Фоторазлагаемые гидрогелевые интерфейсы для скрининга, отбора и выделения бактерий

Summary

Сообщается об использовании фоторазлагаемых гидрогелей для выделения бактериальных клеток с помощью инструмента для измерения света с высоким разрешением. Рассматриваются основные экспериментальные процедуры, результаты и преимущества процесса. Метод обеспечивает быструю и недорогую изоляцию целевых бактерий, проявляющих редкие или уникальные функции, из гетерогенных сообществ или популяций.

Abstract

Биологи давно пытаются понять взаимосвязь между фенотипом и генотипом. Чтобы лучше понять эту связь, крайне важно разработать практические технологии, которые сочетают микроскопический скрининг клеток с выделением клеток высокой чистоты для последующего генетического анализа. Здесь описано использование фоторазлагаемых поли(этиленгликолевых) гидрогелей для скрининга и выделения бактерий с уникальными фенотипами роста из гетерогенных клеточных популяций. Метод основан на инкапсуляции или захвате клеток гидрогелем с последующим культивированием, микроскопическим скринингом, затем использованием инструмента светового паттерна высокого разрешения для пространственно-временного контроля деградации гидрогеля и высвобождения выбранных клеток в раствор для извлечения. Применение различных световых паттернов позволяет контролировать морфологию извлеченной клетки, а такие паттерны, как кольца или кресты, могут быть использованы для извлечения клеток с минимальным прямым воздействием ультрафиолетового света для смягчения повреждения ДНК изолятами. Кроме того, инструмент для построения светового паттерна обеспечивает регулируемую дозу света для достижения различных стадий деградации и высвобождения клеток. Он обеспечивает деградацию с высоким разрешением, обеспечивая извлечение клеток с пространственной точностью в микронном масштабе. Здесь демонстрируется использование этого материала для скрининга и извлечения бактерий как из объемных гидрогелей, так и из микрофабрикатных лабораторных устройств. Метод является недорогим, простым и может быть использован для распространенных и новых применений в микробиологии, включая выделение бактериальных штаммов с редкими профилями роста из библиотек мутантов и выделение бактериальных консорциумов с возникающими фенотипами для геномных характеристик.

Introduction

Выделение клеток с уникальным поведением из сложной и гетерогенной среды имеет основополагающее значение для получения генетической информации в биологии^1. В микробиологии отбор и выделение редких или уникальных микробов после наблюдения становится важным во многих приложениях, требующих связи между геномной информацией и наблюдаемой фенотипической информацией. Эти приложения включают выбор фенотипически редких штаммов из мутантных библиотек^2,отбор ключевых микроорганизмов из сложных микробных сообществ^3,4и отбор фенотипически редких, но важных бактерий из изогенных популяций. Выделение жизнеспособных, но некультурных клеток (VBNC) из популяции бактерий является важным примером последнего, где клетки с фенотипом VBNC часто скрыты в популяциях бактерий в соотношениях 1:10² до 1:10^{5 5,6.} Из-за широко распространенных трудностей в выделении бактерий многое остается неизвестным о многих фенотипически редких микроорганизмах. Эти ограничения подчеркивают необходимость того, чтобы методы изоляции клеток сначала идентифицировали клетку-мишень или клетки из смеси, а затем извлекали и изолировали их для последующего молекулярного анализа^7.

Некоторые из наиболее часто устанавливаемых методов изоляции клеток включают проточную цитометрию и флуоресцентную активированную сортировку клеток (FACS)^8,иммуномагнитное разделение^9,10и микрофлюидику^11. Хотя эти методы изоляции имеют высокую ценность, они также имеют недостатки, которые ограничивают их использование. Например, FACS может обеспечить рутинную микробную изоляцию на уровне одной клетки для последующего геномного анализа^3, но часто ограничена его доступностью и стоимостью, а также проблемами загрязнения^11. Микрофлюидные подходы, такие как микрофлюидная проточная цитометрия, получили большое внимание, что, по сравнению с обычной проточной цитометрией, позволяет значительно уменьшить требуемый объем образца^12. Однако разделение и извлечение отдельных или небольших коллекций клеток из микрофлюидных устройств часто является сложной задачей, которая обычно требует более сложной настройки и конструкции устройства^13. Многие микрофлюидные подходы генетически характеризуют клетки до того, как они будут введены и наблюдаемы в устройстве^14,ограничивая количество уникальных видов, наблюдаемых при выполнении функционального экрана. Учитывая эти ограничения, для широкого использования во многих лабораториях требуются дальнейшие инновации как методов, так и материалов, которые являются практичными для скрининга и изоляции клеток.

В этой статье представлен новый, основанный на материалах подход к скринингу и изоляции бактерий. Метод использует фоторазлагаемые гидрогели для инкапсуляции клеток, культивирования, микроскопического наблюдения, а также высвобождения и восстановления по требованию целевых бактерий с уникальными фенотипами. Гидрогели рассчитаны на содержание 10 нм размера сетки, где каждое сшитое звеносодержит o-нитробензиловые группы^15. Материал инкапсулирует или захватывает клетки для наблюдения, обеспечивая при этом диффузию питательных веществ и отходов в клетки и из них для культивирования. Воздействие на материал узорчатого 365 нм УФ-источника света через вертикальный микроскоп позволяет локально разрушать гидрогель через фоторасщепление о-нитробензиловых групп^16,17. Деградация вызывает селективное высвобождение клеток для восстановления для последующего анализа, включая геномный и, возможно, протеомный и транскриптомный анализ. Экспериментальная установка и протокол относительно просты, недороги и трансляционны для микробиологических лабораторий. Он требует только инкапсуляции клеток путем образования гидрогеля, наблюдения захваченных клеток с помощью вертикального яркого поля и флуоресцентного микроскопа и освещения интересующих клеток узорчатым источником ультрафиолетового света для извлечения.

Ключевым преимуществом этого подхода к скринингу на основе материалов является его адаптивность к различным форматам скрининга. В своем самом базовом формате материал может быть использован для скрининга путем инкапсуляции гетерогенной коллекции клеток в объемные гидрогели. Затем клетки наблюдают за желаемым фенотипом, а отдельные клетки, представляющие интерес, удаляются для геномной характеристики. В более сложных форматах материал также может быть интегрирован в лабораторные устройства для обеспечения точного высвобождения и извлечения клеток из желаемых областей устройства. Оба формата описаны здесь, и оба позволили в последнее время использовать новые приложения для микробного скрининга и отбора^17,18,19. Метод демонстрируется здесь с помощью модели грамотрицательных организмов(Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens)и модельного грамположительного организма(Bacillus subtilis)и был легко распространен на множество других бактерий.

