Этот протокол диссоциации нервных клеток предназначен для образцов с небольшим количеством исходного материала и дает очень жизнеспособную одноклеточную суспензию для последующего анализа с дополнительными этапами фиксации и окрашивания.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Комбинированная механическая и ферментативная диссоциация ткани гиппокампа мозга мыши
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Этот протокол нейронной диссоциации (адаптация протокола, сопровождающего коммерческий набор для диссоциации мозга взрослого человека) оптимизирует обработку тканей при подготовке к подробному последующему анализу, такому как проточная цитометрия или секвенирование одиночных клеток. Нейронная диссоциация может проводиться с помощью механической диссоциации (например, с использованием фильтров, методов измельчения или тритурации пипетки), ферментативного пищеварения или их комбинации. Деликатная природа нейрональных клеток может усложнить усилия по получению очень жизнеспособной, истинной одноклеточной суспензии с минимальным клеточным мусором, которая требуется для анализа одной клетки. Данные показывают, что эта комбинация автоматизированной механической диссоциации и ферментативного пищеварения последовательно дает очень жизнеспособную (>90%) одноклеточную суспензию, преодолевая вышеупомянутые трудности. Хотя некоторые из шагов требуют ручной ловкости, эти шаги уменьшают обработку образцов и потенциальную потерю клеток. В этой рукописи подробно описывается каждый этап процесса, чтобы оснастить другие лаборатории для успешной диссоциации небольших количеств нервной ткани при подготовке к последующему анализу.
Введение
Гиппокамп был впервые описан болонским анатомом Джулио Чезаре Аранцио в 1500-х годах1. Называя эту новообретенную структуру, Аранцио, вероятно, был вдохновлен ее странным сходством с морским коньком рода Hippocampus1. Гиппокамп участвует в стрессовых реакциях, но широко известен своей ролью в обучении и памяти. Более конкретно, гиппокамп отвечает за кодирование и извлечение декларативной и пространственной памяти1.
Гиппокамп, или собственно гиппокамп, делится на подполя CA1 (cornu ammonis), CA2 и CA31. По сравнению с остальной нервной си....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Эксперименты проводились в соответствии с этическими нормами, утвержденными Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию при UAMS. 6-месячные самки мышей дикого типа C57Bl6/J были куплены и размещены в группе (4 мыши на клетку) в течение постоянного 12-часового светло-темного цикла.
1. Подготовка реагентов
- Приготовьте поправимый раствор для живых/мертвых пятен. Восстановите флуоресцентное пятно с 20 мкл диметилсульфоксида (ДМСО).
- Заверните флакон в фольгу, пометьте его как «Восстановленный» и храните при температуре -20 °C до шести месяцев.
- Готовят 0,9% физиологический раствор с гепарино....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Образцы обрабатывали проточным цитометром на стержневом объекте, а полученные данные оценивали с помощью программного пакета для анализа потока. Ранее анализировались компенсационные элементы управления — живое/мертвое пятно и отрицательный контроль. Если используется несколько флуорохромов, для каждого антитела следует подготовить флуоресценцию минус один (FMO) контроль и контроль с одним пятном. Компенсация спектрального перекрытия для экспериментальных образцов была рассчитана на основе проанализированных контрольных .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Несколько шагов в этом протоколе нейронной диссоциации требуют профессиональной техники и ловкости — перфузии, аспирации супернатанта и удаления миелина. На протяжении всего процесса перфузии внутренние органы должны оставаться нетронутыми (кроме удаления диафрагмы и купирования сердца); это включает в себя избегание верхних камер сердца с помощью иглы бабочки. В то время как количество физиологического раствора с необходимым гепарином варьируется, прозрачная жидкость, вытекающая из сердца, указывает на то, что процесс з.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим Эйми Роджерс за практическое обучение и постоянную поддержку продукта. Мы благодарим д-ра Аманду Берк за продолжающееся устранение неполадок и прояснение обсуждений. Мы благодарим Мередит Йохейм и UAMS Science Communication Group за грамматическое редактирование и форматирование этой рукописи. Это исследование было поддержано NIH R25GM083247 и NIH 1R01CA258673 (A.R.A).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1,5 мл Микроцентрифужные пробирки | Fisher Scientific | 02-682-003 | Basix, в ассортименте цвета |
