Этот протокол диссоциации нервных клеток предназначен для образцов с небольшим количеством исходного материала и дает очень жизнеспособную одноклеточную суспензию для последующего анализа с дополнительными этапами фиксации и окрашивания.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Комбинированная механическая и ферментативная диссоциация ткани гиппокампа мозга мыши
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Этот протокол нейронной диссоциации (адаптация протокола, сопровождающего коммерческий набор для диссоциации мозга взрослого человека) оптимизирует обработку тканей при подготовке к подробному последующему анализу, такому как проточная цитометрия или секвенирование одиночных клеток. Нейронная диссоциация может проводиться с помощью механической диссоциации (например, с использованием фильтров, методов измельчения или тритурации пипетки), ферментативного пищеварения или их комбинации. Деликатная природа нейрональных клеток может усложнить усилия по получению очень жизнеспособной, истинной одноклеточной суспензии с минимальным клеточным мусором, которая требуется для анализа одной клетки. Данные показывают, что эта комбинация автоматизированной механической диссоциации и ферментативного пищеварения последовательно дает очень жизнеспособную (>90%) одноклеточную суспензию, преодолевая вышеупомянутые трудности. Хотя некоторые из шагов требуют ручной ловкости, эти шаги уменьшают обработку образцов и потенциальную потерю клеток. В этой рукописи подробно описывается каждый этап процесса, чтобы оснастить другие лаборатории для успешной диссоциации небольших количеств нервной ткани при подготовке к последующему анализу.
Введение
Гиппокамп был впервые описан болонским анатомом Джулио Чезаре Аранцио в 1500-х годах1. Называя эту новообретенную структуру, Аранцио, вероятно, был вдохновлен ее странным сходством с морским коньком рода Hippocampus1. Гиппокамп участвует в стрессовых реакциях, но широко известен своей ролью в обучении и памяти. Более конкретно, гиппокамп отвечает за кодирование и извлечение декларативной и пространственной памяти1.
Гиппокамп, или собственно гиппокамп, делится на подполя CA1 (cornu ammonis), CA2 и CA31. По сравнению с остальной нервной системой, гиппокамп имеет несколько уникальных определяющих характеристик, включая его пластичность и потенциал для продолжающегося нейрогенеза2. Нейрогенез – это процесс пролиферации и дифференцировки нервных стволовых клеток с последующей их интеграцией в уже существующую нейронную сеть. Нейрогенез ограничен субгранулярной зоной зубчатой извилины и субвентрикулярной зоной боковых желудочков (и обонятельных луковиц)3. В то время как нейрогенез в изобилии присутствует в эмбриогенезе, это пожизненный процесс 3,4. Таким образом, эта дискуссия будет сосредоточена на взрослом нейрогенезе в гиппокампе.
Субвентрикулярная и субгранулярная зоны представляют собой нейрогенные ниши, содержащие эпендимальные и сосудистые клетки, а также незрелые и зрелые линии нервных стволовых клеток5. Микроглия вносит свой вклад в эти ниши в качестве иммунных клеток для регулирования нейрогенеза6. Нейронные клетки-предшественники являются нестемочными клетками-потомками нервных стволовых клеток7. В субвентрикулярной зоне присутствуют три типа нейронных предшественников: радиальные глиоподобные клетки типа В, транзитоусиливающие предшественники типа С и нейробласты типа А 3,8. Медленно делящиеся нейронные клетки-предшественники типа В в субвентрикулярной зоне могут дифференцироваться в быстро делящиеся клетки типа С8. Впоследствии клетки типа С дифференцируются в клетки типа А8. Эти нейробласты мигрируют через ростральный миграционный поток к обонятельной луковице, прежде чем дифференцироваться в интернейроны или олигодендроциты9. Эти интернейроны обонятельных луковиц являются ключом к обонятельной кратковременной памяти и ассоциативному обучению, тогда как олигодендроциты миелинизируют аксоны мозолистого тела9. Большая часть взрослого нейрогенеза происходит в подгранулевой зоне зубчатой извилины, где находятся радиальные нейронные предшественники типа 1 и нерадиальные нейронные предшественники типа2. Большинству нейронных клеток-предшественников суждено стать зубчатыми гранулярными нейронами и астроцитами10. Соединенные щелевыми соединениями, астроциты образуют сети для модуляции пластичности, синаптической активности и возбудимости нейронов5. В качестве первичного возбуждающего нейрона зубчатой извилины гранулярные клетки обеспечивают вход из энторинальной коры в область CA311.
