Method Article

Пробоподготовка липидным монослойным методом для электронно-кристаллографических исследований

DOI:

10.3791/63015

⸱

November 20th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1School of Molecular Sciences, Arizona State University, 2Center for Applied Structural Discovery, Biodesign Institute, Arizona State University, 3Eyring Materials Center, Arizona State University, 4Department of Microbiology and Immunology, The Pennsylvania State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Липидные монослои использовались в качестве основы для формирования двумерных (2D) белковых кристаллов для структурных исследований на протяжении десятилетий. Они стабильны на границе раздела воздух-вода и могут служить тонким поддерживающей материалом для электронной визуализации. Здесь мы представляем проверенные этапы подготовки липидных монослоев для биологических исследований.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Электронная кристаллография является мощным инструментом для определения структуры высокого разрешения. Макромолекулы, такие как растворимые или мембранные белки, могут быть выращены в высокоупорядоженные двумерные (2D) кристаллы при благоприятных условиях. Качество выращенных 2D-кристаллов имеет решающее значение для разрешения окончательной реконструкции с помощью обработки 2D-изображений. На протяжении многих лет липидные монослои использовались в качестве поддерживающего слоя для содействия 2D-кристаллизации белков периферических мембран, а также растворимых белков. Этот метод также может быть применен к 2D-кристаллизации интегральных мембранных белков, но требует более обширных эмпирических исследований для определения условий моющего средства и диализа для содействия разделению на монослой. Липидный монослой образуется на границе раздела воздух-вода таким образом, что полярные липидные головные группы остаются гидратированными в водной фазе, а неполярные, ацильные цепи, хвосты перегоняются в воздух, нарушая поверхностное натяжение и сплющивая поверхность воды. Заряженная природа или отличительные химические фрагменты головных групп обеспечивают сродство к белкам в растворе, способствуя связыванию для формирования 2D-массива. Вновь образованный монослой с 2D-массивом может быть легко перенесен в электронный микроскоп (ЭМ) на медной сетке с углеродным покрытием, используемой для подъема и поддержки кристаллического массива. В этой работе мы описываем липидную монослойную методологию криогенной электронно-микроскопической (крио-ЭМ) визуализации.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дифракция электронов через 2D-кристаллы или спиральные массивы белков может достигать субнанометровых разрешений в благоприятных случаях1,2,3. Особый интерес представляют восстановленные 2D мембранные белковые массивы или кристаллы в их почти нативных средах1. Поскольку кристалл действует как усилитель сигнала, усиливая интенсивность структурных факторов на определенных пространственных частотах, электронная кристаллография позволяет зондирование мишени с меньшим размером при высоких разрешениях, таких как малые молекулы, чем для крио-ЭМ с одной частицей. Электронный пучок может быть дифрагирован упорядоченным 2D-массивом белков, генерируя дифракционную картину или изображение решетки в зависимости от того, где плоскость изображения записывается надетекторе 4. Затем дифракционные интенсивности могут быть извлечены и обработаны для реконструкции 2D-проекционной структуры кристалла. Электроны имеют большее поперечное сечение рассеяния, чем рентгеновские лучи, и его рассеяние в основном следует модели Резерфорда, основанной на кулоновском взаимодействии между электронами и заряженными атомами в молекуле5. Толщина 2D мембранных кристаллов обычно составляет менее 100 нм, пригодных для передачи электронов без динамического рассеяния, происходящего в образце6. Было показано, что электронно-кристаллографические исследования можно использовать мощный инструмент для исследования структурной информации с высоким разрешением мембранных белков илипидно-белковых взаимодействий7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17.