| 15 мл Falcon Tubes | Becton Dickinson Labware Europe | 352009 | Полистирол |
| 25 мл Серологические пипетки | Fisher Scientific | 14-955-235 | |
| 5 мл Круглое дно Полистирольная пробирка | Falcon | 352052 | |
| 500 мл Вакуумный фильтр / хранение Бутылочная система | Corning | 431097 | |
| 70 μ m клеточный фильтр | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Набор для диссоциации мозга у взрослых | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | содержит фермент, буфер Z, буфер Y, фермент А, буфер А, раствор для удаления мусора |
| Алюминиевая фольга | Fisher Scientific | 01-213-105 | |
| Анти-ACSA-2-PE-Vio770, мышь, клон REA969 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Основной белок анти-миелина | Sigma-Aldrich | M3821-100UG | |
| Anti-PSA-NCAM-PE, человек, мышь и крыса, клон 2-2B | Miltenyi Biotec | 130-117-394 | |
| BD LSRFortessa | BD | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906-50G | |
| CD11b-VioBlue, мышь, клон REA592 | Miltenyi Biotec | 130-113-810 | |
| CD31 антитело | Miltenyi Biotec | 130-111-541 | |
| Керамическая мешалка с подогревом | Fisher Scientific | 11-100-100SH | |
| Диметилсульфоксид | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Этанол | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 мл Конические центрифужные пробирки | Fisher | Scientific 14-432-22 | |
| Тонкие ножницы - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | Perfusion |
| FlowJo | BD | (v10.7.0) | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator с нагревателями | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Gibco DPBS (1X) | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| стеклянный стакан | Fisher Scientific | 02-555-25A | |
| Гепарин | натрия Fresenius Kabi | 504011 | |
| LIVE/DEAD Исправляемый набор для окрашивания Aqua Dead Cell | ThermoFisher | L34965 | |
| Магнитная мешалка Mesh Bar | Fisher Scientific | 14-513-51 | |
| Noyes Пружинные ножницы | Fine Science Tools | 15012-12 | Препарирование |
| параформальдегида | Sigma-Aldrich | 441244-3KG | Prilled, 95% |
| Наконечники для пипеток GP LTS 20 µ L 960A/10 | Наконечники | ||
| GP LTS 250 &микро; L 960A/10 | Наконечники | ||
| RT LTS 1000 µ L FL 768A/8 | Rainin | 30389213 | |
| Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μ L) | Rainin | 30386597 | |
| RBXMO FITC XADS | Fisher Scientific | A16167 | |
| Круглое ведро для льда с крышкой | Fisher Scientific | 07-210-129 | |
| Трубки с круглым дном и крышкой ситечка | Falcon | 100-0087 | |
| S1 Наполнители для пипеток | ThermoFisher Scientific | 9541 | |
| Шпатель и Измерительные | приборы Probe Fine Science Tools | 10090-13 | Препарирование и Perfusion |
| Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4" | Termuno | SV-23BLK | Игла-бабочка |
| Штатив для пробирок | Fisher Scientific | 14-809-37 | |
| Thermo Scientific Legend XTR Центрифуга | ThermoFisher | снята с производства | Или другая стандартная настольная центрифуга |
| Перистальтический насос с переменным расходом Fisher | Scientific | 13-876-2 | Модель с низким расходом |
| VetFlo Starter Kit для мышей | Kent Scientific | VetFlo-MSEKIT | Маска для анестезии, трубка, индукционная камера, угольные баллончики |
| VetFlo Vaporizer Одноканальная система анестезии | Kent Scientific | VetFlo-1210S | 0.2– 4 LPM |
| Vi-CELL XR Анализатор жизнеспособности клеток | Beckman Coulter Медико-биологические науки | 731196 | подсчет клеток |
| Vi-CELL XR 4 мешка флаконов с образцами | Beckman Coulter Медико-биологические науки | 383721 | подсчет клеток |
Ссылки
- Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'Keefe, J. The Hippocampus Book. , Oxford University Press, Inc. (2007).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. Genetic influence on neurogenesis in the dentate gyrus of adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
