PBS из каждой сетки и примените 15 мкл ECM. Инкубируют сетку во влажной камере при комнатной температуре не менее 1 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть продлен до ночи при 4 °C.
4. После инкубации в ECM промыть каждую сетку 5x стерильным PBS. Для каждой стирки удалите большую часть жидкости пипеткой, не давая сетке высохнуть, добавьте 15 мкл свежего PBS, инкубируйте в течение не менее 30 с и повторите. Оставьте каждую сетку в PBS после окончательной стирки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сетки могут храниться до недели в PBS при температуре 4 °C без наблюдаемого ухудшения качества.
5. Используйте флуоресцентный микроскоп для обнаружения флуорофора в ECM, чтобы подтвердить паттерн и то, что углеродная фольга осталась неповрежденной. Несколько разбитых квадратов, как правило, терпимы.
6. Для первичных нейронов дрозофилы переместите узорчатые сетки в стеклянную нижнюю тарелку толщиной 30 мм, содержащую стерильный PBS.
7. Аспирировать PBS из чашки и применять 2 мл 0,5 мг/мл флуорофор-конъюгированного конканавалина А. Инкубировать на ночь при 25 °C в стерильной среде.
8. Вынуть раствор конканавалина А из посуды (без сушки сеток) и промыть сетки 3x PBS. Для каждой стирки добавляйте и вынимайте из посуды 2 мл PBS.
9. Используйте флуоресцентный микроскоп для обнаружения флуорофора в ECM, чтобы подтвердить паттерн и то, что углеродная фольга осталась неповрежденной. Несколько разбитых квадратов, как правило, терпимы.
10. После окончательной промывки удалите PBS из стеклянной посуды и добавьте 2 мл свежеприготовленной, стерильно-фильтрованной добавки Drosophila ^media21 Шнайдера, содержащей 20% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS), 5 мкг / мл инсулина, 100 мкг / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 10 мкг / мл тетрациклина. Инкубируйте при 25 °C в стерильной среде до тех пор, пока нейроны не будут готовы к покрытию.

7. Подготовка первичных клеток дрозофилы перед посевом

1. Стерилизуют 55 мм диссекционного блюда с 70% EtOH, а затем добавляют в блюдо 2-3 мл стерильно-фильтрованного 1× рассеченного раствора для рассечения (9,9 мМ HEPES pH 7,5, 137 мМ NaCl, 5,4 мМ KCl, 0,17 мМ _NaH2PO4, 0,22 мМ _KH2PO4, 3,3 мМ глюкозы, 43,8 мМ сахарозы)²¹.
2. Аккуратно соберите 30-40 личинок ^3-й звезды из пищи с помощью пинцета.
3. Поместите личинок в трубку с 1× PBS, затем переложите их во вторую трубку с 1× PBS для промывки личинок.
4. Перенесите личинки в трубку с 70% EtOH, чтобы смыть PBS, затем перенесите их во вторую трубку с 70% EtOH. Оставьте личинок во второй трубке на 2-3 мин для стерилизации личинок.
5. Переложите личинок в трубку с 1× рассеченным раствором, затем немедленно перенесите их во вторую трубку с 1× рассеченным физиологическим раствором.
6. Переложите отдельных личинок на рассекающую посуду, содержащую 1× рассечение. С помощью пары щипцов и рассеченного микроскопа быстро разорвите каждую личинку, чтобы извлечь мозг и перенести его в третью трубку с помощью 1× рассеченного раствора. Повторяйте до тех пор, пока не будут извлечены все мозги.
7. Центрифугируют трубку, содержащую мозги по 300 х г в течение 1 мин.
8. Выбрасывают надосадочное вещество и промывают 1 мл 1× рассеченного раствора и центрифугируют пробирку при 300 х г в течение 1 мин. Повторите этот шаг еще раз.
9. Откажитесь от надосадочного вещества до тех пор, пока в пробирке не останется 200-250 мкл и добавьте 20 мкл 2,5 мг/мл либеразы в 1-кратный расслоительный раствор.
10. Вращайте трубку на ротаторе в течение 1 ч при комнатной температуре; в течение этого часа пипетку раствором 25-30 раз каждые 10 мин. К концу раствор должен быть слегка непрозрачным.
11. Центрифугируют клетки при 300 × г в течение 5 мин.
12. Отбросьте супернатант, затем добавьте 1 мл дополненной среды Шнайдера. Пипетку раствором 30 раз перемешать.
13. Центрифугируют клетки при 300 × г в течение 5 мин.
14. Откажитесь от супернатанта и промыть ячейку гранулы, добавив 1 мл дополненной среды Schneider. Пипетку раствором 30 раз перемешать.
15. Центрифугируют клетки при 300 × г в течение 5 мин.
16. Отбросьте супернатант, затем повторно суспендируйте клеточную гранулу с 300 мкл дополненной среды Шнайдера. Пипетку раствором 30-40 раз перемешать.