Популяции нервных стволовых клеток могут быть выделены с использованием иммуномагнитных или иммунофлуоресцентных стратегий изоляции12,13. Нервную ткань особенно трудно диссоциировать; попытки сделать это часто приводят к тому, что образцы с плохой жизнеспособностью клеток и/или не получают необходимой одноклеточной суспензии для последующего анализа. Нейронная диссоциация может проводиться с помощью механической диссоциации (например, с использованием фильтров, методов измельчения или тритурации пипетки), ферментативного пищеварения или комбинации методов14,15. В исследовании, оценивающем методы нейронной диссоциации, жизнеспособность и качество ручной механической диссоциации путем тритурации пипетки по сравнению с комбинациями тритурации пипетки и пищеварения с различными ферментами сравнивались15. Качество оценивали на основе количества клеточных сгустков и ДНК или субклеточного мусора в подготовленной суспензии15. Суспензии глиальных опухолей, подвергшихся только ручной механической диссоциации, имели значительно более низкую жизнеспособность клеток, чем лечение диспазой или комбинацией ДНКазы, коллагеназы и гиалуронидазы15. Volovitz et al. признали различия в жизнеспособности и качестве между различными методами и подчеркнули, что неадекватная диссоциация может снизить точность последующего анализа15.
В отдельном исследовании авторы сравнили более 60 различных методов и комбинаций диссоциации культивируемых нейрональных клеток14. Эти методы включали восемь различных вариаций ручной механической диссоциации путем тритурации пипетки, сравнение инкубации с пятью отдельными ферментами через три различных интервала и различные комбинации механической диссоциации с ферментативным пищеварением или комбинацией двух ферментов14. Ни один из механических способов не дал одноэлементной суспензии14. Четыре из одного ферментного лечения, десять комбинированных ферментативных методов лечения и четыре комбинации механической диссоциации с ферментативным пищеварением дали одноклеточную суспензию14. Ферментативное сбраживание с TrypLE с последующим трипсином-ЭДТА наиболее эффективно диссоциировало образцы14. Кстати, образцы, обработанные TrypLE и/или Trypsin-EDTA, имели тенденцию образовывать желатиновые сгустки14. Хотя это исследование было проведено на культивируемых клетках, оно говорит о недостатках тритурации пипетки или ферментативного пищеварения.
Параллельные сравнения ручной и автоматизированной механической диссоциации отсутствуют. Тем не менее, одна группа провела проточную цитометрию для сравнения ручной и полуавтоматической механической диссоциации всего мозга мыши в сочетании с коммерческими наборами ферментативной диссоциации папаина или трипсина16. Обработка диссоциатором более последовательно давала жизнеспособные клетки16. После диссоциации авторы также выделили клетки Проминина-1, нейрональные клетки-предшественники и микроглию16. Для двух из трех изолированных клеточных популяций чистота изолированных клеток была немного выше, когда образцы обрабатывали диссоциатором, по сравнению с вручную16. Reiß et al. отметили, что вариабельность от человека к человеку в методе пипетирования препятствует воспроизводимости жизнеспособного выхода клеточной популяции при диссоциациитканей 16. Авторы пришли к выводу, что автоматизированная механическая диссоциация стандартизирует обработку образцов16.