Protocol

1. Бактериальные штаммы и протоколы культивирования

1. Полосы колоний бактерий на агаровых пластинах, дополненных соответствующими питательными средами. В этом отчете B. subtilis (штамм 1A1135, Bacillus Genetic Stock Center) культивируют на ATGN (0,079 M KH₂PO_4,0,015 M (NH₄)₂SO_4,0,6 мМ MgSO₄·7H₂O, 0,06 мМ CaCl₂·2H₂O, 0,0071 мМ MnSO₄· H₂O, 0,125 М FeSO_4· 7H₂O, 28 мМ глюкозы, рН: 7 ± 0,2, 15 г/л агара) агаровые пластины, дополненные 100 мкг/мл спектиномицином и кишечной палочкой (штамм 25922, ATCC) на агаровых пластинах ATGN, дополненных ампициллином 100 мкг/мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предыдущие сообщения об инкапсуляции и высвобождении гидрогеля с этими материалами из Fattahi et al.¹⁹ вместо этого использовали клетки A. tumefaciens C58
2. Соберите желаемые колонии из тарелок агара ATGN и начните выращивать ночные культуры. Для штаммов E. coli и B. subtilis, используемых здесь, культивируют при 37 °C при встряхивании при 215 об/мин в жидкой среде ATGN в течение 24 ч. Храните клеточные культуры в 50% глицерине при -80 °C до будущего использования.
3. Отбирайте колонии обоих штаммов из запасов глицерина с помощью стерильных петель инокуляции и инкубируйте в жидкой среде ATGN в течение 24 ч при 37 °C и 215 об/мин.

2. Подготовка материала, необходимого для образования гидрогеля

1. Фоторазлагаемый синтезПЭГ-о-NB-диакрилата
   ПРИМЕЧАНИЕ: Внутренний синтез ПЭГ-о-NB-диакрилата был хорошо описан и ранее сообщал^16,17. В качестве альтернативы, поскольку синтез является рутинным, он может быть передан на аутсорсинг из установки химического синтеза.
2. Буфер перекрестных ссылок
   1. Возьмите рецепт выбранной среды для бактериального штамма и приготовьте среду с 2x питательными веществами. Добавьте фосфат, например,₂PO_4, в среду до конечной концентрации 100 мМ. Затем отрегулируйте значение pH до 8, используя 5 M NaOH (aq).
   2. Стерилизуют буферный раствор и хранят при -20 °C до дальнейшего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исключите любые переходные металлы, присутствующие в средах, поскольку эти металлы катализируют окисление тиолов до дисульфидов.
3. ПЭГ-о-NB-диакрилатный раствор
   1. На каждый мг порошкааликвоты ПЭГ-о-NB-диакрилата (молекулярная масса 3 400 Да) добавляют 3,08 мкл сверхчистой воды, чтобы достичь концентрации ПЭГ-о-NB-диакрилата 49 мМ (концентрация акрилата 98 мМ).
   2. Вращайте раствор до тех пор, пока он не будет хорошо перемешан, и храните этот раствор при -20 °C до дальнейшего использования.
4. 4-х позиционный ПЭГ-тиоловый раствор
   1. Для приготовления 4-арметического ПЭГ-тиола (молекулярная масса 10 000 Да) добавляют 4 мкл сверхчистой воды на мг порошка для достижения концентрации 20 мМ (80 мМ концентрации тиола).
   2. Вихрьте этот раствор до тех пор, пока он не будет хорошо перемешан, и храните этот раствор при -20 °C до дальнейшего использования.

3. Приготовление перфторалкилированных (нереакционноспособных) покровов

1. Поместите до 5 стеклянных слайдов (25 мм x 75 мм x 1 мм) внутрь полипропиленового скользящего почтового устройства. Обмазывайте слайды 2% (мас./об.) раствором моющего средства(Таблица материалов)в течение 20 мин.
2. Промойте горки три раза сверхчистой водой, затем обработайте горки ультразвуком в воде в течение 20 минут. Высушите горки с помощью потока N_2.
3. Плазменная очистка (см. Таблицу материалов)с обеих сторон стеклянных слайдов согласно протоколу в разделе 4.1 в течение 2 мин.
4. Поместите очищенные плазмой слайды обратно в скользящую почтовую машину и заполните контейнер 0,5% (v/v) раствором трихлор(1H, 1H, 2H, 2H,-перфтороктил)силана в толуоле. Позвольте этим стеклянным слайдам быть функционализированными в течение 3 ч при комнатной температуре (RT).
5. После того, как слайды будут функционализированы, промойте слайды в почтовом устройстве, сначала толуолом, а затем этанолом (три раза с каждым растворителем). Затем высушите каждый функционализированный слайд потоком N_2.

4. Приготовление тиол функционализированных (базовых) обложек

1. Очистка стеклянных крышек с помощью плазменного очистителя
   1. Поместите обшивки размером 18 мм x 18 мм в чашку Петри. Затем поместите чашку Петри в камеру плазмоочистителя и включите питание плазмоочистителя.
   2. Включите вакуумный насос, чтобы очистить воздух в камере до тех пор, пока манометр не покажет 400 мТорр.
   3. Откройте дозирующий клапан, чтобы впустить воздух в камеру до тех пор, пока манометр не достигнет постоянного давления (800-1000 мТорр). Затем выберите RF с режимом «Привет» и выставьте крышки в течение 3 минут.
   4. Через 3 минуты выключите режим RF и вакуумный насос.
   5. Выньте чашку Петри из камеры, переверните крышки и поместите их обратно в камеру, чтобы плазма обнажила другую сторону стеклянного покрова.
   6. Повторите шаги 4.1.2-4.1.4, чтобы плазмой очистить необработанную сторону стеклянной крышки.
   7. После завершения процесса извлеките чашку Петри из камеры и выключите плазмоочиститель и вакуумный насос.
2. Очистка и гидроксилирование обшивки раствором пирании
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартные протоколы очистки пираний могут использоваться для очистки и гидроксилатных стеклянных слипов. Раствор пираньи представляет собой смесь H 2 O 2 и_H2SO₄30:70 (v/v). Также могут быть использованы альтернативные методы очистки стеклянных крышек.
   ВНИМАНИЕ: Раствор пираньи сильно коррозионный и взрывоопасный с органическими растворителями и с ним следует обращаться с особой осторожностью. Должны быть приняты соответствующие меры безопасности и сдерживания, такие как использование надлежащих средств индивидуальной защиты (лабораторный халат, химически стойкий фартук, защитные очки, лицевой щиток, кислотостойкие бутильные перчатки). Вся стеклянная посуда и рабочие поверхности, контактирующие с раствором пираньи, должны быть чистыми, сухими и свободными от органических остатков перед использованием. Раствор пираньи никогда не следует хранить в частично закрытой или закрытой таре.
   1. Поместите чистую стеклянную посуду размером 100 мм x 50 мм на магнитную мешалку с регулируемой скоростью перемешивания под вытяжной шкаф и добавьте в тарелку 14 мл H₂SO_4.
   2. Аккуратно поместите небольшой магнитный перемешиватель с тефлоновым покрытием, используя щипцы с тефлоновым покрытием, внутрь тарелки. Затем медленно поверните мешалку, чтобы избежать разбрызгивания кислоты.
   3. Затем аккуратно добавить в блюдо 6 мл H_2O2 и дать раствору хорошо перемешаться.
   4. Выключите мешалку, затем с помощью щипцов выньте из тарелки перемешину. Затем аккуратно поместите крышки внутрь тарелки с помощью щипцов и установите температуру на 60–80 °C.
   5. Через 30 мин аккуратно снимите обшивки с помощью щипцов и дважды погрузите их в воду деионизированной воды (DI), чтобы смыть остаточный раствор пираньи.
   6. После промывки водой храните крышки в воде DI в RT до дальнейшего использования.
   7. Выключите конфорку и дайте раствору пираньи остыть.
   8. Чтобы утилизировать раствор пираньи, аккуратно поместите стеклянную посуду размером 100 мм х 50 мм, содержащую охлажденный раствор пираньи, в более крупный пустой стеклянный стакан объемом не менее 1,5 л. Затем добавьте 1 л воды для разбавления и добавьте порошок бикарбоната натрия для нейтрализации. Обратите внимание, что бикарбонат натрия вызовет пузырьки и выделение тепла и должен добавляться очень медленно, иначе пузырьки могут привести к разбрызгиванию кислоты. Когда дальнейшее добавление бикарбоната натрия не вызывает пузырьков, проверьте рН с помощью рН-бумаги, чтобы убедиться, что он был нейтрализован. После того, как раствор будет нейтрализован и охлажден, его можно вылить в раковину.
3. Тиол функционализация чехлов
   1. Готовят 5% (v/v) раствор 269 мМ (3-меркаптопропил) триметоксисилана (MPTS) раствора в сухом толуоле.
   2. Добавьте 10 мл раствора в отдельные конические центрифужные трубки объемом 50 мл и поместите по одному очищенному покровному листу в каждую трубку и погрузите его в раствор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Один крышка на трубку объемом 50 мл используется для обеспечения тиолирования обеих сторон субстрата без нарушения другими субстратами.
   3. Через 4 ч промывайте каждую крышку (четыре промывки на крышку) толуолом, этанолом 1:1 (v/v): смесью толуола и этанолом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это делается путем последовательного погружения каждого крышки в конические центрифужные трубки, содержащие упомянутые растворы.
   4. После промывки субстрата погрузите их в этанол и храните при 4 °C до дальнейшего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от количества обложек, этот метод может стать трудоемким из-за обработки обложек по одному. Для нескольких крышек можно использовать банки Columbia, которые подходят для нескольких крышек одновременно.