8. Культивирование и RSV-инфекция клеток BEAS-2B и HeLa

1. Поддерживать ячейки HeLa и ячейки BEAS-2B в колбах T75 при 37 °C и 5% _CO2. Прохождение клеток каждые 3-4 дня один раз достигает примерно 80% конфлюзии. Поддерживать клетки HeLa в DMEM + 10% FBS + 1× антибиотик-антимикотический. Поддерживают BEAS-2B в RPMI + 10% FBS + 1× Антибиотик-Антимикотический6,22,23.
2. Для посева неинфицированных клеток перейдите к разделу 9. Клетки BEAS-2B и HeLa восприимчивы к РСВ-инфекции; Клетки BEAS-2B использовались для всех экспериментов с участием RSV, показанных здесь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнить все шаги BSL-2 в соответствии с институциональными протоколами с использованием соответствующего кабинета биобезопасности (BSC) и средств индивидуальной защиты (PPE).
3. До РСВ-инфекции клеток прохождение 5 × ¹⁰⁴ клетки на скважину в 6-луночную пластину (площадь поверхности ~9,6 ^см2) с 2 мл питательной среды и инкубировать в течение ночи.
4. Трипсинизируют и считают один колодец клеток. Для трипсинизации аспирировать среду из одной лунки и промыть 2 мл стерильных PBS без ^Mg2+ и ^Ca2+ для удаления остаточных сред. Добавьте 500 мкл 0,25% раствора трипсина. Инкубировать при 37 °C в течение 5-10 мин. Периодически проверяйте клетки, чтобы увидеть, не высвобождаются ли они с поверхности. Как только клетки будут освобождены, добавьте 1,5 мл культуральной среды.
5. Смешайте 100 мкл трипсинизированных клеток со 100 мкл трипан синего. Пипетку 10 мкл разбавленной клеточной смеси в гемоцитометр. Подсчитайте ячейки и рассчитайте количество ячеек в скважине. Используйте это число для расчета MOI ниже.
6. Готовят разбавление RSV-A2mK+²⁴ в питательной среде для достижения MOI 10 на скважину в 750 мкл среды. MOI RSV-A2mK+ может быть рассчитан по титрам флуоресцентных фокусных блоков (FFU) запаса (например: для 1,0 × ¹⁰⁵ клеток на скважину и запаса RSV 1,0 × ¹⁰⁸ FFU/мл, разбавляют вирусный запас 1:75 до 1 × ¹⁰⁶ FFU/750 мкл или 1,33 × ¹⁰⁶ FFU/мл).
7. Аспирировать среду из клеток в 6-луночной посуде и добавить 750 мкл вирусного раствора сверху в каждую лунку.
8. Раскачивайте плиту при комнатной температуре в течение 1 ч.
9. Через 1 ч доведите общий объем на лунку до 2 мл с предварительно нагретой питательной средой до 37 °C и поместите пластину в инкубатор, установленный на 37 °C с 5% _CO2 в течение 6 ч.
10. Трипсинизируют клетки, чтобы освободить их и приступить к посеву, как описано ниже. После посева высиживайте сетки в течение дополнительных 18 ч, прежде чем погружаться в замораживание (в общей сложности 24 ч после заражения).