Метод диссоциации, описанный в этой рукописи, представляет собой комбинацию полностью автоматизированной механической диссоциации и ферментативного пищеварения с использованием растворов, сопровождающих коммерческий набор для диссоциации мозга взрослого человека17. В отличие от стандартных протоколов, этот оптимизированный протокол уменьшает манипуляции с образцами, дает очень жизнеспособную одноклеточную суспензию и предназначен для обработки минимальных количеств исходной ткани.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Эксперименты проводились в соответствии с этическими нормами, утвержденными Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию при UAMS. 6-месячные самки мышей дикого типа C57Bl6/J были куплены и размещены в группе (4 мыши на клетку) в течение постоянного 12-часового светло-темного цикла.
1. Подготовка реагентов
- Приготовьте поправимый раствор для живых/мертвых пятен. Восстановите флуоресцентное пятно с 20 мкл диметилсульфоксида (ДМСО).
- Заверните флакон в фольгу, пометьте его как «Восстановленный» и храните при температуре -20 °C до шести месяцев.
- Готовят 0,9% физиологический раствор с гепарином. Развести содержимое одного флакона гепарина натрия (10 000 единиц USP на 10 мл) в 1 л двойной дистиллированной воды (ddH2O).
- Приготовьте достаточно примерно на 45 мл на животное и храните при температуре 4 °C в течение одной недели.
- Внесите 1% параформальдегида (PFA).
- В вытяжном шкафу нагрейте конфорку до 50 °C. В микроволновой печи нагрейте 100 мл ddH2O в стеклянном стакане примерно до 60 °C. Добавьте магнитный мешалку и переложите на конфорку.
- В вытяжной капюшон взвесить 1 г PFA и добавить в стакан ddH2O. Добавить 0,1125 г кристаллов NaOH и перемешать до растворения (5-10 мин).
- Добавьте 0,4 г NaPO4-моноосновного и перемешайте до растворения (2-5 мин). Вакуумная фильтрация раствора и регулировка рН до 7,4 с помощью HCl и NaOH.
- Остудить на льду или при 4°C в течение 30 мин перед хранением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Аликвоты 1,5 мл могут храниться при -20 °C в течение одного года. Избегайте циклов замораживания-оттаивания. Если после оттаивания раствор помутнеет или образовался осадок, раствор использовать не следует.
ВНИМАНИЕ: Токсичный, легковоспламеняющийся. Всегда работайте с ПФА под вентилируемым капотом в надлежащих средствах индивидуальной защиты.
- Повторное суспендирование лиофилизированного фермента А с 1 мл буфера А. Не вихряйте раствор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фермент А и буфер А, а также буферы A, Y и Z являются реагентами в коммерческом наборе для диссоциации мозга взрослого человека17. - Разделить фермент Р на аликвоты по 50 мкл и повторно суспендировать фермент А на 10 мкл аликвоты. В соответствии с инструкциями по набору хранить при температуре -20 °C до шести месяцев. Избегайте циклов замораживания-оттаивания.
2. День эксперимента
- Охладите настольную центрифугу до 4 °C.
- Поместите аликвоту (аликвоты) PFA в холодильник для постепенного размораживания.
- Поместите восстановленное живое/мертвое пятно в темноту (например, ящик), чтобы оттаять при комнатной температуре.
- Подготовьте буфер сывороточного альбумина крупного рогатого скота (BSA). Добавьте 0,5 г BSA к 100 мл 1x фосфатно-буферного раствора Dulbecco без кальция и магния (D-PBS), рН 7,2.
- Добавьте перемешивание и перемешайте на перемешиваемой пластине в течение 30 минут. Переложить в конические трубки объемом 50 мл и хранить при температуре 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте свежеприготовленный буфер BSA. - Приготовьте живое/мертвое пятно, рабочее разбавление. Добавьте 1 мкл восстановленного живого/мертвого раствора для пятен в 360 мкл D-PBS и храните его в темноте (например, в ящике или коробке) при комнатной температуре. Приготовьте 50 мкл рабочего разбавления на образец.
3. Перфузия
- Поместите солевой раствор с гепарином на лед.