Монослой липидов представляет собой один единственный липидный слой, состоящий из фосфолипидов, плотно упакованных на границераздела 6воздух-вода, который может способствовать образованию 2D-массива для растворимых белков или белков периферических мембран18. В зависимости от плотности липидов и их бокового давления молекулы липидов могут образовывать упорядоченный 2D-массив на границе раздела воздух-вода с их ацильными цепями, расширенными до воздуха и гидрофильных головных групп, выставленных в водномрастворе1,6,19. Липидная головная группа может взаимодействовать с белками посредством электростатического взаимодействия или может быть модифицирована для обеспечения метки сродства для связывания определенного белкового домена. Например, DOGS-NTA-Ni (1,2-диолеоил-sn-glycero-3-[(N-(5-амино-1-карбоксипентил)иминодиуксусная кислота)сукцинил]2-Ni2+)часто используется при формировании липидного монослоя для связывания белков с полигистидовой меткой 20,21,22. Также холерный токсин В может связывать определенный пентасахарид ганглиозида GM1 в липидном монослое для структурных исследований23,24. Закрепляя белки на липидных головных группах, липидный монослой может способствовать формированию 2D-массивов, которые являются тонкими для электронно-кристаллографических исследований с высоким разрешением. Липидный монослойный метод был использован в электронной кристаллографии для структурных исследований белков, таких как стрептавидин2,25,аннексин V26,холерический токсин27, E. coli gyrase B субъединица28, E. coli РНК-полимераза25,29,30,белки оболочки карбоксисомы31 и капсидные белки ВИРУСА ВИЧ-132 и вируса мышиного лейкоза Молони 33.Из-за стабильности и химических свойств липидного монослоя были исследованы различные применения для подготовки образцов для крио-ЭМ-визуализации34. Однако для формирования белкового массива потребуется оптимизация.

Здесь мы предоставляем подробные сведения об общей подготовке липидных монослоев для крио-ЭМ-визуализации и некоторые соображения, которые могут повлиять на качество образующихся монослоев.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка тефлонового блока

  1. Приготовьте тефлоновый блок из химически стойкой смолы PTFE (политетрафторэтилен). Сделайте отверстия на блоке с помощью общего сверла, за которым следуют размеры, обозначенные на рисунке 1.

2. Однослойный липидный препарат

ПРИМЕЧАНИЕ: Расчетное время работы: 30- 45 минут

  1. Подготовка липидного запаса
    1. Готовят липидную смесь 0,01 мг/мл в 9:1 (v/v) хлороформа/метанола, используя 8,91 мл хлороформа, 0,99 мл метанола и 0,01 мл липидов 10 мг/мл.
  2. Подготовка тефлоновой пластины
    1. Облицовка тефлоновой пластины в метаноловой ванне в течение 5 минут.
    2. Смойте горячей водой в течение 15 минут.
    3. Промыть дистиллированной водой.
    4. Высушите тефлоновую пластину в осушителе в течение 30 минут и держите ее под вакуумом, когда она не используется(рисунок 1).

3. Образование липидного монослоя на буферном резервуаре

ПРИМЕЧАНИЕ: Расчетное время работы: 1,5 часа

  1. В день эксперимента приготовьте липидную смесь 0,01 мг/мл в смеси хлороформ/метанол 9:1.
  2. Поместите фильтровальную бумагу Type-1 в чашку Петри и расположите тефлоновый блок поверх фильтровальной бумаги.
  3. Заполните колодцы тефлоновой пластины 60 мкл буфера.
  4. Осторожно добавляйте липидную смесь поверх буферной поверхности капля за каплей (в идеале 1 мкл на каплю) с помощью шприца Гамильтона.
  5. Смочите фильтровальную бумагу дистиллированной водой, чтобы сохранить влажность в чашке Петри.
  6. Инкубировать при комнатной температуре в течение 60 минут. Хлороформ должен испариться, и на поверхности буфера должен образоваться монослой липида.