5. Изготовление кремниевых микроскважинных массивов

1. Париленовое покрытие: Используйте стандартный протокол, описанный в предыдущих исследовательских статьях^20,21, для покрытия кремниевых пластин париленом.
2. Микрофабрикация: Следуйте протоколу, описанному Barua et al.^18, для проектирования и изготовления массивамикролунок (дополнительный рисунок 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартные фотолитографические методы, описанные Timm et al.^17, были применены для изготовления микролуночных массивов на кремниевых пластинах с париловым покрытием.

6. Образование гидрогеля

1. Образование объемного гидрогеля на стеклянных крышках
   1. Раствор предшественника гидрогеля: Добавьте 12,5 мкл сшивающего буфера в микроцентрифужную трубку объемом 0,5 мл, а затем 5,6 мклраствораПЭГ-о-NB-диакрилата. Наконец, добавьте в смесь 6,9 мкл 4-позиционного ПЭГ-тиольного раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление 4-рычажного тиола ПЭГ в смесь инициирует реакцию сшивания. Таким образом, раствор предшественника гидрогеля следует использовать сразу после смешивания.
   2. Для инкапсуляции клеток в растворе предшественника гидрогеля выполните шаги 6.1.3-6.1.9.
   3. Для инкапсуляции клеток перед этапом 6.1.1 инокулируют буфер сшивки с желаемой плотностью клеток. Как сообщалось^{ранее 19,}было замечено, что плотность клеток 7,26 × 10⁷ КОЕ/мл в буфере сшивания коррелирует с плотностью ~ 90 клеток/мм2, инкапсулированной через гидрогель.
   4. Поместите тиолированную основную крышку на чистую чашку Петри. Поместите две распорки (см. Таблицу материалов)на две противоположные стороны крышки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тиоловая функционализация покровных губ необходима для ковалентного прикрепления гидрогеля к поверхности покровного листа. Это делается посредством реакции тиоловых групп на поверхности и акрилатных групп, присутствующих в растворе предшественника гидрогеля.
   5. Закрепите распорки на крышке основания, приклеив распорки к чашке Петри.
   6. Пипетка желаемого объема раствора предшественника на нереакционноспособном, перфторалкилированном стеклянном слайде.
   7. Поместите перфторалкилированную стеклянную горку на основание крышки(рисунок 1С). Подождите 25 минут на RT для завершения образования гидрогеля.
   8. После гелеобразования аккуратно удалите перфторалкилированное стекло. Гидрогель будет оставаться прикрепленным к основанию крышки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для обшивки размером 18 мм х 8 мм для получения мембраны толщиной 12,7 мкм используйте ~7 мкл растворапредшественника (рисунок 1A,B). Использование больших объемов раствора прекурсора может привести к образованию гидрогеля под основанием покровного листа. Это может привести к тому, что крышка основания прилипнет к чашке Петри и сломается при попытке удаления. Кроме того, остаток гидрогеля под крышкой проблематичен для микроскопии. Требуется бережное удаление нереакционноспособного перфторалкилированного стекла, так как быстрое удаление может повредить гидрогель.
   9. Поместите подложку в чашку Петри размером 60 мм x 15 мм в указанной культуральной среде. Здесь среду ATGN, дополненную 100 мкг/мл спектиномицина для B. subtilis или 100 мкг/мл ампициллина для E.coli при 37 °C, использовали в течение 24 ч культурального времени.

Рисунок 1:Образование гидрогеля на тиолированных стеклянных покровах. (А)Распорки толщиной 12,7 мкм размещают на двух противоположных сторонах основания покровного листа, содержащего реакционноспособные тиольные группы. (B)Раствор предшественника гидрогеля пипетируют на нереакционноспособном фторированном стеклянном предметном стекле. (C)Нереактивный стеклянный затвор помещается на распорки для образования гидрогеля толщиной 12,7 мкм. (D)Нереакционноспособный стеклянный затвор осторожно удаляют, оставляя гидрогель прикрепленным к основанию крышки. (E)Приготовленный гидрогель может быть инкубирован в средах для культивирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

7. Образование гидрогеля над массивами микролунок

1. Посев бактерий в микроскважинных массивах
   ПРИМЕЧАНИЕ: 700 мкл суспензий 0,1 OD₆₀₀ клеток были засеяны на подложки микролуночного массива, и метод париленового взлета был применен для удаления клеток с фона с использованием протокола, описанного Timm etal. ²².
2. Готовят раствор-предшественник гидрогеля, добавляя 5,6 мкл ПЭГ-о-NB-диакрилата с 12,5 мкл pH 8 фосфатно-буферного физиологического раствора ATGN и смешивая с 6,9 мкл четырехгруппового тиольного раствора ПЭГ.
3. Пипетка 12,5 мкл раствора-предшественника на нереакционноспособном перфторалкилированном стеклянном слайде и размещение двух 38 мкм стальных распорок (см. Таблицу материалов)на двух противоположных сторонах подложки микролуночного массива, инокулированной ячейками.
4. Переверните перфторалкилированное стекло с помощью капли раствора предшественника и поместите каплю в середину микролуночной подложки. Затем инкубируют в течение 25 мин на РТ для образования гидрогеля.
5. Аккуратно снимите стеклянную горку с подложки из микролунки. Гидрогелевая мембрана должна оставаться прикрепленной к субстрату микролунки. Перейдите к шагу 6.1.9.

