Методическая статья

Межфазная флуоресценция in situ Гибридизация мазков костного мозга множественной миеломы

DOI:

10.3791/63083

⸱

15 апреля 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, 2Wuhan National Laboratory for Optoelectronics, Huazhong University of Science and Technology

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для улучшения успеха обнаружения интерфазной флуоресцентной гибридизации in situ на мазках костного мозга у пациентов с множественной миеломой.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обнаружение флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) является незаменимым методом стратификации генетического риска при множественной миеломе (ММ), которая является одной из наиболее распространенных гематологических злокачественных новообразований. Идентифицирующей характеристикой ММ является накопление злокачественных плазматических клеток в костном мозге. Отчеты FISH для ММ в основном сосредоточены на очищенных или идентифицированных клональных плазматических клетках, а не на всех ядерных клетках, путем сортировки с помощью магнитных шариков против CD138 или маркировки цитоплазматической иммуноглобулиновой легкой цепью κ или λ. Межфазные ядра костного мозга обычно получают из свежих клеток костного мозга. Однако удовлетворительное обогащение образцов плазматических клеток требует большого количества свежего гепарина, антикоагулянтированного костного мозга, которое не может быть получено в случае затрудненного извлечения костного мозга или сухого крана костного мозга. Здесь мы устанавливаем новый метод для улучшения успеха обнаружения FISH на окрашенных или неокрашенных мазках костного мозга. Мазки костного мозга получить легче, чем антикоагулянтные образцы костного мозга.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Множественная миелома (ММ) является злокачественным заболеванием плазматических клеток (ПК) с сильной биологической гетерогенностью и большими индивидуальными различиями в клинической эффективности, с периодами выживания от месяцев до десятилетий. Цитогенетические характеристики являются важными прогностическими показателями ММ. Система стратификации риска и индивидуализированные методы лечения, основанные на генетических характеристиках, стали темами, представляющими большой интерес в клинических исследованиях MM1. Аберрации ПК, протестированных в флуоресцентной панели гибридизации in situ (FISH) костного мозга (BM), включают del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), усиление/усиление 1q21 (CKS1B) и удаление 1p (CDKN2C).

Стандартная метафазная цитогенетика должна быть включена в первоначальную оценку пациентов с ММ. Хотя обычное G-полосное кариотипирование предлагает преимущество анализа всей хромосомы, низкий выход этого метода приводит ко многим ложноотрицательным результатам2. Традиционно ПК рассматривались как в значительной степени неспособные к расщеплению, потому что они являются конечными продуктами дифференцировки В-лимфоцитов. Это затрудняет получение разделенных изображений. Улучшенный цитогенетический анализ при ММ с долгосрочными культурами (6 дней) и стимуляция культур цитокинами могут быть перспективным методом выявления цитогенетических аномалий у вновь диагностированных пациентов с ММ3. Однако даже когда время культивирования было продлено до 6 дней, цитогенетические аномалии были точно зарегистрированы у 30%-50% пациентов с ММ4. Кроме того, ММ характеризуется сложными цитогенетическими аберрациями, которые отражают его прогностическую гетерогенность. Однако разрешение традиционной технологии полосирования хромосом низкое, что может легко привести к пропущенному обнаружению хромосомных аномалий в ММ.

Интерфазная FISH, предпочтительно после CD138-положительной магнитной шариковой сортировки ПК или маркировки цитоплазматического иммуноглобулина с легкой цепью κ/λ, незаменима при анализе MM5,6. CD138-положительный выбранный образец настоятельно рекомендуется для оптимизированного выхода опухолевых клеток. Однако для точного количественного определения цитогенетических аберраций требуется не менее 4 мл антикоагулянтного БМ для сортировки ПК. Кроме того, комбинации иммуномагнитной сортировки ШАРИКОВ CD138 с FISH или цитоплазматического иммуноглобулина с легкой цепью κ/λ с тестированием FISH (cIg-FISH) увеличивают многочисленные экспериментальные затраты и отнимают много времени.

Обычно соотношение ПК сначала оценивают по морфологическому исследованию окрашенных мазков БМ или участков биопсии БМ7,8. Образцы БМ самого высокого качества (образцы аспирата первого костного мозга) используются для морфологического тестирования, тогда как образцы, отправленные для FISH или другого обнаружения, часто являются вторичными образцами аспирата с высоким соотношением разбавления периферической кровью.