4. Нанесение ЭМ сетки на липидный монослой

ПРИМЕЧАНИЕ: Расчетное время работы: 1,5 часа

  1. Аккуратно поместите дырявую ЭМ-сетку с углеродным покрытием без свечения, углеродную сторону вниз, на верхнюю часть каждого буферного резервуара.
  2. Осторожно вводят белки в боковую инъекцию хорошо. Используйте конечные концентрации белка в скважине около 1 мкМ белка в качестве отправной точки. Предварительно оптимизируйте концентрацию белка перед экспериментом.
  3. Инкубировать в течение 60 минут при комнатной температуре.
  4. Осторожно вводят приблизительно 20-30 мкл буфера в боковой инжекционный порт. Это поднимет сетку над поверхностью тефлонового блока.
  5. Сразу же поднимите сетку пинцетем и поднимите ее вертикально от капельки.
  6. Подготовьте монослойные образцы для отрицательного окрашивания или крио-ТЭМ визуализации(рисунок 2). Если белки образуют 2D-массив, спектр мощности изображения или периодограмма Фурье будут показывать интенсивности дифракции на пространственных частотах на основе кристаллической симметрии. Если в спектре мощности не показаны дифракционные пятна, белки вряд ли образуют 2D-кристалл.
  7. Проверьте покрытие липидного монослоя на электромагнитной сетке с помощью просвечивая электронного микроскопа (ТЭМ). Изображение электронов с меньшим увеличением полезно для идентификации морфологии покрытого монослоя. Обычно контрастность изображения в области, покрытой монослоем, будет немного ниже, чем у непокрытых областей. Кроме того, рассчитанный спектр мощности 2D-изображения поможет определить местоположение 2D-кристалла.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Липидный монослой, нанесенный на электромагнитную сетку, может быть визуализирован под просвечивающим электронным микроскопом (ТЭМ) без окрашивания. Присутствие монослоя можно распознать по контрастной разнице с областью без какого-либо образца на пути луча. Области, которые имеют липидное монослойное покрытие, имеют более низкий локальный контраст, чем те, которые не имеют покрытия, так как электронный пучок через пустые дыры не имеет рассеяния и показывает более яркое освещение(рисунок 3)....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Липидный монослой является мощным инструментом, способствующим росту крупных 2D-кристаллов для структурных исследований биологических макромолекул. Для успешного приготовления интактного липидного монослоя на границе раздела воздух-вода настоятельно рекомендуется, чтобы липиды были приготовлены свежими в день эксперимента, поскольку окисление липидной ациловой цепи может привести к нарушению упаковки в монослое и негативно повлиять на образование кристаллов. Приобретенные липиды в виде порошка следует растворять с исполь...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют права заявлять о конфликте интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подготовка этой рукописи была частично поддержана Исследовательским управлением армии США (W911NF2010321) и стартовыми фондами Университета штата Аризона для P.-L.C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
14:0 PC (DMPC)Avanti Lipids8503451,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолин,
1 x 25 мг, 10 мг/мл, 2,5 мл
Колба для малых пипетокFisher Scientific03-448-21
ХлороформSigma-AldrichC2432
Адсорбционный вакуумSouthern Labware55207
EM решеткиЭлектронная микроскопиянауки CF413-50CF-1.2/1.3-4C 1.2 и микро; отверстие m, 1.3 & микро; m space
Фильтровальная бумагаGE Healthcare Life Sciences1001-090Диаметр 90 мм
Стекло Пастеровские пипеткиFisher Scientific13-678-20A
Шприц Hamilton (25 &; L)Hamilton Company80465
Шприц Hamilton (250 & микро; L)Hamilton Company81165
Шприц Hamilton (5 & микро; L)Hamilton Company87930
Шприц Hamilton (500 & микро; L)Hamilton Company203080
МетанолSigma-AldrichM1775-1GA
Чашка ПетриVWR25384-342100 мм × 15 мм
Тефлоновый блокGrainger55UK0560 &; L лунки с боковыми отверстиями для впрыска, вручную изготовленные
ПинцетЭлектронная микроскопия Sciences78325Различные стили
Сверхчистая вода
Ультразвуковой очистительVWR97043-996