8. Подготовка материала к извлечению клеток

1. Подготовка держателя PDMS
   1. Склейте стопку из десяти обложек размером 18 x 18 мм и приклейте эту стопку обложек на дно чашки Петри.
   2. Для изготовления держателей PDMS смешайте предшественник PDMS и отверждатель в соотношении 10:1 в пластиковом стаканчике, дегазируйте смесь в вакуумном осушителе, а затем перелейте смесь в чашку Петри.
   3. Вылечите PDMS в течение 90 мин при 80 °C. Затем обрежьте вокруг заклеенного блока, чтобы извлечь держатель PDMS, и поместите держатель PDMS на стеклянный слайд для облегчения обработки при микроскопии.
2. Подготовка микрошприцев и трубок
   1. Отрежьте 20 см трубки из PTFE (0,05 в I.D.) и прикрепите один конец трубки к шприцу из микролита объемом 100 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для экстракции избегайте использования пипеток, так как вытягивание высвобождаемых клеток через наконечник пипетки может повредить поверхность гидрогеля и привести к загрязнению.

9. Деградация гидрогеля с помощью инструмента узорчатого освещения

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие этапы, описанные в настоящем разделе, идентичны как для объемных гидрогелей, так и для микролуночных массивов, за исключением моделей светового воздействия, описанных на этапах 9.6.4-9.6.6 и 9.6.7-9.6.10.

1. Включите микроскоп (см. Таблицу материалов). Затем включите инструмент узорчатого освещения (см. Таблицу материалов).
2. Включите 365 нм светодиодный источник света Аналоговый и цифровой модуль управления. Затем включите светодиодный модуль управления источником света.
3. Откройте программное обеспечение микроскопа и программное обеспечение для инструмента узорчатого освещения. Когда откроется окно настройки оборудования, нажмите кнопку Загрузить.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь будут загружены три устройства. (Камера стороннего производителя, модуль управления и инструмент узорчатой подсветки)
4. Нажмите кнопку Пуск. Откроется окно программного обеспечения для создания световых узоров. Выберите первый параметр, кнопку Контроль устройств, на левой боковой панели окна.
5. Откалибруйте инструмент узорчатого освещения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровка должна выполняться с помощью того же объектива микроскопа и фильтра, которые будут использоваться для воздействия света.
   1. Установите объектив микроскопа на 10-кратное увеличение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это увеличение обеспечивает достаточное рабочее расстояние между линзой микроскопа и поверхностью образца. Он также позволяет контролировать и записывать процесс извлечения в режиме реального времени через окно изображения.
   2. Установите линзу микроскопа и фильтр на настройки, используемые для воздействия света, и поместите калибровочное зеркало под микроскоп.
   3. В окне Контроль устройств нажмите вкладку Управление светодиодами. Включите светодиод No1 и установите интенсивность света на нужное число. В стандартных экспериментах по экстракции этот показатель установлен на уровне 60%.
   4. Нажмите вкладку с названием инструмента узорчатой подсветки в окне Контроль устройств. Затем нажмите кнопку Показать сетку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На калибровочное зеркало будет проецироваться рисунок сетки.
   5. Отрегулируйте фокус микроскопа и экспозицию камеры для получения высокого качества изображения сетки и поверните камеру, чтобы выровнять линии сетки параллельно рамке окна камеры, если это необходимо.
   6. Нажмите кнопку Мастер калибровки на вкладке с названием продукта инструмента с узорчатой подсветкой и следуйте инструкциям, предоставленным программным обеспечением в этом окне.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Откроется окно настройки камеры стороннего производителя.
   7. Откроется окно Выбор типа калибровки. Выберите Автоматическая калибровка и нажмите Далее.
   8. Когда откроется окно Настройка предварительной калибровки, следуйте инструкциям по программному обеспечению и нажмите кнопку Далее.
   9. Когда откроется окно Сведения о сопоставлении, сохраните эту калибровку соответствующим образом в нужной папке. Это делается путем ввода даты, названия микроскопа, объектива и фильтра.
   10. После калибровки нажмите кнопку Определение рабочей области, расположенную под вкладкой с названием инструмента узорчатой подсветки, чтобы определить рабочую область инструмента узорчатого освещения, если это необходимо.
6. Раздел «Проектирование последовательностей» для подготовки шаблона.
   1. Нажмите кнопку Sequence Design на левой боковой панели окна программного обеспечения. Затем нажмите кнопку Редактор последовательностей профилей.
   2. Когда откроется окно Редактор последовательности профилей, выберите параметр Новый профиль в списке профилей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь откроется окно редактора шаблонов.
   3. Подготовьте нужный узор для освещения, выбрав различные формы и размеры узора, или при желании вручную нарисуйте узор.
   4. Для кольцевых и ломаных поперечных рисунков для объемного гидрогеля следуйте шагам 9.6.5-9.6.6
   5. Для круговых паттернов определите круг диаметром 30 мкм над колонией бактерий-мишеней, чтобы покрыть всю колонию. Выберите цвет заливки фигуры белый.
   6. Для сломанных крестовых узоров выберите форму прямоугольника из окна рисования узора с размерами 3 мкм x 8 мкм. Поместите четыре прямоугольника с этим измерением по краям целевой колонии, в то время как половина узоров имеет наложение с колонией.
   7. Для кольцевых и кольцевых схем для массивов микровелл выполните шаги 9.6.8-9.6.10.
   8. Для узоров кругов нарисуйте круг диаметром 10 мкм по периметру скважины. Выберите цвет заливки фигуры белый.
   9. Для кольцевого рисунка нарисуйте круг диаметром 20 мкм, поместите его над колодцем и выберите по форме заливку белого цвета.
   10. Нарисуйте еще один рисунок круга диаметром 10 мкм с заливкой формы цвета черного цвета и разместите его по периметру колодца.
7. Отредактируйте узор и измените фигуры в соответствии с требуемым методом извлечения. Убедитесь, что нужный узор существует в рабочей области инструмента узорчатого освещения.
8. Поместите образец в держатель PDMS и пипетку определенной среды поверх образца, чтобы предотвратить обезвоживание образца и обеспечить раствор-носитель для высвобождаемых клеток.
9. Затем замените его калибровочным зеркалом.
10. Отрегулируйте фокус микроскопа, чтобы получить четкое изображение колоний внутри гидрогеля. Осмотрите колонии, чтобы определить колонию, представляющую интерес.
11. Здесь спроектируйте световые паттерны, в то время как вид камеры показывает колонии внутри образца, чтобы проверить различные паттерны для извлечения клеток.
12. Сохраните определенный шаблон. После сохранения определенного шаблона выберите раздел Управление сеансами.
13. В этом разделе на вкладке с названием инструмента узорчатого освещения добавьте сохраненную последовательность.
14. После добавления последовательности выберите параметр имитации узора для просмотра и настройки требуемого местоположения экспозиции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Местоположение образца может быть скорректировано здесь, чтобы гарантировать, что шаблон проецируется точно на целевую область.
15. Затем отрегулируйте интенсивность света до 60% и время экспозиции до 40 с под светодиодной вкладкой управления и запустите процесс экспозиции.
16. Мониторинг деградации гидрогеля в режиме реального времени и в режиме яркого поля для обеспечения высвобождения клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предотвращайте любые перемещения образца во время воздействия света, так как это может привести к деградации нежелательных областей гидрогеля, что приведет к перекрестному загрязнению.

10. Извлечение клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура извлечения клеток идентична как для объемных гидрогелей, так и для массивов микролунок.