9. Посев клеток на микроструктурированные сетки

1. Для культивируемых клеток выполните шаги 9.2-9.8; для первичных нейронов дрозофилы следуйте 9,9-9,11.
2. Трипсинизируйте клетки, чтобы освободить их (см. шаг 4 в разделе 8 выше). Чтобы уменьшить агрегацию клеток, трипсинизируют клетки при 60% или менее слиянии.
3. Смешайте 100 мкл трипсинизированных клеток со 100 мкл трипан синего. Пипетку 10 мкл разбавленной клетки смешивают с гемоцитометром и подсчитывают клетки.
4. Разводят клетки в средах до 2 × ¹⁰⁴ клеток/мл.
5. Добавьте 1 мкл среды в центр стеклянной нижней тарелки толщиной 30 мм, чтобы помочь в размещении сетки и предотвратить ее высыхание. Перенесите сетку с PBS на крышке в центр стеклянной нижней тарелки. Добавьте в сетку 10 мкл клеточного раствора.
6. С помощью яркополевого микроскопа наблюдают адгезию клеток к сетке через 5 мин. Если большинство паттернов остаются незанятыми, добавьте еще 10 мкл капли клеточного раствора. Держите сетки и клеточный раствор при 37 °C во время инкубации.
7. Повторяйте шаг 9.6 до тех пор, пока большинство паттернов не будут заняты или многие занятые шаблоны не начнут иметь несколько ячеек. Инкубировать сетку в течение 2 ч в инкубаторе (37 °C, 5% _CO2).
8. Залить блюдо 2 мл предварительно подогретой среды и инкубировать в течение ночи (37 °C, 5% _CO2).
9. Для первичных нейронов дрозофилы удалите среду из тарелки, содержащей сетку, и нанесите клетки на тарелку.
10. Подождите 30-60 минут, пока клетки прикрепятся, затем добавьте 2 мл дополненной среды Шнайдера.
11. Культивируйте нейроны в инкубаторе с температурой 25 °C в течение как минимум 2-3 дней перед погружением-замораживанием.

10. Визуализация и витрификация узорчатых сеток

1. Поместите стеклянную нижнюю тарелку, содержащую узорчатую сетку и культивируемые клетки, на флуоресцентный микроскоп.
2. Получайте изображения сетки, используя яркое поле и соответствующие флуоресцентные каналы для обнаружения рисунка и любой другой маркировки в клетках. Убедитесь, что плотность и позиционирование клеток подходят для последующей визуализации и анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения Brightfield и флуоресцентные изображения были обработаны в программном пакете ^FIJI25.
3. Подготовьте крио-погружную морозильную камеру; Тип морозильного устройства будет зависеть от наличия, стоимости и функций, наиболее подходящих для образца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные нейроны дрозофилы были подготовлены на автоматизированной погружной морозильной камере, а клетки BEAS-2B были подготовлены с использованием полуавтоматической погружной морозильной камеры.
4. Нанесите золотые фидуциалы на образцы для правильного выравнивания серии наклона. Промокните образцы, чтобы удалить лишние среды, затем погрузите образцы в криоген, такой как жидкий этан, охлаждаемый жидким азотом. Для первичных нейронов дрозофилы промокните в течение 4 с с обратной стороны. Для клеток HeLa и BEAS-2B промокнуть с обеих сторон в течение 4-6 с. Замороженные сетки затем могут храниться в жидком азоте до дальнейшего использования.
5. Изображение остеклованных клеток в криоэлектронном микроскопе, работающем на 300 кВ с помощью камеры прямого электронного детектора. Настройте коллекцию наклонных серий для каждого интересующего региона с помощью программного обеспечения, такого как ^SerialEM26 для сбора крио-EM/крио-ET данных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наклонные ряды первичных нейронов дрозофилы собирали на прямом электронном детекторе от -60° до 60° двунаправленно с шагом 2° при расфокусировке -8 мкм с размером пикселя 4,628 Å при общей дозе 70-75 e^-/^Å2. Тентовая серия RSV-инфицированных BEAS-2B собирали на прямом электронном детекторе с энергетическим фильтром (щель 20 эВ) при расфокусировке -5 мкм с размером пикселя 4,603 Å и общей дозой ~80 e^-/^Å2.
6. Обработайте наклонную серию для реконструкции томограмм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Томограммы, представленные здесь, были реконструированы с использованием пакета ^IMOD27; Фильтрация нижних частот осуществлялась с помощью программного пакета ^EMAN228.