- Включите кислород, установите индикаторный шарик расходомера на системе испарителя анестезии мелких животных на 1 л/мин. Убедитесь, что есть адекватное давление кислорода и изофлурана.
- Отрегулируйте циферблат испарителя до 3,5% (для индукции и технического обслуживания).
- Загрунтуйте перфузионные насосные линии раствором физиологического раствора/гепарина. Установите скорость 6 мл/мин.
- Поместите мышь в индукционную камеру, включите дыхательную машину и подождите несколько минут, пока мышь не перестанет реагировать. Подтвердить достаточную глубину анестезии за счет отсутствия снятия педали до вредного защемления.
- Поместите мышь на спину на лоток для рассечения носом в носовом конусе. Выполните вторичное подтверждение полной анестезии через отсутствие отвода педали до вредного щепотки. Прикрепите все четыре лапы к лотку.
- Опрыскивайте брюшко животного 20% этанолом.
- С помощью щипцов зажмите нижнюю часть живота и поднимите кожу. Используйте ножницы, чтобы разрезать мех и кожу до нижней части грудной клетки.
- Сделайте два диагональных разреза из-под грудной клетки к каждому плечу.
- Тщательно резецируйте диафрагму (избегая легких и сердца). Ресектируйте грудную клетку, чтобы обнажить сердце.
- Осторожно разрежьте любую соединительную ткань вокруг сердца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 3.10-3.11 имеют решающее значение; выступать с мастерством и ловкостью. - Используйте ножницы, чтобы обрезать правое предсердие (темная доля в левом верхнем углу сердца). Выключите поток изофлурана к дыхательному аппарату.
- Держите сердце устойчивым щипцами. Скосом иглы бабочки лицом вверх проткните левый желудочек, сохраняя иглу на одном уровне и параллельно животному.
- Удерживайте иглу на месте, включите насос и перфьмин не менее 30 мл раствора физиологического раствора / гепарина до тех пор, пока жидкость, выходящая из сердца, не станет непрозрачной, а печень и легкие не бледнеют по цвету.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 3.13-3.14 имеют решающее значение; выступать с мастерством и ловкостью. - Выключите насос, извлеките иглу и перенесите мышь в область рассечения.
4. Рассечение
- Используя большие хирургические ножницы, обезглавить голову.
- Вырежьте мех от затылка до глаз. Очистите кожу обратно, чтобы обнажить череп.
- Зажмите череп между глазами. Сделайте два разреза в задней части черепа, в положении «10» и «2 часа», затем сделайте один длинный разрез (держите кончики вверх, чтобы не повредить мозг) вдоль средней сагиттальной линии черепа до первоначального разреза между глазами.
- Используйте щипцы, чтобы отклеить две половины черепа в стороны. Используйте шпатель, чтобы удалить мозг и поместить его в 60-миллиметровую стеклянную чашку Петри на льду, наполненную холодным D-PBS (рисунок 1).
- Используйте скальпель или бритву, чтобы отделить каждое полушарие. Затем удаляют обонятельные луковицы и мозжечок.
- Используйте щипцы, чтобы удалить средний мозг до тех пор, пока гиппокамп не будет открыт.
- Закрепите мозг щипцами. Используя второй набор щипцов, осторожно дразните гиппокамп из каждого полушария и перенесите оба гиппокампа в меченую трубку объемом 1,5 мл, содержащую холодный D-PBS.
- Поместите пробоотборник, содержащий два гиппокампа от мыши, на лед.
5. Подготовьте ферментную смесь 1 и 2 для каждого образца
ПРИМЕЧАНИЕ: Для объемов более 2 мл используйте серологическую пипетку объемом 10 мл; для объемов 200 мкл-2 мл используйте пипетку 1000 мкл; для объемов, 21-199 мкл, используйте пипетку 200 мкл; для объемов, 2-20 мкл, используйте пипетку 20 мкл; для объемов менее 2 мкл используйте пипетку 0-2 мкл.