1. После воздействия света 365 нм и высвобождения клеток соберите клетки с помощью микролитрового шприца и микрофлюидной трубки(рисунок 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Извлечение клеток должно быть выполнено сразу после воздействия паттерна. Это позволяет локализовать восстановление клеток до того, как освобожденные клетки отойдут от облученной области.
2. Измените микроскоп с brightfield на фильтр FITC или TRITC, чтобы можно было визуализировать открытую область образца невооруженным глазом.
3. Как только открытая область будет расположена, поместите конец трубки на облученное место. Затем измените фильтр микроскопа обратно на brightfield, чтобы контролировать извлечение клеток в режиме реального времени.
4. Используйте шприц, прикрепленный к другому концу трубки, чтобы осторожно вывести освобожденные клетки. Извлеките 200 мкл раствора и вставьте раствор в центрифужную трубку объемом 1,5 мл для анализа ДНК или нанесения покрытия.

Рисунок 2:Схематическое изображение способа экстракции для сбора клеток, высвобождаемых из гидрогеля. Здесь, сразу после воздействия ультрафиолета 365 нм, деградации гидрогеля и высвобождения клеток, микроскоп используется для освещения образца гидрогеля светом от фильтра TRITC, в результате чего появляется ярко-зеленое пятно, покрывающее область, где произошло высвобождение клеток. Это помогает пользователю определить пространственное расположение для сбора образцов. После визуализации этой области в это место помещается коллекторная трубка, прикрепленная к микролитровому шприцу, и образец собирается. Микроскопия Brightfield при 10-кратном увеличении используется для мониторинга конца трубки и поверхности гидрогеля в режиме реального времени для точного сбора клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

11. Геномная очистка ДНК и измерение качества ДНК

1. Используйте набор для очистки ДНК (см. Таблицу материалов)для извлечения ДНК из изолятов бактерий.
   1. Следуйте спецификации производителя, описанной в руководстве²³ по набору для очистки ДНК, вплоть до последней стадии (стадия 7), требующей элюирования буфером AE.
   2. Для стадии элюирования следуйте спецификации производителя, с разницей в использовании 100 мкл буферного AE вместо 200 мкл.
   3. Повторите элюирование один раз, как описано в шаге 11.1.2. Этот шаг приводит к увеличению общего выхода ДНК.
2. Измерьте качество ДНК с помощью спектрофотометра UV-Vis (см. Таблицу материалов).
   1. Включите спектрофотометр. После инициализации устройства на домашней странице выберите опцию dsDNA на экране.
   2. Затем поднимите кронштейн пьедестала и очистите положение постамента водой DI и безворсовыми салфетками.
   3. Пипетка 2 мкл пустого раствора, здесь буфер AE, в положении пьедестала и аккуратно опустите кронштейн пьедестала вниз и выберите Пустой на экране.
   4. Затем поднимите пьедестал и очистите положение постамента водой DI, чтобы удалить любой остаточный материал от предыдущего измерения.
   5. Загрузите образец (2 мкл) в положение пьедестала, опустите кронштейн пьедестала вниз и нажмите кнопку «Измерить» на экране.
   6. Повторите шаги 11.2.4 и 11.2.5 для всех образцов.
   7. После завершения измерения выберите «Завершить эксперименты» на экране. Вставьте флешку в устройство и нажмите «Экспорт данных» на экране.

12. Определение жизнеспособности клеток из гидрогелевых и микролуночных экстрактов

1. Разбавляют бактериальные суспензии коэффициентом разбавления 10⁵ с помощью 96-луночной пластины.
2. Пипетка 10 мкл разбавленной бактериальной суспензии и трижды пятнистая на пластинах ATGN для каждой суспензии бактерий.
3. Наклоните пластины, чтобы распределить ячейки по поверхностям агара. Высушите на воздухе пластины ATGN, содержащие бактериальные суспензии.
4. Инкубировать пластины при 37 °C в течение 48 ч. Подсчитайте и запишите номера единиц формирования колоний (КОЕ). Подсчитайте все три спреда бактериальных суспензий на каждой пластине.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 12.1-12.4 в шкафу биологической безопасности, чтобы избежать загрязнения пластины.

Results

Чтобы исследовать способность ультрафиолетового света вызывать контролируемую деградацию гидрогеля для высвобождения клеток, гидрогели были сначала инкапсулированы поверх тиолированных покровных полос без присутствия бактерий. Каждый гидрогель подвергался воздействию трех повторяющихся круговых паттернов света с разной интенсивностью и временем воздействия. Процент деградации геля рассчитывали после воздействия ультрафиолетового света при каждой интенсивности света, а затем время экспозиции количественно определяли путем соединения подвесных тиольных групп с флуоресцеин-5-маэлимидным красителем для флуоресцентной визуализации^19,24. Репрезентативный пример того, как эти два параметра влияют на деградацию гидрогеля, показан на рисунке 3. Как видно, узорчатый свет, обеспечиваемый инструментом узорчатого освещения, обеспечивает пространственно-временной контроль деградации гидрогеля с разрешением, которое может обеспечить высвобождение только небольшого количества клеток.

Рисунок 3:Контроль за деградацией гидрогеля. Доза ультрафиолетового света и результирующая скорость деградации гидрогеля настраиваются с помощью инструмента узорчатого освещения. (Вставка) Для структурной деградации гидрогеля были выбраны две различные интенсивности света. После воздействия ультрафиолетового света 365 нм гидрогели были помечены флуоресцеин-5-малеимидом для флуоресцентной визуализации. Перепечатано (адаптировано) с разрешения Fattahi et al.¹⁹ Copyright 2020 American Chemical Society. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Для экстракции клеток использовались различные световые паттерны для исследования высвобождения клеток(рисунок 4). Здесь клетки бактерий Agrobacterium были инкапсулированы в объемные гидрогели поверх тиолированных стеклянных покровов, а затем культивировались в микромасштабные колонии. Затем гидрогели были проверены в микроскопии яркого поля, и целевые микроколонии подвергались воздействию различных моделей ультрафиолетового света. Было отмечено, что различные паттерны воздействия влияют на морфологию высвобождаемых клеток. Это потенциально выгодно для различных применений. Например, обнажение кольцевого рисунка вокруг целевой колонии приводит к высвобождению всей колонии, все еще инкапсулированной в защитный гидрогель ПЭГ и без прямого воздействия ультрафиолетового света(рисунок 4А),что может сохранить клетки и обеспечить легкую очистку вниз по течению. Напротив, подвергая часть или всю колонию воздействию ультрафиолетового света, клетки могут быть извлечены либо как агрегированные кластеры клеток(рисунок 4B),либо как свободные, отдельные клетки(рисунок 4C).

Рисунок 4:Контроль над морфологией извлеченных клеток. (A) Использование кольцевого паттерна для высвобождения всей клеточной колонии, защищенной в матрице PEG. (B)Использование нарушенного перекрестного паттерна для высвобождения клеток в агрегатах. (C) Использование перекрестного рисунка для высвобождения отдельных клеток. Перепечатано (адаптировано) с разрешения Fattahi et al.¹⁹ Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Критическим в протоколе инкапсуляции является как плотность посева клеток, так и толщина гидрогеля, поскольку оба эти параметра могут влиять на количество клеток, включенных в гидрогель для наблюдения. Для демонстрации образцы клеток A. tumefaciens инкапсулировали в гидрогели двух различных толщин с использованием тонких распорок (12,7 мкм) или толстых распорок (40 мкм), культивируемых и визуализированных в соответствии с установленными протоколами. Более тонкие гидрогели приводили к плотности микроколонии 90 колоний/мм2 по всему гидрогелю, где наблюдалось минимальное перекрытие колоний(рисунок 5А). Напротив, толщина гидрогеля более 12,7 мкм приводила к образованию перекрывающихся колоний в вертикальном направлении(рисунок 5B),что может привести к извлечению нескольких колоний. Перекрывающиеся колонии могут вызвать перекрестное загрязнение во время экстракции из-за двумерного характера светового рисунка. Например, верхняя колония может быть нацелена, в то время как нижележащая колония также извлекается с ее помощью(рисунок 5C). Поэтому для приготовления гидрогеля рекомендуется использовать распорки 12,7 мкм.