Эта процедура использовалась для моделирования ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫХ сеток для экспериментов с крио-ИНОПЛАНЕТЯНами целых клеток. Весь рабочий процесс, представленный в этом исследовании, включая начальные препараты для культивирования клеток, микроструктурирование (рисунок 1) и визуализацию, охватывает 3-7 дней. Двухэтапная процедура использовалась для создания противообрастающего слоя путем нанесения ФАПЧ на сетку и последующего связывания ПЭГ путем добавления реактивного ПЭГ-СВА. Противообрастающий слой также может быть нанесен за один этап путем добавления ФАПЧ-g-PEG в одной инкубации. Гель PLPP является катализатором для УФ-микроструктурирования, которое также доступно в виде менее концентрированной жидкости. Гель позволяет создавать рисунок при значительно уменьшенной дозе по сравнению с жидкостью, что приводит к гораздо более быстрому моделированию. В этой системе фактическое время формирования полной сетки ТЕА составляло ~2 минуты. Один только рабочий процесс микроструктурирования обычно охватывает 5-6 часов и позволяет человеку выстроить восемь сеток для стандартной клеточной культуры на сетках TEM.

Ряд этапов процесса микроструктурирования требует длительного времени инкубации (см. шаги 2.1, 2.3, 6.4). Удобно, что некоторые из этих этапов, такие как пассивация ФАПЧ (2.1) или пассивация PEG-SVA (2.3), могут быть расширены до ночной инкубации. Кроме того, сетки могут быть заранее структурированы и сохранены в растворе белка ECM или PBS для последующего использования. В нашем исследовании эти варианты были ценны в тех случаях, когда время подготовки и посева клеток имеет решающее значение, таких как первичные нейроны дрозофилы и RSV-инфекция клеток BEAS-2B.

Сетки были подготовлены в лабораторных условиях общего уровня биобезопасности 2 (BSL-2) с использованием чистых инструментов, стерильных растворов и включали антибиотики / антимикотические средства в среде роста6,22,29,30. Для образцов, особенно чувствительных к микробному загрязнению, противообрастающий слой и ECM могут быть применены в вытяжке для культивирования тканей или другой стерильной среде. Кроме того, сетка может быть промыта этанолом между моделированием и применением ECM. При работе с инфекционными агентами важно адаптировать процедуру для соблюдения соответствующих протоколов биобезопасности.

Этот рабочий процесс и представленные процедуры (рисунок 1) позволили посеять клетки HeLa (рисунок 4), RSV-инфицированные клетки BEAS-2B (рисунок 3, рисунок 5) и первичные личиночные нейроны дрозофилы (рисунок 6, рисунок 7) на узорчатые ЭМ-сетки для оптимального сбора крио-ET данных.

Клетки HeLa, посеянные на микроструктурированные сетки TEM, остаются жизнеспособными, что определяется флуоресцентным окрашиванием с использованием анализа жизнеспособности клеток на основе кальцеина-AM и этидия гомодимера-1 (рисунок 4A, B). Используя смешанный ECM коллагена и фибриногена, клетки HeLa легко прилипают к паттернам по всей сетке (рисунок 4A, C). Общая морфология клеток, которые расширяются вдоль рисунка, аналогична морфологии клеток, выращенных на неструктурированных сетках (рисунок 4C, D). В случае клеток HeLa общая толщина ячейки остается ~< 10 мкм со значительно более тонкими областями ~< толщиной 1 мкм вблизи периферии клетки (рисунок 4E,F).

Для исследований RSV мы создали целые квадраты сетки, используя градиент, с воздействием низких доз по краям и более высокой картиной дозы к центру (рисунок 3A). Градиентные паттерны дали лучшие результаты при поиске выпущенных вирусов, присутствующих вблизи периферии клеток. Было обнаружено, что с помощью этих паттернов клетки преимущественно придерживаются более высокой концентрации ECM, но также способны придерживаться и расти на более низких концентрациях ECM. Относительная доза между областями должна быть оптимизирована при использовании моделей, требующих нескольких доз. Если дозы и, следовательно, концентрации ECM слишком похожи или слишком несопоставимы друг с другом, эффект от использования нескольких доз будет потерян.