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raunser, S., Walz, T. Electron crystallography as a technique to study the structure on membrane proteins in a lipidic environment. Annual Review of Biophysics. 38 (1), 89-105 (2009).
  2. Avila-Sakar, A. J., Chiu, W. Visualization of beta-sheets and side-chain clusters in two-dimensional periodic arrays of streptavidin on phospholipid monolayers by electron crystallography. Biophysical Journal. 70 (1), 57-68 (1996).
  3. Braun, T., Engel, A. Two-dimensional electron crystallography. Nature Encyclopedia of Life Sciences. , (2004).
  4. Wang, H. -W., Wang, J. -W. How cryo-electron microscopy and X-ray crystallography complement each other. Protein Science: a publication of the Protein Society. 26 (1), 32-39 (2017).
  5. Williams, D. B., Carter, C. B. Transmission electron microscopy. , Springer. New York, NY. (2016).
  6. Abeyrathne, P. D., et al. 1.15 Analysis of 2-D Crystals of Membrane Proteins by Electron Microscopy. Comprehensive Biophysics. , 277-310 (2012).
  7. Muller, M. P., et al. Characterization of Lipid-Protein Interactions and Lipid-Mediated Modulation of Membrane Protein Function through Molecular Simulation. Chemical Reviews. 119 (9), 6086-6161 (2019).
  8. Martínez-Ballesta, M. D. C., Carvajal, M. Mutual Interactions between Aquaporins and Membrane Components. Frontiers in Plant Science. 7, 1322(2016).
  9. Hite, R. K., Chiu, P. -L., Schuller, J. M., Walz, T. Effect of lipid head groups on double-layered two-dimensional crystals formed by aquaporin-0. PloS One. 10 (1), 0117371(2015).
  10. Murata, K., et al. Structural determinants of water permeation through aquaporin-1. Nature. 407 (6804), 599-605 (2000).
  11. Schenk, A. D., et al. The 4.5 A structure of human AQP2. Journal of Molecular Biology. 350 (2), 278-289 (2005).
  12. Gonen, T., et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638 (2005).
  13. Hiroaki, Y., et al. Implications of the aquaporin-4 structure on array formation and cell adhesion. Journal of Molecular Biology. 355 (4), 628-639 (2006).
  14. Gonen, T., Sliz, P., Kistler, J., Cheng, Y., Walz, T. Aquaporin-0 membrane junctions reveal the structure of a closed water pore. Nature. 429 (6988), 193-197 (2004).
  15. Chiu, P. -L., et al. The structure of the prokaryotic cyclic nucleotide-modulated potassium channel MloK1 at 16 A resolution. Structure. 15 (9), 1053-1064 (2007).
  16. Kowal, J., et al. Ligand-induced structural changes in the cyclic nucleotide-modulated potassium channel MloK1. Nature Communications. 5, 3106(2014).
  17. Walz, T., Grigorieff, N. Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins. Journal of Structural Biology. 121 (2), 142-161 (1998).
  18. Yeager, M., Dryden, K. A., Ganser-Pornillos, B. K. Lipid monolayer and sparse matrix screening for growing two-dimensional crystals for electron crystallography: methods and examples. Methods in Molecular Biology. 955, 527-537 (2013).
  19. Pal, S. Chapter 6 - Structure analysis and visualization. Fundamentals of Molecular Structural Biology. , 119-147 (2020).
  20. Frey, W., et al. Two-dimensional protein crystallization via metal-ion coordination by naturally occurring surface histidines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4937-4941 (1996).
  21. Kubalek, E. W., Le Grice, S. F., Brown, P. O. Two-dimensional crystallization of histidine-tagged, HIV-1 reverse transcriptase promoted by a novel nickel-chelating lipid. Journal of Structural Biology. 113 (2), 117-123 (1994).
  22. Vénien-Bryan, C., et al. Structural study of the response regulator HupR from Rhodobacter capsulatus. Electron microscopy of two-dimensional crystals on a nickel-chelating lipid. Journal of Molecular Biology. 274 (5), 687-692 (1997).
  23. Merritt, E. A., Sarfaty, S., vanden Akker, F., L'Hoir, C., Martial, J. A., Hol, W. G. Crystal structure of cholera toxin B-pentamer bound to receptor GM1 pentasaccharide. Protein Science: a publication of the Protein Society. 3 (2), 166-175 (1994).
  24. Mosser, G., Mallouh, V., Brisson, A. A 9 A two-dimensional projected structure of cholera toxin B-subunit-GM1 complexes determined by electron crystallography. Journal of Molecular Biology. 226 (1), 23-28 (1992).