Рисунок 5:Толщина гидрогеля влияет на чистоту экстракции. (A)Используя распорки толщиной 12,7 мкм для образования гидрогеля, колонии образуются в пределах одной 10-кратной фокальной плоскости. (B)Наложение колоний можно наблюдать при 10-кратном увеличении, если используются распорки толщиной более 12,7 мкм. (C)Перекрестное загрязнение может происходить при наложении колоний во время высвобождения клеток: (i) кольцевой рисунок используется для высвобождения целевой клеточной колонии, (ii) целевая клеточная колония отделяется от гидрогеля и (iii) вторая, нижележащая колония наблюдается во время воздействия света под целевой колонией. Эта колония также удаляется, что приводит к перекрестному загрязнению. Перепечатано (адаптировано) с разрешения Fattahi et al.¹⁹ Copyright 2020 American Chemical Society. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Учитывая потенциальное повреждение бактерий ультрафиолетовым светом, влияние различных микроструктур УФ-света на жизнеспособность клеток было дополнительно изучено с использованием модели, грамположительных бактерий(B. subtilis)и модели, грамотрицательных бактерий(E. coli). Каждый из них инкапсулировался в объемные гидрогели и культивировался в микромасштабные колонии в соответствии со стандартными протоколами, проверяя их совместимость с гидрогелем. Затем целевые микроколонии эквивалентных размеров (диаметр 26 ± 1 мкм) подвергали воздействию постояннойдозы света (168 мДж/мм2), либо в виде круговых узоров, подвергающих целые микроколонии ультрафиолетовому излучению, либо перекрестных паттернов, которые разлагают только края гидрогеля, чтобы свести к минимуму воздействие света на клетки. Затем клетки были восстановлены и покрыты для количественной оценки КОЕ / мл, извлеченных из каждой колонии. Существенной разницы в уровне восстановления клеток обнаружено не было(рисунок 6А). Для дальнейшего исследования чистоты извлеченных клеток ДНК была извлечена из образцов E. coli и проанализирована с использованием спектрофотометра UV-Vis. Для обоих паттернов уровни качества ДНК находятся в диапазоне A₂₆₀/ A₂₈₀ между 1,8 и 2,0(рисунок 6B),который находится в идеальном диапазоне для геномного секвенирования^25. Это демонстрирует, что УФ-паттерны, используемые для высвобождения в описанных условиях, оказывают минимальное влияние на количество жизнеспособных клеток, извлеченных из объемных гидрогелей, или на качество геномной ДНК после экстракции.

Рисунок 6:Влияние различных моделей воздействия света на жизнеспособность клеток и качество ДНК бактерий, высвобождаемых из объемных гидрогелей. (A) Уровни восстановления клеток как для E. coli, так и для B. subtilis после экстракции с использованием перекрестных паттернов и круговых паттернов. Для этого эксперимента экстракция производилась из сферических колоний с одинаковым диаметром (26 мкм ± 1 мкм), чтобы количество высвобождаемых клеток из каждой колонии было эквивалентным. Затем извлеченные растворы покрывали для расчета КОЕ/мл, полученных из каждого образца. Статистический анализ не показал существенной разницы в КОЕ/мл, полученной из перекрестных и кольцевых паттернов как для E. coli, так и для B. subtilis (P-значение > 0,05, n= 6 для обоих штаммов). (B)Спектрофотометрическая количественная оценка качества ДНК для изолированных клеток E. coli с использованием перекрестных и круговых паттернов. Здесь статистический анализ не показал существенной разницы в качестве ДНК для используемых паттернов (P-значение > 0,05, n = 6)(C)Брайтфилдовские изображения колоний с равными диаметрами, подвергаемые перекрестным и кольцевым паттернам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Массивы Microwell обеспечивают альтернативный интерфейс скрининга «лаборатория на кристалле», который предлагает более контролируемые функции скрининга по сравнению с объемными гидрогелями. Например, массивы микролунок позволяют высеивать бактерии в дискретные участки культивирования, где можно контролировать количество клеток в инокуляте. Геометрические особенности микролунок, такие как глубина и диаметр скважины, также контролируются с помощью стандартных методов микропроизводства. Благодаря этим преимуществам микролунки были полезны для изучения роста бактерий в пространственном ограничении^26,а совсем недавно для открытия симбиотических и антагонистических взаимодействий между различными видами бактерий, когда они ограничены вместе на микроуровне^18. Клеточная добыча из скважин для геномного анализа, такого как секвенирование ампликонов 16S, имеет решающее значение для этих применений. Используя тот же гидрогельный материал, ультрафиолетовый свет может быть выставлен над скважиной, содержащей интересующие клетки, либо в виде кругов, либо кольцевыхузоров. Последний обеспечивает деградацию гидрогеля только по периметру микролунки для предотвращения прямого облучения клеток. Чтобы продемонстрировать это, клетки A. tumefaciens, экспрессирующие mCherry, были засеяны в лунки, затем гидрогель был прикреплен к массиву микролунки. Клетки культивировали, а затем облучали либо кругами, либо кольцами. Затем мембрану окрашивали флуоресцеин-5-малеимидным красителем. Двухцветные флуоресцентные изображения показали, что как мембрана, так и клетки в лунках удаляются для обеих моделей облучения^17. В отличие от объемного гидрогелевого формата, экстракция клеток здесь наблюдалась только в форме клеточных кластеров^18.

Рисунок 7:Репрезентативные изображения конфокальной микроскопии, показывающие влияние светового паттерна на изоляцию клеток от массивов микролунок. (A)Микролунки диаметром 40 мкм, содержащие бактерии (красные) после посева и культивирования. (B)Экспозиция света с использованием круговых и кольцевых узоров (синий). (C)Снижение красной флуоресценции демонстрирует, что клетки извлекаются из облученных скважин. (D)Двухцветное флуоресцентное изображение мембран и бактерий после облучения, указывающее на удаление как гидрогеля (зеленый), так и бактерий (красный) из целевых скважин. (E)Z-стек, двухцветное флуоресцентное изображение целевых скважин. Красная линия в (D) обозначает плоскость xz, изображенную в (E), а зеленая линия в (E) обозначает плоскость xy, изображенную в (D). Образцы на изображениях(C-E)промывали для удаления высвобождаемых клеток, затем фиксировали и визуализировали. Шкала шкалы = 40 мкм. Перепечатано (адаптировано) с разрешения van der Vlies et al.^17. Copyright 2019 Американское химическое общество. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Для количественной оценки жизнеспособности клеток бактерий и качества ДНК после экстракции в этом формате клетки B. subtilis и E. coli были посеяны, культивированы, а затем освобождены из массивов микролуней с использованием кольцевых и кольцевых паттернов(рисунок 8A,B). Выпущенные клетки затем покрывались агаровыми пластинами ATGN, и качество ДНК извлеченных клеток было количественно определено. Чтобы гарантировать, что во время каждой экстракции присутствовало постоянное количество клеток, микроэлементы с аналогичной интенсивностью флуоресценции (~ 6000 а.е.) и, следовательно, аналогичное количество клеток были нацелены на высвобождение. Количество жизнеспособных клеток, извлеченных с использованием кругового рисунка, существенно не отличалось от количества жизнеспособных клеток, извлеченных с использованием кольцевого паттерна для любой из бактерий(рисунок 8C). Кроме того, уровни качества ДНК существенно не отличались между кругом и кольцевыми паттернами для обеих бактерий(рисунок 8D). Следовательно, подобно результатам в объемных гидрогелях, применение ультрафиолетового света с указанной здесь интенсивностью и продолжительностью оказало незначительное влияние на жизнеспособность и качество ДНК клеток, извлеченных из массивов микролунок. Эти результаты показывают, что жизнеспособные клетки бактерий могут быть избирательно извлечены из микролунок с минимальным повреждением для последующего анализа.