Еще в 1990-х годах многочисленные исследования показали, что мазки БМ могут быть непосредственно использованы для интерстициальных исследований FISH, что оказалось надежным и воспроизводимым методом9. Элегантное исследование, основанное на морфологии клеток и цитохимии эстеразы в сочетании с FISH периферической крови и мазками БМ, подтвердило его большое клиническое значение для выяснения хромосомных аномалий у пациентов с гранулоцитарным и лимфоцитарным лейкозом10.

Здесь мы предлагаем новый метод для улучшения успеха межфазного обнаружения FISH у пациентов с ММ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данное исследование было проведено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации и одобрено Комитетом по этике больницы Чжуннань Уханьского университета (No 2019065). Образцы были собраны у пациента ММ в отделении гематологии больницы Чжуннань Уханьского университета (Китай).

1. Подготовка мазков БМ

  1. Поместите первые 0,2 мл раствора BM на чистую одноразовую стеклянную горку.
  2. Распределите мазки БМ до равномерной толщины острыми хвостами, быстро удалив БМ. Затем высушите естественным путем.
  3. Покрыть пленки BM 1 мл раствора Райта-Гимса в течение примерно 10 с при комнатной температуре.
  4. Добавьте 1 мл фосфатного буфера на слайды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь о том, чтобы раствор красителя не высох или не стекал с горок.
  5. Аккуратно перемешайте раствор красителя и выдерживайте его в течение 15 минут при комнатной температуре.
  6. Промойте горки чистой водой и высушите их на воздухе при комнатной температуре.
  7. Используйте прямую световую микроскопию для обнаружения злокачественных ПК. Пк должны быть хорошо рассредоточены.

2. Рыбная предварительная обработка мазков БМ

  1. Накройте гибридизированную область фиксирующим раствором на 10 мин, чтобы обесцвечивать и фиксировать ПК.
    1. Для приготовления свежего фиксирующего раствора смешайте метанол с ледниковой уксусной кислотой в объемном соотношении 3:1.
  2. Промойте горку деионизированной водой (dH2O) и высушите ее на воздухе при комнатной температуре.
  3. Разогрейте банку, содержащую 2x буфера SSC, до 56 °C на водяной бане. Перед использованием разбавьте буфер до 20x SSC.
    1. Чтобы приготовить 20x SSC, тщательно смешайте 176 г хлорида натрия и 88 г цитрата натрия с 800 мл dH2O. Измерьте рН и отрегулируйте рН 5,3 ± 0,2. Затем добавьте dH2O, чтобы довести конечный объем до 1 л.
  4. Вымойте приготовленный мазок BM в предварительно нагретом 2x SSC буфере в течение 10 мин, после чего окуните его в деионизированную воду комнатной температуры.
  5. Обезвоживать мазок в градиенте этанола (70%, 85% и 100% этанол, каждый в течение 1 мин). Высушите мазок на воздухе в течение 10 мин.

3. БМ мазок FISH и промывка

ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги были выполнены в темной комнате, чтобы предотвратить закалку флуоресценции.

  1. Добавьте пробную смесь TP53/центромера хромосомы 17 (CEP17) в область гибридизации и накройте ее покровным листом. Осторожно надавите тонкоконечным пинцетом, чтобы удалить пузырьки воздуха снизу.
  2. Запечатайте все стороны крышки резиновым цементом, чтобы обеспечить хорошую герметичность.
  3. После затвердевания резинового цемента поместите затвор на автоматическую машину FISH. Выполняют денатурацию при 78 °C в течение 5 мин с последующей гибридизацией при 37 °C в течение ночи.
  4. Поднимите слайд с машины FISH. Используйте тонкоконечный пинцет, чтобы аккуратно удалить резиновый цемент.
  5. Погрузите слайд в 2x SSC при комнатной температуре примерно на 1 или 2 минуты, чтобы смыть крышку.
  6. Промывайте горку в 68 °C предварительно нагретом 0,4x SSC/0,3% NP-40 буфере на водяной бане в течение 2 мин.
    1. Приготовьте 0,4x SSC/0,3% раствор NP-40, тщательно перемешав 20 мл 20x SSC (pH 5,3) с 950 мл dH2O. Затем добавить 3 мл NP-40 и тщательно перемешать до полного растворения. Измерьте pH и отрегулируйте до 7,0-7,5 с NaOH. Затем добавляют dH2O, чтобы довести конечный объем общего раствора до 1 л.
  7. Мойте горки с 2x SSC на водяной бане 37 °C в течение 1 мин. Установите вертикально в темноте, чтобы тщательно высохнуть в течение 10 минут.
  8. Добавьте 10 мкл DAPI в гибридизированную область и накройте крышкой.