На рисунке 3 сетка ТЕА была составлена по образцу и впоследствии засеяна инфицированными РСВ клетками BEAS-2B и использована для сбора крио-ЭМ данных. Рисунок 4А представляет собой флуоресцентное изображение ECM, нанесенное на сетку TEM с использованием градиентного рисунка. Адгезию и рост клеток вдоль центральной области рисунка можно увидеть на рисунке 3B как яркое изображение клеток через 18 часов после посева. На рисунке 3C флуоресцентный сигнал (красный) от репликации RSV-A2mK+ накладывается сигналом от ECM. Большинство инфицированных клеток расположены вдоль центральной области градиента с более высокой плотностью. Низкомагнигающая карта ТЕА постакриофиксации сетки показывает ряд клеток, включая RSV-инфицированные клетки, расположенные на углеродной фольге вблизи центра квадратов сетки. Как было показано ранее для клеток, выращенных на стандартных сетках TEM22, наклонные ряды были расположены и собраны из вирионов RSV в непосредственной близости от периферии инфицированных клеток BEAS-2B, выращенных на микроструктурированных сетках (рисунок 5A, B). Многие из структурных белков RSV могут быть идентифицированы в томограммах, включая нуклеокапсид (N) и белок вирусного слияния (F) (рисунок 5C, синие и красные стрелки соответственно).

Для первичных исследований нейронов дрозофилы было обнаружено, что узкий паттерн, близкий к пределу разрешения, предлагаемому программным обеспечением (где толщина паттерна составляла 2 мкм), позволял изолировать от одной до нескольких клеток в квадрате сетки (рисунок 6). Нейрональная сома смогла расширить свои нейриты в течение нескольких дней в пределах паттерна. Это позволило легко идентифицировать и получить ряд наклона нейритов по сравнению с нейронами, культивируемыми на неструктурированных сетках (рисунок 7). Также было обнаружено, что флуоресцентно меченый конканавалин А, лектин, который использовался в качестве ECM для нейронных культур дрозофилы in vitro20,21, поддается моделированию.

Нейроны дрозофилы из личинок третьей звезды были выделены в соответствии с ранее опубликованными протоколами20,21,31. Нейронные препараты наносили на микроструктурированные крио-ЭМ сетки, где конканавалин А осаждался на паттерне для регулирования размещения, распространения и организации клеток. Нейронам на узорчатых или неструктурированных сетках давали инкубироваться в течение как минимум 48-72 часов, а затем сетки погружали в замороженные. Репрезентативное изображение микроструктурированной ЭМ-сетки с несколькими нейронами дрозофилы, распределенными по узорчатым областям, показано на рисунке 6А. Эти нейроны, полученные из трансгенного штамма мухи, который имеет паннейрональную экспрессию GFP в мембране, могут быть легко отслежены с помощью световой микроскопии не только из-за его флуоресцентной маркировки, но и из-за его расположения в микрошаблонах. В то время как нейроны, культивируемые на неструктурированных сетках, также могут быть отслежены через передачу сигналов GFP с помощью световой микроскопии (рисунок 7A, желтый круг), найти их в крио-ЭМ стало значительно сложнее из-за присутствия клеточного мусора и загрязнения из среды (рисунок 7B, желтый круг). Такое присутствие было уменьшено для нейронов на узорчатых сетках, вероятно, из-за ПЭГ в противообрастающем слое неструктурированных областей, отталкивающих клеточный мусор от прилипания. Из-за размеров тела нейронной клетки и расширенных нейритов (рисунок 6A,B, желтый круг) крио-ET-серии наклона были собраны вдоль более тонких областей клеток (рисунок 6C, D, красный круг). Мембрана нейрональных клеток, митохондрия (голубой), микротрубочки (фиолетовый), актиновые нити (синий), везикулярные структуры (оранжевый и зеленый) и макромолекулы, такие как рибосомы (красный), были хорошо разрешены в монтажах изображений с более высоким увеличением и срезах через 3D-томограмму (рисунок 6E). В то время как аналогичные субклеточные особенности можно увидеть на 3D-томограммах неструктурированных нейронов (рисунок 7E), сложность в обнаружении жизнеспособных клеточных мишеней для сбора данных значительно снизила пропускную способность.