Рисунок 8:Влияние различных моделей воздействия света на жизнеспособность клеток и качество ДНК бактерий, высвобождаемых из массивов микровелл. (А,Б) Как для E. coli, так и для B. subtilisдля извлечения клеток из микролунок 10 мкм использовались круговые узоры и кольцевые узоры. Окружной рисунок диаметром 10 мкм и кольцевой рисунок с внутренним диаметром 10 мкм и наружным диаметром 20 мкм использовались в этом эксперименте для экстракции клеток. Микроэлементы с одинаковыми диаметрами использовались для обеспечения того, чтобы количество высвобождаемых клеток из каждой микролунки было одинаковым. (C)Затем извлеченные растворы покрывали для расчета КОЕ/мл, полученных в результате каждой модели воздействия. Статистический анализ не показал существенной разницы в КОЕ/мл, полученной по круговой и кольцевой структуре как для E. coli, так и для B. subtilis (P-значение > 0,05, n = 6 для обоих штаммов). (D)Спектрофотометрия использовалась для измерения качества ДНК клеток E. coli и B. subtilis с использованием кольцевых и кольцевых паттернов. Здесь статистический анализ не показал каких-либо существенных различий в качестве ДНК для используемых паттернов (P-значение > 0,05, n = 6 для обоих штаммов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Проектирование и изготовление микроскважинных массивов. (A)Стандартные методы микрофабрикации применялись для изготовления микролуночных массивов на кремниевых пластинах. (B)Каждый субстрат состоял из 7 х 7 массивов скважин диаметром 10 мкм глубиной 20 мкм и шагом 30 мкм. (C) Каждый массив состоял из 225 микролунок. Эта цифра была изменена по сравнению с Barua et al.^18. Авторское право 2021 Frontiers Media. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Эта рукопись демонстрирует использование фоторазлагаемых гидрогелей для скрининга и выделения бактерий. Материал и подход обеспечивают высокую пропускную способность культивирования, контроль над питательными средами и условиями роста, а также чистую и точную экстракцию клеток простым и экономически эффективным способом. Экстракция требует только флуоресцентного микроскопа в сочетании с инструментом узорчатого освещения и может быть выполнена последовательным образом для изоляции нескольких клеточных мишеней. Каждая экстракция занимает 5-10 минут, и из одного гидрогеля удаляется до 30 целевых колоний. Ключевым преимуществом этого подхода является его адаптивность к множеству различных форматов анализа, как показано здесь с помощью просеивания как из объемных гидрогелей, так и из микролуночных массивов. Процесс разделения в обоих форматах был успешно использован для выделения бактерий, которые демонстрируют уникальное поведение роста для последующего генотипирования после культивирования и микроскопического наблюдения, что является критической способностью для соединения генотипа клеток с фенотипом. На сегодняшний день геномные характеристики бактерий, извлеченных из этих интерфейсов, включают секвенирование ампликонов 16S для идентификации многовидовых коллекций бактерий из микробиомов окружающей среды, которые генерируют эмерджентное поведение роста^18,и для секвенирования всего генома для успешной идентификации генетических мутаций, которые вызывают редкие профили роста в клетках, присутствующих в мутантных библиотеках^19.

Использование объемных гидрогелей для скрининга и изоляции клеток является наиболее простым и понятным форматом. Объемные фоторазлагаемые гидрогели образуются быстро (25 мин) после смешивания предшественников над прозрачными стеклянными крышками для инкапсуляции клеток в матрицу 3D-культуры клеток, которая визуализируется стандартным вертикальным или перевернутым флуоресцентным микроскопом. Таким образом, метод может быть трансляционным для обычных микробиологических лабораторий, которые не имеют ресурсов микропроизводства или опыта. Недостатком этого формата является то, что клетки случайным образом ориентированы по всему трехмерному гидрогелю. Поэтому клетки могут появляться вне фокальной плоскости при визуализации с более высокими целями увеличения, и извлечение может быть затруднено, если клеточные колонии ориентированы слишком близко друг к другу или если есть вертикальное наложение колоний. Осаждение тонкого гидрогеля (<13 мкм), как описано, имеет решающее значение для смягчения этого недостатка. Экспозиция в разбитых перекрестных световых паттернах(рисунок 4B)здесь предпочтительна, так как эта картина приводит к тому, что клетки, свободные от гидрогеля, имеют минимальное воздействие ультрафиолетового света и могут быть легко восстановлены путем покрытия.

В отличие от этого, формат массива микролунок обеспечивает более хорошо контролируемый интерфейс, поскольку клетки бактерий разделены на дискретные микролунки, которые служат в качестве небольших культур или ко-культур участков^17,18,26. Размеры, шаг и плотность микролунок точно изготавливаются с использованием стандартных фотолитографических методов. По сравнению с объемными гидрогелями, бактерии могут быть извлечены из микролуночных массивов с более высокой степенью специфичности и меньшей вероятностью перекрестного загрязнения, поскольку клетки присутствуют только в заранее определенных местах, а не случайным образом диспергированы по всему гидрогелю. Концентрация и соотношение клеток бактерий в посевном растворе также могут быть изменены для контроля количества и состава микролуночного инокулята посредством процесса посева, который был охарактеризован в предыдущих отчетах^26,что дает пользователю гибкость в экспериментальном проектировании экрана. Основным недостатком скрининга с форматом массива микровелл является дополнительное время и опыт, необходимые для микропроизводства. Производство микроузелей, по оценкам, стоило ~ 10 долларов США за массив, что включает в себя материальные затраты и расходы на чистые помещения. Кроме того, массивы микролунок традиционно изготавливаются из кремния, что может вызвать трудности с визуализацией, поскольку подложки непрозрачны. Кроме того, большое количество рассеяния света от поверхности кремния может ограничить визуализацию в микролунках и может уменьшить разрешение рисунка во время воздействия гидрогеля ультрафиолетовым светом от инструмента узорчатого освещения (см. Рисунок 8A,B). Аналогичные микроскважины были изготовлены на прозрачных кварцевых подложках для устранения этих типов ограничений^27; однако эта фабрикация значительно сложнее. Воздействие кольцевых узоров, которые освещают периметр скважины, здесь предпочтительно для высвобождения свободных ячеек из скважин при минимизации воздействия ультрафиолета.