- Для каждого образца разморозьте по одной аликвоте фермента Р и фермента А при комнатной температуре.
- Для ферментной смеси 1 соедините 50 мкл фермента P и 1900 мкл буфера Z в меченой C-трубке (Таблица материалов).
- Для смеси ферментов 2 добавьте 20 мкл буфера Y к размороженной 10-мкл аликвоте фермента А.
6. Протокол диссоциации мозга взрослогочеловека 17
ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с образцами трубки должны быть помещены в трубную стойку при комнатной температуре, в то время как BSA и D-PBS остаются на льду, если не указано иное.
- Включите диссоциатор.
- Используйте щипцы для переноса кусочков ткани гиппокампа в трубку С.
- Переложите 30 мкл смеси ферментов 2 в трубку C. Поверните колпачок до тех пор, пока не почувствуется напряжение, затем затяните, пока он не щелкнет.
- Поместите трубку C вверх ногами в положение диссоциатора; образцу будет присвоен статус Selected (рисунок 2). Закрепите нагреватель над трубкой C.
- Нажмите значок папки, выберите Папка Избранное , прокрутите до и выберите 37C_ABDK_02 программу. Нажмите OK , чтобы применить программу ко всем выбранным трубкам C, затем нажмите «Пуск» (рисунок 2).
- Нанесите этикетку на одну коническую пробирку объемом 50 мл на образец.
- Поместите клеточный ситечко 70 мкм на каждую коническую трубку объемом 50 мл и смочите 2 мл буфера BSA.
- По завершении программы снимите нагреватель и трубку С из диссоциатора.
- Добавьте 4 мл буфера BSA к образцу и нанесите смесь на клеточный ситечко на конической пробирке объемом 50 мл.
- Добавьте 10 мл D-PBS в трубку C, закройте ее и осторожно закрутите раствор. Нанесите его на клеточный ситечко на конической трубке объемом 50 мл.
- Выбросьте клеточный ситечко и трубку C. Центрифугировать суспензию при 300 х г в течение 10 мин при 4 °C. Затем аспирируйте и выбросьте супернатант.
7. Удаление мусора
- Повторно суспендировать гранулу с 1550 мкл холодного D-PBS и перенести суспензию в меченую коническую трубку объемом 15 мл.
- Добавьте 450 мкл холодного раствора для удаления мусора и пипетку вверх и вниз (не вихрь).
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор для удаления мусора является реагентом в коммерческом наборе для диссоциации взрослого Брайана17. - Аккуратно наложите 1 мл холодного D-PBS поверх клеточной суспензии, удерживая наконечник у стенки конической трубки. Повторять до тех пор, пока общее наложение не составит 2 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение; выступать с мастерством и ловкостью. - Центрифуга при 3000 x g в течение 10 мин при 4 °C с полным ускорением и полным торможением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если фазы четко не разделены, повторите шаги 7.2-7.3. Центрифуга конечное время при 1000 х г в течение 10 мин при 4 °C. - Теперь суспензия должна состоять из трех отдельных слоев (рисунок 3). Аспирировать самый верхний слой. Проведите кончик пипетки вперед и назад, чтобы аспирировать белый средний слой. Удалите как можно больше среднего слоя, не нарушая самый нижний слой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение; выступать с мастерством и ловкостью. - Добавьте 2 мл холодного D-PBS и пипетку вверх и вниз, чтобы перемешать.
- Центрифуга при 1000 x g в течение 10 мин при 4 °C с полным ускорением и полным торможением. Аспирировать и выбросить супернатант. Повторно суспендировать гранулу в 1 мл буфера BSA.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть повторно суспендированы в соответствующем буфере, а затем магнитно маркированы и изолированы в рамках подготовки к секвенированию одиночных клеток на этом этапе.
8. Количество ячеек
- Выполнять подсчет ячеек в соответствии с протоколом производителя доступного счетчика ячеек (один из вариантов указан в Таблице материалов)
9. Живое/мертвое пятно
- Центрифуга оставшихся 900 мкл (от 7,7) при 1000 х g в течение 10 мин при 4 °C с полным ускорением и полным торможением.