На рисунке 8 были собраны репрезентативные изображения с сеток с некоторыми из этих проблем, чтобы помочь в их идентификации и устранении неполадок. После определения оптимальных условий микроструктурирование является надежным и воспроизводимым методом позиционирования ячеек на сетках для крио-ТЭМ.

Рисунок 1: Общий рабочий процесс микроструктурирования для крио-ЭМ. Рабочий процесс можно условно разделить на четыре части: подготовка сетки, микроструктурирование, ECM и посев клеток, а также криоподготовка и сбор данных. Основные этапы каждого раздела перечислены под заголовками, а приблизительное время для завершения каждого раздела показано слева. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Снимок экрана программного обеспечения с рисунком, расположенным на сетке. Область 1 содержит соотношение мкм/пикс для проектирования шаблонов. Область 2 является линейкой для измерения сетки. Область 3 — это место, где можно добавлять или изменять шаблоны и ROI. Область 4 содержит всю информацию для позиционирования и дозы паттерна. Область 5 содержит параметры для шаблонов, включая переключение наложений, копирование или удаление шаблонов и выбор шаблонов для микроструктурирования. Область 6 - это место, где шаблоны могут быть сохранены и загружены. Более широкие виды областей 4 и 5 показаны ниже для ясности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: RSV-инфицированные клетки BEAS-2B на узорчатой крио-ТЭМ сетке. (А) Флуоресцентное изображение узорчатой сетки после добавления флуоресцентно меченой ECM. Шаблон ввода отображается в левом нижнем углу. (B) Brightfield изображение клеток BEAS-2B, выращенных на сетке в A. (C) Слияние изображения в A (голубой) и B (серый) с флуоресцентным изображением RSV-инфицированных клеток (красный) непосредственно перед погружением-замораживанием; инфицированные клетки экспрессируют mKate-2. Шкала стержней составляет 500 мкм. (D) Крио-ТЭМ карта с низким увеличением сетки в В после погружения-замораживания. Флуоресцентные изображения псевдоцветные. Шкала стержней составляет 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Живое/Мертвое окрашивание узорчатых и неструктурированных клеток. (A) Флуоресцентное изображение клеток HeLa, выращенных на узорчатой сетке и окрашенных кальцеином-AM (окрашивание живых клеток, зеленый) и гомодимером этидия-1 (окрашивание мертвых клеток, красный). (B) Клетки HeLa, выращенные на неструктурированной сетке и окрашенные как в A. (C) Проекция конфокальных z-стеков клетки HeLa на узорчатую сетку Quantifoil R2/2 с коллагеном 0,01 мг/мл и фибриногеном 647 ECM (красный). Клетка была окрашена кальцеином-AM (зеленый) и Hoechst-33342 (синий). (D) Клетки HeLa на неструктурированной сетке, инкубированные с коллагеном 0,01 мг/мл и фибриногеном 647 ECM, инкубированные и окрашенные кальциеном-AM и Hoecsht-33342. Флуоресцентные изображения были объединены с проходящим светом (оттенки серого). (E) X,Z проекция C. (F) X,Z проекция D. Изображения псевдоцветные. Шкала в (A) и (B) составляет 500 мкм; Шкалы в (C) - (F) составляют 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Крио-ET РСВ-инфицированной ячейки BEAS-2B на узорчатой крио-ТЭМ сетке. (А) Крио-ЭМ квадратная карта RSV-инфицированной ячейки BEAS-2B. Приблизительная граница ячейки обозначена пунктирной зеленой линией. (B) Изображение с более высоким разрешением области, окаймленной красным цветом в (A). Приблизительная граница ячейки обозначена пунктирной зеленой линией. Вирионы RSV можно увидеть вблизи периферии клетки (белая стрелка и желтая коробка). (C) Один z-срез из томограммы, собранной в области желтой коробки в (B). Красные стрелки указывают на белок слияния RSV F, синие стрелки указывают на комплекс