Наиболее распространенной проблемой, которая возникает в любом формате, является отделение гидрогеля от нижележащего субстрата во время культивирования из-за набухания гидрогеля. Если это проблема для объемных гидрогелей, наличие, плотность и однородность тиольных групп в химическом (MTPS) крепежном слое по всей поверхности крышки основного стекла должны быть проверены с использованием соответствующего метода определения характеристик поверхности (XPS, ATR-FTIR, AFM и т. Д.). Низкая плотность поверхностных тиольных групп из-за неэффективной функционализации поверхности может привести к слабому взаимодействию между субстратом и гидрогелем. При возникновении низкого уровня поверхностной тиолации следует проверить стабильность раствора MTPS. Следует соблюдать осторожность при первоначальной очистке стеклянной горки, чтобы обеспечить чистую поверхность перед обработкой MTPS, и следует проявлять осторожность для обеспечения использования безводного толуола во время поверхностной реакции MTPS (раздел 4 Протокола). В случае микролуночных массивов поверхности не тиолированы, а гидрогели вместо этого присоединяются через частичное заполнение скважин гидрогелем, который прикрепляет гидрогель к кремниевой подложке^17. Если отделение гидрогеля является проблемой в этой системе, в массив можно вытравить больше микролунок или других микромасштабных объектов для дальнейшего закрепления гидрогеля на подложке, чтобы способствовать более сильному прикреплению.

Ограничением метода в любом формате является ограниченная стабильность гидрогелей в присутствии бактерий. Было отмечено, что некоторые бактерии, такие как A. tumefaciens,могут разлагать гидрогель в течение 5-7 дней^17,19,что ограничивает время эксперимента. В настоящее время ведутся исследования механизмов бактериальной деградации; предполагается, что эфирные группы, присутствующие в мономерах диакрилата, подвержены опосредованному бактериями гидролизу и/или ферментативной деградации, как отмечено в других системах^17. Разработка более стабильных химических веществ гидрогеля продлит время, в течение которого бактерии могут оставаться в гидрогеле, и расширит экран на микроорганизмы с более медленными темпами роста. Второе ограничение заключается в том, что в обоих форматах восстановление и экстракция клеток происходят в открытой среде, что приводит к относительно высоким объемам экстракции (30-100 мкл), которые могут быть восприимчивы к внешнему загрязнению. Таким образом, необходимо позаботиться о том, чтобы обеспечить присутствие достаточного количества клеток из колоний-мишеней при минимизации объема экстракционного раствора. Чтобы получить достаточное количество клеток для покрытия и восстановления или для экстракции материала ДНК, было замечено, что в объемных гидрогелях клетки должны культивироваться достаточно долго, чтобы достичь диаметра колонии не менее 10 мкм. Для уменьшения необходимого объема для экстракции клеток было отмечено, что использование микролитрового шприца и трубки (рисунок 2) было более эффективным, чем пипетка. Трубки позволили более точно извлекать изоляты из точки высвобождения, требуя меньшего объема раствора и снижая вероятность загрязнения.

Будущая работа предполагает понимание влияния механических свойств гидрогеля на рост клеток, так как механические особенности этих гидрогелей хорошо контролируются путем отбора соответствующих предшественников мономеров на основе ПЭГ различной молекулярной массы^28,а механические взаимодействия, вероятно, играют важную роль в поведении бактерий^29. Поскольку гидрогелевые материалы могут быть легко включены в различные системы и устройства, дальнейшее развитие также сосредоточено на интеграции этого материала в микрофлюидные системы. Это уменьшило бы экстракционный раствор до фемтолитра до пиколитров по сравнению с традиционными объемами 30-100 мкл, требуемыми в настоящее время в формате открытой коллекции. Меньшие объемы раствора значительно уменьшат потенциальное загрязнение и сдвинут подход к одноэлементной изоляции и характеристике.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Меркаптопропил)триэтоксисилан	Sigma-Aldrich	175617-25G	> 95%
Стиральный порошок Alconox		1104
Сульфат аммония	Fisher Chemical	A702-500	Сертифицированный ACS гранулированный
автоклав SK300C	Yamato Scientific	18016
Bacillus subtilis 1A1135	Bacillus Genetic Stock Center	1A1135
Brightfield вертикальный микроскоп	Olympus Corporation	BX51
Хлорид кальция, безводный	Fisher Chemical	C614-500	Для десикаторов Пеллеты, 4-20 меш
Центрифуга 5702	Eppendorf	5702
Моногидрат лимонной кислоты	Sigma-Aldrich	C1909-500G	ACS реагент, > 99,0%
D-глюкозы ( Декстроза)	VWR Amresco Life Science	0188-1KG
Dneasy Blood & Набор для салфеток	Qiagen	69504	набор для очистки ДНК
DOWSIL 184 силиконовый эластомер на основе	Dow Silicones Corporation		Температура хранения: -30-60 °°; C
DOWSIL 184 силиконовый эластомер отвердитель	Dow Silicones Corporation		Температура хранения: < 32 C
EPOCH2 микропланшетный спектрофотометр	BioTek Instruments	EPOCH2
Escherichia coli ATCC 25922	Thermo Fisher Scientific	R19020
этанол, безводный	Fisher Chemical	459844
Fisherbrand защитное стекло микроскопа	Fisher Scientific	12540A
Микроскоп премиум-класса Fisherfinest предметные стекла	Fisher Scientific	12-544-4
Раствор перекиси водорода	Sigma-Aldrich	216763-500ML	Содержит ингибитор, 30 мас.% в H2O
Incu-Shaker Mini	Benchmark	E5-0014-01
Изопропанол	Sigma-Aldrich	190764
Сульфат магния, 7-гидрат	Macron Fine Chemicals	6066-04	Avantor Performance Materials, Inc.
Метанол	Sigma-Aldrich	179337-4L	ACS реагент, > 99,8%
NanoDrop One спектрофотометр	Thermo Scientific	ND-ONEC-W
Азот, сжатый	Matheson	UN1066
Кислородный плазменный очиститель	Harrick Plasma	PDC-001-HP
Пентаэритрит тетра(меркаптоэтил) полиоксиэтилен (4 руки-PEG)	NOF America Корпорация	PTE-100SH	Sunbright-PTE-100SH
Фосфатный буферный раствор (PBS), 10X	VWR Amresco Life Science	K813-500ML	Хранение от 15 до град; С– 30 ° C
Полидиметилсилоксан (PDMS) Slygard 184	Dow Corning	4019862
Polygon400	Mightex	DSI-D-000
Предметные стекла для микроскопа премиум-класса	Fisher Scientific	12-544-4	25 x 75 x 1 мм
Бикарбонат натрия	Sigma-Aldrich	S5761-500G
Хлорид натрия	Sigma Life Science	S5886-500G	Биореагент, подходит для клеточной культуры
Гидроксид натрия	Sigma-Aldrich	S8045-500G	BioXtra, > 98%, гранулы (безводные)
Одноосновной дигидрат фосфата натрия	Sigma-Aldrich	71505-250G	BioUltra, для молекулярной биологии, > 99,0% (T)
Толщиномер из нержавеющей стали	Precision Brand Products	77739
Серная кислота	Sigma-Aldrich	320501-2,5 л
Толуол, безводный, 99,8%	Sigma-Aldrich	244511-1L	Безводный, > 99,8%
Трихлор (1H,1H,2H,2H перфтороктил) силан (TPS), 97%	Sigma-Aldrich	448931-10G
Триптический соевый бульон	Sigma-Aldrich	22092-500G	Для микробиологии
Super Nuova Цифровая мешалка с подогревом	Thermo Scientific	S131825
Ультразвуковой ультразвуковой аппарат	Fischer Scientific	FS-110H