Этот протокол подробно описывает усовершенствованный метод синтеза высоких выходов рекомбинантных белков из системы Streptomyces venezuelae безклеточной транскрипции-трансляции (TX-TL).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Высокопроизводительный инструментарий транскрипции Streptomyces для синтетической биологии и применения натуральных продуктов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Streptomyces spp. являются основным источником клинических антибиотиков и промышленных химикатов. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 является быстрорастущим штаммом и естественным производителем хлорамфеникола, жадомицина и пикромицина, что делает его привлекательным кандидатом в качестве шасси синтетической биологии следующего поколения. Поэтому генетические инструменты, которые ускоряют разработку S. venezuelae ATCC 10712, а также других моделей Streptomyces spp., очень желательны для разработки и открытия природных продуктов. С этой целью в этом протоколе предусмотрена специальная бесклетовая система S. venezuelae ATCC 10712, обеспечивающая высокоурожайную гетерологичную экспрессию генов с высоким G + C (%) Этот протокол подходит для мелкомасштабных (10-100 мкл) периодических реакций в формате пластин с 96 или 384 лунками, в то время как реакции потенциально масштабируемы. Бесклеточная система надежна и может достигать высоких выходов (~ 5-10 μ M) для ряда рекомбинантных белков в минимальной установке. Эта работа также включает в себя широкий набор плазмидных инструментов для измерения в режиме реального времени мРНК и синтеза белка, а также флуоресцентного окрашивания помеченных белков в геле. Этот протокол также может быть интегрирован с высокопроизводительными рабочими процессами характеристик экспрессии генов или изучением ферментных путей из генов с высоким G + C (%) присутствующих в геномах актиномицетов.
Введение
Бесклеточные системы транскрипции-трансляции (TX-TL) обеспечивают идеальную платформу прототипирования для синтетической биологии для реализации быстрых циклов проектирования-сборки-тестирования-обучения, концептуальной инженерной основы для синтетической биологии1. Кроме того, растет интерес к системам TX-TL для производства высокоценного рекомбинантного белка в среде с открытой реакцией2, например, для включения нестандартных аминокислот в конъюгаты антитело-лекарство3. В частности, TX-TL требует клеточного экстракта, плазмиды или линейной ДНК и энергетического раствора для катализа синтеза белк....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу 1 и Таблицу 2 рецептов для средней и агаровой пластины GYM и буферов для мытья S30A и S30B.
1. Подготовка решений и общее руководство
- Храните все растворы, клетки (после роста) и клеточные экстракты на льду после приготовления, если не указано исключение.
- Храните запасы для 1 М Мг-глутамата, 4 М К-глутамата, 40% (мас./об.) ПЭГ 6000, 1 г/мл поливинилсульфоновой кислоты при комнатной температуре и всех остальных запасов при -80 °C. Сведите к минимуму количество циклов замораживания-оттаивания, чтобы избежать химической деградации.
- Для подготовки запасов э....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Этот подробный протокол приведен в качестве примера, чтобы помочь пользователю установить систему Streptomyces TX-TL на основе штамма модели S. venezuelae ATCC 10712 (рисунок 1). Пользователь может стремиться изучить другие штаммы Streptomyces; однако этапы роста/сбора урожая других штаммов с более длительным временем удвоения или различными предпочтениями роста должны быть специально оптимизированы для достижения пиковых результатов. Для репрезентативного результа.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этой рукописи был описан высокопроизводительный протокол S. venezuelae TX-TL с подробными шагами, которые легко провести как для опытных, так и для новых пользователей систем TX-TL. Несколько функций из существующих протоколов Streptomyces45 и E. coli TX-TL41 были удалены, чтобы установить минимальный, но высокопроизводительный протокол для S. venezuelae TX-TL5,26. Рабочий проце.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Авторы хотели бы отметить следующую исследовательскую поддержку: EPSRC [EP/K038648/1] для SJM в качестве PDRA с PSF; Wellcome Trust спонсировал стипендию ISSF для SJM с PSF в Имперском колледже Лондона; Исследовательский грант Королевского общества [RGS\R1\191186]; Награда Wellcome Trust SEED [217528/Z/19/Z] для SJM в Кентском университете; и стипендия Фонда исследований глобальных проблем (GCRF) для KC в Кентском университете.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Колба UltraYield 2,5 л | Thomson | 931136-B | |
| 3-PGA (>93%) | Sigma | P8877 | |
| 384 луночная черная/прозрачная нижняя пластина | ThermoFisher | 10692202 | |
| хлоридом аммония (98%) | Fluorochem | 44722 | |
| АТФ, CTP, UTP, GTP (раствор 100 мМ, >99%) | ThermoFisher | R0481 | |
| Карбенициллин (связаться с поставщиком по вопросам чистоты) | Melford | C46000-25.0 | |
| D-(+)-глюкоза (связаться с поставщиком по вопросам чистоты) | Melford | G32040 | |
| DFHBI (≥ 98% - ВЭЖХ) | Sigma | SML1627 | |
| DTT (связаться с поставщиком по вопросам чистоты) | Melford | MB1015 | |
| FlAsH-EDT2 (связаться с поставщиком по вопросам чистоты) | Santa Cruz Biotech | sc-363644 | |
| Глюкозо-6-фосфат (>98%) | Sigma | G7879 | |
| HEPES Free Acid (связаться с поставщиком по вопросам чистоты) | Melford | B2001 | |
| L-глутаминовая кислота гемимагния тетрагидрат соли магния (>98%) | Sigma | 49605 | |
| Хлорид магния (98%) | Флуорохем | 494356 | |
| Солодовый экстракт | Sigma | 70167-500G | |
| PEG-6000 | Sigma | 807491 | |
| 96-луночная микродиализная пластина, 10K MWCO | ThermoFisher | 88260 | |
| Poly(винил сульфат) калийная соль | Sigma | 271969 | |
| глутамат калия (>99%) | Sigma | G1149 | |
| RTS образец аминокислот | 5 Prime | 2401530 | |
| Sodium хлорид (99%) | Fluorochem | 94554 | |
| Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE колонка (1 г) | Sigma | 505471 | |
| дрожжевой экстракт | Melford | Y1333 | |
| Equipment | |||
| Platereader | BMG | Omega |
Ссылки
- Carbonell, P., et al. An automated Design-Build-Test-Learn pipeline for enhanced microbial production of fine chemicals. Communications Biology. 1, 66(2018).
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