- Пока образец вращается, маркируйте одну проточную трубку на образец и оберните ее в фольгу, чтобы ограничить воздействие света.
- Аспирировать и выбросить супернатант.
- Повторно суспендировать гранулу в 50 мкл разбавленного живого/мертвого пятна (предварительно приготовленного).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен выполняться при слабом освещении. Выключите верхний свет в комнате, чтобы достичь этого. - Переложите каждый образец в соответствующую маркированную проточную трубку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 8-10 мин в темноте (например, ящик или коробку).
- Добавьте 500 мкл буфера BSA и центрифуги при 1000 x g в течение 10 мин при 4 °C с полным ускорением и полным торможением.
- Аспирировать и выбросить супернатант.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула может быть не видна; оставьте небольшое количество буфера, чтобы непреднамеренно не аспирировать гранулу. Клетки могут быть повторно суспендированы в соответствующем буфере, заблокированы и окрашены клеточно-специфическими антителами в этот момент. Пример протокола18 см. в дополнительном файле 1.
10. Фиксация (опционально)
- Повторно суспендировать гранулы в 200 мкл 1% PFA (предварительно приготовленные). Инкубировать в течение 15 мин при 4 °C.
- Промыть, добавив 500 мкл D-PBS и центрифугу при 300 х г в течение 10 мин при 4 °C.
- Аспирировать супернатанта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула может быть не видна; оставьте небольшое количество буфера, чтобы непреднамеренно не аспирировать гранулу. - Повторно суспендировать гранулу в 200 мкл D-PBS и хранить при 4 °C до 3 дней.
11. Проточная цитометрия
- Наклейте крышки фильтров на новые трубки.
- Используя пипетку объемом 1 мл, пипетка каждого образца помещается на крышку фильтра.
- Центрифуга ненадолго при 200 x g при 4 °C, что позволяет центрифуге достигать 200 x g до остановки пробега.
- Приступайте к проточной цитометрии керна для последующего анализа.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Образцы обрабатывали проточным цитометром на стержневом объекте, а полученные данные оценивали с помощью программного пакета для анализа потока. Ранее анализировались компенсационные элементы управления — живое/мертвое пятно и отрицательный контроль. Если используется несколько флуорохромов, для каждого антитела следует подготовить флуоресценцию минус один (FMO) контроль и контроль с одним пятном. Компенсация спектрального перекрытия для экспериментальных образцов была рассчитана на основе проанализированных контрольных ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Несколько шагов в этом протоколе нейронной диссоциации требуют профессиональной техники и ловкости — перфузии, аспирации супернатанта и удаления миелина. На протяжении всего процесса перфузии внутренние органы должны оставаться нетронутыми (кроме удаления диафрагмы и купирования сердца); это включает в себя избегание верхних камер сердца с помощью иглы бабочки. В то время как количество физиологического раствора с необходимым гепарином варьируется, прозрачная жидкость, вытекающая из сердца, указывает на то, что процесс з...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим Эйми Роджерс за практическое обучение и постоянную поддержку продукта. Мы благодарим д-ра Аманду Берк за продолжающееся устранение неполадок и прояснение обсуждений. Мы благодарим Мередит Йохейм и UAMS Science Communication Group за грамматическое редактирование и форматирование этой рукописи. Это исследование было поддержано NIH R25GM083247 и NIH 1R01CA258673 (A.R.A).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1,5 мл Микроцентрифужные пробирки | Fisher Scientific | 02-682-003 | Basix, в ассортименте цвета |
| 15 мл Falcon Tubes | Becton Dickinson Labware Europe | 352009 | Полистирол |
| 25 мл Серологические пипетки | Fisher Scientific | 14-955-235 | |
| 5 мл Круглое дно Полистирольная пробирка | Falcon | 352052 | |
