Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Анализ урацил-ДНК-гликозилазы с помощью матрицы лазерной десорбции/ионизации Масс-спектрометрии времени пролета

3.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63089

⸱

22 апреля 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology, College of Medicine, National Taiwan University, 2Department of Laboratory Medicine, National Taiwan University Hospital, 3Center for Microbial Pathogenesis, Nationwide Children’s Hospital and the Department of Pediatrics, The Ohio State University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Немаркированный, нерадиоизотопный метод анализа активности урацил-ДНК-гликозилазы был разработан с использованием масс-спектрометрии MALDI-TOF для прямого анализа апуринового/апиримидинического сайта,содержащего продукт. Анализ оказался довольно простым, специфическим, быстрым и удобным в использовании для измерения ДНК-гликозилазы.

Аннотация

Урацил-ДНК-гликозилаза (UDG) является ключевым компонентом в базовом пути иссечения для коррекции урацила, образующегося в результате гидролитического дезаминирования цитозина. Таким образом, это имеет решающее значение для поддержания целостности генома. Для измерения активности UDG был разработан высокоспецифичный, немаркированный, нерадиоизотопный метод. Синтетический дуплекс ДНК, содержащий сайт-специфический урацил, был расщеплен UDG, а затем подвергнут анализу лазерной десорбции / ионизации во время полета (MALDI-TOF MS). Был установлен протокол для сохранения продукта апуринового/апиримидинового сайта (AP) в ДНК без разрыва цепи. Изменение значения m/z от субстрата к продукту использовалось для оценки гидролиза урацила UDG. Субстрат G:U использовался для кинетического анализа UDG, в результате которого Km = 50 нМ, Vmax = 0,98 нМ/с и Kcat = 9,31 с-1. Применение этого метода к анализу ингибитора урацилгликозилазы (UGI) дало значение IC50 7,6 пМ. Специфичность UDG с использованием урацила в различных положениях в одноцепочечных и двухцепочечных субстратах ДНК продемонстрировала различную эффективность расщепления. Таким образом, этот простой, быстрый и универсальный метод MALDI-TOF MS может стать отличным эталонным методом для различных монофункциональных гликозилаз ДНК. Он также имеет потенциал в качестве инструмента для скрининга ингибиторов ДНК-гликозилазы.

Введение

Хотя урацил является нормальным основанием в РНК, он является распространенным и высокомутагенным поражением в геномной ДНК. Урацил может возникать в результате спонтанного/ферментативного гидролитического дезаминирования дезоксицитидина. В каждой живой клетке это дезаминирование происходит 100-500 раз в сутки при физиологических условиях1,2. Если эти изменения не восстанавливаются, может произойти изменение в составе последовательности ДНК, вызывающее мутацию. Поскольку урацил в ДНК предпочитает спариваться с dATP во время репликации, если цитозин деаминтируется в урацил, в двух событиях репликации в половине ДНК потомства будет новая мутация перехода G:C в A:T.

Среди клеточных стратегий для поддержания генетической стабильности восстановление иссечения оснований (BER) является важным механизмом, который восстанавливает поврежденные основания, такие как урацил, в ДНК4. BER является высоко эволюционно сохраненным процессом. Существует два общих пути BER: короткий путь, ведущий к репарации одного нуклеотида, и путь длинного пятна, который производит репарационный тракт по крайней мере из двух нуклеотидов5. BER является скоординированным механизмом, который происходит в несколько этапов. Первым шагом в BER является ферментативный гидролиз поврежденного нуклеотидного основания повреждающей ДНК-гликозилазой для генерации промежуточного сайта апуринина/апиримидинового (AP)6. За этим следует расщепление сахарно-фосфатной основы в месте AP эндонуклеазой, очистка концов ДНК лиазой, заполнение промежутков ДНК-полимеразой и герметизация конечного ника лигазой5.

Урацил-ДНК-гликозилаза (UDG) гидролизует урацил из урацилсодержащей ДНК для BER в Escherichia coli. Обычные анализы UDG с использованием радиомаркированной ДНК с использованием различных методов разделения6,7,8,9,10,11,12,13 обычно являются трудоемкими, трудоемкими, с дорогостоящими реагентами маркировки, сложными процедурами и требуют интенсивной подготовки и практики для снижения рисков воздействия радиоактивных материалов. Фторометрические олигонуклеотидные анализы были разработаны в качестве замены для радиоизотопной маркировки14, в дополнение к молекулярным маякам и технологии резонансного переноса энергии Фёрстера15,16,17,18,19,20. Тем не менее, для всех вышеупомянутых методов требуется специальная маркировка. В последнее время были разработаны безметочные биосенсорные анализы21,22,23 и колориметрические методы, основанные на формировании G-квадруплекса24,25,26. Однако несколько пар A:U или специально разработанные последовательности в зондах усложняют определение ферментной единицы.