  25. Edwards, A. M., Darst, S. A., Hemming, S. A., Li, Y., Kornberg, R. D. Epitaxial growth of protein crystals on lipid layers. Nature Structural Biology. 1 (3), 195-197 (1994).
  26. Olofsson, A., Mallouh, V., Brisson, A. Two-dimensional structure of membrane-bound annexin V at 8 A resolution. Journal of Structural Biology. 113 (3), 199-205 (1994).
  27. Ribi, H. O., Ludwig, D. S., Mercer, K. L., Schoolnik, G. K., Kornberg, R. D. Three-dimensional structure of cholera toxin penetrating a lipid membrane. Science. 239 (4845), 1272-1276 (1988).
  28. Celia, H., et al. Three-dimensional model of Escherichia coli gyrase B subunit crystallized in two-dimensions on novobiocin-linked phospholipid films. Journal of Molecular Biology. 236 (2), 618-628 (1994).
  29. Darst, S. A., Kubalek, E. W., Kornberg, R. D. Three-dimensional structure of Escherichia coli RNA polymerase holoenzyme determined by electron crystallography. Nature. 340 (6236), 730-732 (1989).
  30. Schultz, P., et al. Structural study of the yeast RNA polymerase A. Electron microscopy of lipid-bound molecules and two-dimensional crystals. Journal of Molecular Biology. 216 (2), 353-362 (1990).
  31. Dryden, K. A., Crowley, C. S., Tanaka, S., Yeates, T. O., Yeager, M. Two-dimensional crystals of carboxysome shell proteins recapitulate the hexagonal packing of three-dimensional crystals. Protein Science: a publication of the Protein Society. 18 (12), 2629-2635 (2009).
  32. Barklis, E., McDermott, J., Wilkens, S., Fuller, S., Thompson, D. Organization of HIV-1 capsid proteins on a lipid monolayer. The Journal of BIOLOGICAL CHemistry. 273 (13), 7177-7180 (1998).
  33. Barklis, E., et al. Structural analysis of membrane-bound retrovirus capsid proteins. The EMBO Journal. 16 (6), 1199-1213 (1997).
  34. Kelly, D. F., Dukovski, D., Walz, T. Monolayer purification: a rapid method for isolating protein complexes for single-particle electron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4703-4708 (2008).
  35. Reis, A., Rudnitskaya, A., Blackburn, G. J., Mohd Fauzi, N., Pitt, A. R., Spickett, C. M. A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL. Journal of Lipid Research. 54 (7), 1812-1824 (2013).
  36. Ueda, E. K. M., Gout, P. W., Morganti, L. Current and prospective applications of metal ion-protein binding. Journal of Chromatography. A. 988 (1), 1-23 (2003).
  37. Dietrich, J., nien-Bryan, C. Strategies for Two-dimensional Crystallization of Proteins Using Lipid Monolayers. , Imperial College Press. (2005).
  38. Kuang, Q., Purhonen, P., Hebert, H. Two-Dimensional Crystallization Procedure, from Protein Expression to Sample Preparation. BioMed Research International. 2015, 693869(2015).
  39. De Zorzi, R., Nicholson, W. V., Guigner, J. -M., Erne-Brand, F., Vénien-Bryan, C. Growth of large and highly ordered 2D crystals of a K+ channel, structural role of lipidic environment. Biophysical Journal. 105 (2), 398-408 (2013).
  40. Johnson, M. C., Schmidt-Krey, I. Two-dimensional crystallization by dialysis for structural studies of membrane proteins by the cryo-EM method electron crystallography. Methods in Cell Biology. 113, 325-337 (2013).
  41. Rémigy, H. -W., Caujolle-Bert, D., Suda, K., Schenk, A., Chami, M., Engel, A. Membrane protein reconstitution and crystallization by controlled dilution. FEBS Letters. 555 (1), 160-169 (2003).
  42. Braun, T., Kaufmann, T. C., Rémigy, H., Engel, A. Two-dimensional Crystallization of Membrane Proteins. Encyclopedic Reference of Genomics and Proteomics in Molecular Medicine. , 1936-1942 (2006).
  43. Lebeau, L., Vénien-Bryan, C. Monolayer two-dimensional crystallization of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 955, 59-71 (2013).
  44. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  45. Lebeau, L., et al. Two-dimensional crystallization of a membrane protein on a detergent-resistant lipid monolayer. Journal of Molecular Biology. 308 (4), 639-647 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lipid MonolayerElectron Crystallography2D CrystallizationMembrane ProteinsSoluble ProteinsCryogenic Electron MicroscopyEM Grid PreparationTransmission Electron MicroscopeProtein Structure DeterminationSurface Tension

Related Articles