| 500 мл Вакуумный фильтр / хранение Бутылочная система | Corning | 431097 | |
| 70 μ m клеточный фильтр | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Набор для диссоциации мозга у взрослых | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | содержит фермент, буфер Z, буфер Y, фермент А, буфер А, раствор для удаления мусора |
| Алюминиевая фольга | Fisher Scientific | 01-213-105 | |
| Анти-ACSA-2-PE-Vio770, мышь, клон REA969 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Основной белок анти-миелина | Sigma-Aldrich | M3821-100UG | |
| Anti-PSA-NCAM-PE, человек, мышь и крыса, клон 2-2B | Miltenyi Biotec | 130-117-394 | |
| BD LSRFortessa | BD | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906-50G | |
| CD11b-VioBlue, мышь, клон REA592 | Miltenyi Biotec | 130-113-810 | |
| CD31 антитело | Miltenyi Biotec | 130-111-541 | |
| Керамическая мешалка с подогревом | Fisher Scientific | 11-100-100SH | |
| Диметилсульфоксид | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Этанол | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 мл Конические центрифужные пробирки | Fisher | Scientific 14-432-22 | |
| Тонкие ножницы - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | Perfusion |
| FlowJo | BD | (v10.7.0) | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator с нагревателями | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Gibco DPBS (1X) | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| стеклянный стакан | Fisher Scientific | 02-555-25A | |
| Гепарин | натрия Fresenius Kabi | 504011 | |
| LIVE/DEAD Исправляемый набор для окрашивания Aqua Dead Cell | ThermoFisher | L34965 | |
| Магнитная мешалка Mesh Bar | Fisher Scientific | 14-513-51 | |
| Noyes Пружинные ножницы | Fine Science Tools | 15012-12 | Препарирование |
| параформальдегида | Sigma-Aldrich | 441244-3KG | Prilled, 95% |
| Наконечники для пипеток GP LTS 20 µ L 960A/10 | Наконечники | ||
| GP LTS 250 &микро; L 960A/10 | Наконечники | ||
| RT LTS 1000 µ L FL 768A/8 | Rainin | 30389213 | |
| Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μ L) | Rainin | 30386597 | |
| RBXMO FITC XADS | Fisher Scientific | A16167 | |
| Круглое ведро для льда с крышкой | Fisher Scientific | 07-210-129 | |
| Трубки с круглым дном и крышкой ситечка | Falcon | 100-0087 | |
| S1 Наполнители для пипеток | ThermoFisher Scientific | 9541 | |
| Шпатель и Измерительные | приборы Probe Fine Science Tools | 10090-13 | Препарирование и Perfusion |
| Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4" | Termuno | SV-23BLK | Игла-бабочка |
| Штатив для пробирок | Fisher Scientific | 14-809-37 | |
| Thermo Scientific Legend XTR Центрифуга | ThermoFisher | снята с производства | Или другая стандартная настольная центрифуга |
| Перистальтический насос с переменным расходом Fisher | Scientific | 13-876-2 | Модель с низким расходом |
| VetFlo Starter Kit для мышей | Kent Scientific | VetFlo-MSEKIT | Маска для анестезии, трубка, индукционная камера, угольные баллончики |
| VetFlo Vaporizer Одноканальная система анестезии | Kent Scientific | VetFlo-1210S | 0.2– 4 LPM |
| Vi-CELL XR Анализатор жизнеспособности клеток | Beckman Coulter Медико-биологические науки | 731196 | подсчет клеток |
| Vi-CELL XR 4 мешка флаконов с образцами | Beckman Coulter Медико-биологические науки | 383721 | подсчет клеток |
Ссылки
- Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'Keefe, J. The Hippocampus Book. , Oxford University Press, Inc. (2007).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. Genetic influence on neurogenesis in the dentate gyrus of adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10409-10414 (1997).
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132, 645-660 (2008).
- Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the adult hippocampus. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, 018812(2015).