4. Анализ и визуализация FISH

  1. Просмотрите гибридный слайд с помощью подходящего фильтра, установленного на флуоресцентном микроскопе.
  2. Используйте монохроматический синий флуорофорный оптический фильтр для наблюдения за интенсивностью флуоресценции ядра клетки. Делайте снимки клеточного ядра под набором фильтров DAPI.
  3. Используйте зонд хромосомной центромеры, чтобы показать, сколько хромосом содержит клетка. Этикетка CEP17 с зеленой флуоресценцией. Используйте спектральный зеленый флуорофорный оптический фильтр для наблюдения за местоположением CEP17. Возьмите изображение сигналов CEP17 под зеленым фильтром.
  4. Пометьте ген TP53 оранжевой флуоресценцией. Используйте спектр оранжевого флуорофорного оптического фильтра для наблюдения за TP53. Возьмите изображение сигналов TP53 под этим набором.
  5. Объедините эти три изображения и изучите их на наличие числовых аномалий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В нормальной межфазной клетке внутри ядра наблюдаются два оранжевых и два зеленых сигнала с синей флуоресценцией, что указывает на одну пару нормальной хромосомы 17 (рисунок 1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В первоначальной морфологической оценке недавно диагностированного пациента с ММ было обнаружено, что 15% ПК в мазке BM имеют более крупные и темные ядра наряду с большим количеством цитоплазмы, чем нормальные ПК (рисунок 2A). Первая трубка гепарина антикоагулянтированного БМ, обнаруженная методом иммунофенотипа, выявила только 2,3% моноклональных аберрантных ПК. Иммуномагнитная сортировка ШАРИКОВ CD138 в сочетании с FISH или методом cIg-FISH необходима для получения точного результата FISH....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Применение FISH к стратификации генетического риска в ММ имеет важное значение. Критической частью отчетов FISH являются не все ядерные клетки, а клональные ПК, специально очищенные или идентифицированные путем сортировки магнитных шариков против CD138 или маркировки цитоплазматической иммуноглобулиновой легкой цепью κ или λ. Было обнаружено, что межфазная FISH после сортировки ПК или cIg-FISH имеет важное значение в диагностике ММ из-за относительно более низкой доли ПК в БМ. Однако эти методы имеют некоторые недостатки...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данный проект был поддержан Инновационным фондом WNLO 2018WNLOKF023.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
автоматическая машина FISHLeica  КорпорацияS500-24FINAL Assy Thermobrite 240V
DAPIAbbott Molecular Inc.06J49-001DAPI Программное
обеспечение для анализа Counterstain FISHIMSTAR  КорпорацияIMSTARFISH Analysis Software
FISH ProbeAbbott Molecular Inc.05N56-020Ysis Locus Specifc Идентифер TP53 / CEP 17 FISH
Набор дозаторов фиксированного объемаEppendorf China Ltd.M33768H10  микролитровый
флуоресцентный микроскопOlympus CorporationBX53Прямой флуоресцентный микроскоп
Программное обеспечение для анализа кариотиповIMSTAR  КорпорацияIMSTARПрограммное обеспечение для анализа кариотипов
Световой микроскопOlympus  КорпорацияBX41Форвардный световой микроскоп
NP-40Abbott Molecular Inc.07J05-001NP-40
Штатив для окрашивания пластикаGuangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.RSJ-501  24 слайда
Бак для окрашивания пластикаGuangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.RSJ-516  24 горки
Резина ЦементМарабу  GmbH & Компания KGFixoGum Резиновый цемент
SSCAbbott Molecular Inc.02J10-03220&раз; SSC
Водяная баняShanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd.DK-8DМноготемпературная водяная баня

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sonneveld, P., et al. Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group. Blood. 127, 2955-2962 (2016).
  2. Radbruch, A., et al. Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell. Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).
  3. Lai, J. L., et al. Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis. Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).
  4. Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process. Blood. 91, 3-21 (1998).
  5. Munsh, N. C., et al. Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2. Blood. 117, 4696-4700 (2011).
  6. Gole, L., et al. cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma - A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service. Blood. 120, 4792-4792 (2012).
  7. Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).
  8. Štifter, S., et al. Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma. Diagnostic Pathology. 5, 30(2010).
  9. Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears. Pathology. 27, 86-90 (1995).
  10. Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).
  11. Dunning, K., Safo, A. The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making. Biotechnic & Histochemistry. 86, 69-75 (2011).
  12. Woronzoff-Dashkoff, K. K. The wright-giemsa stain. Secrets revealed. Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).
  13. McPherson, R. A., Pincus, M. R. Henry's Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book. Elsevier Health Sciences. , (2017).
  14. Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

FISHTP5317CD138

Похожие статьи