рибонуклеопротеинов (RNP). Шкалы в (A)-(C) встроены в изображение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Первичные нейроны, полученные из мозга личинок 3-й звезды Drosophila melanogaster на узорчатой крио-ТЭМ сетке. (A) Наложенная флуоресцентная микроскопия живых клеток монтаж сетки нейронов дрозофилы , экспрессирующих мембранно-нацеленный GFP на узорчатых квадратах сетки с флуоресцентным конканавалином 0,5 мг/ мл A. Green: Нейроны Drosophila . Синий: Фотошаблон. (B) Крио-ЭМ монтаж изображения сетки в (А) после криоконсервации. Желтый круг обозначает тот же квадрат сетки, что и в (A). (C) Монтаж крио-ЭМ-изображения квадрата, выделенного желтым кругом в (A) и (B). (D) Изображение с более высоким увеличением области, ограниченной красным кругом в (C), где на нейритах ячейки был собран ряд наклона. E. Срез томограммы толщиной 25 нм, реконструированный из наклонного ряда, который был получен из красного круга в (C). На этой томограмме можно увидеть различные органеллы, такие как митохондрии (голубой), микротрубочки (фиолетовые), плотные везикулы ядра (оранжевый), светлые везикулы (зеленый), эндоплазматический ретикулум (желтый) и актин (синий). Макромолекулы, такие как рибосомы (красные), также можно увидеть в правом верхнем углу. Флуоресцентные изображения псевдоцветные. Шкалы в (A)-(E) встроены в изображение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Первичные нейроны, полученные из мозга личинок 3-й звезды Drosophila melanogaster на неструктурированных сетках. (A) Флуоресцентный монтаж сетчатой микроскопии живых клеток нейронов дрозофилы , экспрессирующих мембранно-целевой GFP на квадратах сетки с конканавалином 0,5 мг/мл А. Грин: нейроны дрозофилы . (B) Монтаж крио-ЭМ сетки той же сетки в (А) после погружения-замораживания. Желтый круг показывает тот же квадрат сетки, что и в (A). Обратите внимание на наличие клеточного мусора и загрязнения сред, что затрудняло идентификацию цели по сравнению с узорчатыми сетками. (C) Монтаж крио-ЭМ квадрата, выделенного желтыми кругами на картах (A) и (B). (D) Изображение с более высоким увеличением области, ограниченной красным кругом в (C), где на нейритах ячейки был собран ряд наклона. (E) Срез реконструированной томограммы толщиной 25 нм из серии наклона от (C) и (D). На этой томограмме виден ряд органелл, таких как микротрубочки (фиолетовый), актин (синий), эндоплазматический ретикулум (желтый) и плотные пузырьки ядра (оранжевый). Макромолекулы, такие как рибосомы (красные), также можно увидеть. Флуоресцентные изображения псевдоцветные. Шкалы в (A)-(E) встроены в изображение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8: Примеры возможных проблем с шаблонированием. Флуоресцентные изображения меченых ECM, нанесенных на микроструктурированные сетки. (A) Неравномерный рисунок по всей сетке из-за неравномерного распределения геля PLPP. (B) ECM не может прилипать к областям, охватываемым трафаретом PDMS во время моделирования. (C) Насыщенный градиентный рисунок (правая сторона) или перевернутый рисунок (слева) на сетке со слишком высокой общей дозой. (D) ECM прилипает к областям на стержнях сетки, а также к узорчатой области из-за отражений УФ-лазера во время моделирования. Изображения псевдоцветные; шаблон ввода показан в левом нижнем углу; Шкала 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Потенциальные проблемы в ходе микроструктурирования. В этой таблице описаны некоторые проблемы, с которыми пользователь может столкнуться во время микроструктурирования или посева клеток. Для каждой проблемы предусмотрены возможные причины и способы устранения неполадок. Репрезентативные изображения некоторых проблем можно увидеть на рисунке 8.

Авторам нечего раскрывать.