- Bond, A. M., Ming, G. L., Song, H. Adult mammalian neural stem cells and neurogenesis: Five decades later. Cell Stem Cell. 17, 385-395 (2015).
- Sato, K. Effects of microglia on neurogenesis. Glia. 63, 1394-1405 (2015).
- Lee, V. M., Scientist, S., Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neural stem cells. , Available from: http://www.stemcell.com/media/files/minireview/MR29019-Neural_Stem_Cells.pdf (2015).
- Mu, Y., Lee, S. W., Gage, F. H. Signaling in adult neurogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 20, 416-423 (2010).
- Fares, J., Diab, Z. B., Nabha, S., Fares, Y. Neurogenesis in the adult hippocampus: history, regulation, and prospective roles. International Journal of Neuroscience. 129, 598-611 (2018).
- Tosun, M., Semerci, F., Maletic-Savatic, M. Heterogeneity of stem cells in the hippocampus. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1169, 31-53 (2019).
- Abbott, L. C., Nigussie, F. Adult neurogenesis in the mammalian dentate gyrus. Journal of Veterinary Medicine Series C: Anatomia Histologia Embryologia. 49, 3-16 (2020).
- Rodrigues, G. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A., Cabral, J. M., Diogo, M. M. Purification of human induced pluripotent stem cell-derived neural precursors using magnetic activated cell sorting. Methods in Molecular Biology. 1283, Clifton, N.J. 137-145 (2015).
- Ko, I. K., Kato, K., Iwata, H. Parallel analysis of multiple surface markers expressed on rat neural stem cells using antibody microarrays. Biomaterials. 26, 4882-4891 (2005).
- Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61 (1), 78-84 (2017).
- Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neuroscience. 17, 1-10 (2016).
- Reiß, S., Herzig, I., Schmitz, J., Bosio, A., Pennartz, S. Semi-automated tissue dissociation and preserved epitope integrity optimize immunomagnetic sorting of neural cells. , Available from: www.miltenyibiotec.com (2021).
- Adult brain dissociation kit: mouse and rat. Miltenyi Biotec. , Available from: https://www.miltenyibiotec.com/upload/assets/IM0011920.pdf (2020).
- Cell surface flow cytometry staining protocol. Miltenyi Biotec. , Available from: https://www.miltenyibiotec.com/US-en/applications/all-protocols/cell-surface-flow-cytometry-straining-protocol-pbs-bsa-1-50.html (2021).
- Finak, G., Jiang, W., Gottardo, R. CytoML for cross-platform cytometry data sharing. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 93, 1189-1196 (2018).
- Turaç, G., et al. Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis. PLoS One. 8, 1-14 (2013).
- Schwarz, J. M. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537(2015).
- Brummelman, J. application and computational analysis of high-dimensional fluorescent antibody panels for single-cell flow cytometry. Nature Protocols. 14, 1946-1969 (2019).
- Recommended controls for flow cytometry. Abcam. , Available from: https://www.abam.com/protocols/recommended-conntrols-for-flow-cytometry (2021).
- Fixing cells with paraformaldehyde (PFA) for flow cytometry. , Available from: https://flowcytometry.utoronto.ca/wp-content/uploads/2016/02/FixingCells_PFA.pdf (2021).
- Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).
- Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes. Neuron. 109, 11-26 (2021).
- Ho, H., et al. A guide to single-cell transcriptomics in adult rodent brain: The medium spiny neuron transcriptome revisited. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 1-16 (2018).
- Li, L., et al. Novel technologies in studying brain immune response. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 6694566(2021).
- Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. bioRxiv. , (2020).
- Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. International Journal of Molecular Sciences. 21, 1-20 (2020).
- Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590(2021).
- Delmonte, O. M., Fleisher, T. A. Flow cytometry: Surface markers and beyond. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143, 528-537 (2019).
- O'Connor, J. E., et al. The relevance of flow cytometry for biochemical analysis. IUBMB Life. 51, 231-239 (2001).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized. Experiments. (94), e52241(2014).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