MALDI-TOF MS - это технология, которая может быть очень полезна в анализе ДНК. Разработанные приложения включают генотипирование однонуклеотидного полиморфизма27,28, модифицированный нуклеотидный анализ29 и промежуточную идентификацию репарации ДНК30,31,32,33,34. MALDI-TOF MS должен быть легко принят для анализа ДНК-гликозилазы для обнаружения ПРОДУКТОВ ДНК, содержащих AP-сайт. Однако AP-сайты в ДНК склонны к разрыву нити при многих экспериментальных условиях33. Анализ UDG представлен здесь с использованием MALDI-TOF MS для непосредственного измерения производства на площадке AP без значительного шума разрыва пряди. Этот метод без меток прост в работе и имеет высокий потенциал для фармацевтического применения скрининга ингибиторов ДНК-гликозилазы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка подложки/шаблона

  1. Конструкция урациловой подложки/шаблона дуплексная с сбалансированным содержанием G+C ~50 ± 10% и минимальной температурой плавления 50 °C для дуплексной области.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Одна нуклеотидная разница между 18 нт субстратами и 19 нт шаблонами (таблица 1 и рисунок 1) помогает улучшить интерпретацию сигнала MS и соответствующий отжиг. Шаблонная нить служит комплементарной ДНК для генерации несоответствий A-U или G-U (таблица 1), но также может использоваться в качестве эталонного сигнала в измерениях MS. Использование очищенных ВЭЖХ синтетических олигонуклеотидов является удовлетворительным для этого исследования.
  2. Растворить ДНК в 1 мМ ЭДТА и 10 мМ Tris-HCl(рН 8,0 при 25 °C) (TE) в концентрации 100 мкмоль/л в качестве запаса и хранить при -20 °C. Разбавьте этот запас 20 мкл с TE до конечного объема 800 мкл (25-кратное разбавление до 4 мкмоль/л). Измерьте поглощение раствора ДНК в УФ-видимом спектрофотометре при λ = 260 нм для обеспечения назначенной производителем концентрации. Например: A260 = 0,204 для 4 мкмоль/л U+9 и A260 = 0,192 для 4 мкмоль/л T1 (таблица 1).
  3. Выполните анализ MALDI-TOF MS (разделы 4-6) для контроля качества олигонуклеотидов путем проверки уникальных пиковых сигналов при заданных значениях m/z, а также путем проверки того, что отношение сигнал/шум составляет >100 (рисунок 1B и рисунок 1D).

2. Анализ ДНК-гликозилазы

  1. Используя субстрат G:U дуплекса T1/U+9 (таблица 1 и рисунок 1A) для гликозилазной реакции, например, в стерильной микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл, добавляют 70 мкл H2O, 10 мкл реакционного буфера 10x UDG, 5 мкл запаса T1 и 5 мкл запаса U+9 (стадия 1.2.).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите правильный тип микропипетки и следуйте инструкциям производителя для обработки требуемого объема. Например, используйте пипетку 2 мкл для дозирования 0,1-2 мкл жидкости, используйте пипетку 10 мкл для дозирования 2-10 мкл жидкости и используйте пипетку 100 мкл для дозирования 20-100 мкл жидкости для обеспечения точности и точности результатов. Описанный объем смеси реагентов рассчитан на 10 анализов; отрегулируйте громкость для нужного количества реакций. Реакционный буфер 1x UDG содержит 1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотрейтола и 20 мМ Tris-HCl (рН 8,0 при 25 °C). В таблице материалов приведен источник 10-кратного реакционного буфера UDG.
  2. Надежно закройте трубку; инкубировать на водяной бане в течение 30 мин при 65 °C, затем в течение 30 мин при 37 °C и, наконец, на льду в течение 3 мин, чтобы обеспечить надлежащий отжиг субстрата/шаблона дуплекса.
  3. В стерильную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл добавьте 49 мкл ледяного реакционного буфера 1x UDG и 1 мкл UDG (5000 ед/мл; см. Таблицу материалов), разбавляя до 0,1 единицы/мкл. Делайте последовательные разведения с буфером 1x UDG до желаемых концентраций ферментов 0,05, 0,02 или 0,01 мкл. Всегда держите разбавленный UDG на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В реакции 10 мкл 0,1 единицы UDG могут расщеплять более 30 пмоль урацила из дуплекса T1/U+9 за 3 мин.
  4. В стерильную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл добавляют 9,0 мкл субстратной смеси со стадии 2,2 и предварительно прогрейте трубку до 37 °C. Добавьте 1,0 мкл разбавленного UDG со стадии 2.3. Используйте таймер, чтобы рассчитать время реакции, и проведите трубкой, чтобы перемешать содержимое.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа определения единицы измерения время инкубации составляет 30 минут. Для кинетического анализа используют анализ времени курса 0,5, 1, 2, 3, 5 мин для получения начальной нормы. Для анализа ингибирования UGI время реакции в течение 15 мин.
  5. Центрифугирование трубок реакционной смесью в течение 3-5 с при температуре окружающей среды составляет 3 200 × г . Затем немедленно переведите реакцию на 37 °C.
  6. Прекращение реакции
    1. Готовят растворы 0,25 М HCl и 0,23 М Трис основания. В пробирке объемом 15 мл добавляют 10 мл раствора 1 мМ ЭДТА и 20 мМ Tris-HCl (рН 8,0 при 25 °C), чтобы имитировать 1x UDG реакционный буфер. Подкисляют 1 мл 0,25 М HCl и проверяют с помощью рН-метра, чтобы убедиться, что рН составляет ~ 2 ± 0,5. Нейтрализуют 1 мл основания 0,23 М Tris и проверяют рН-метром конечный рН 6,5 ± 0,5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование тест-полосок pH является быстрым и простым способом подтверждения уровней pH смеси реагентов.
    2. Добавьте 1 мкл 0,25 M HCl для подкисления реакционной смеси 10 мкл для инактивации фермента и поместите его на лед на 6 мин. Добавьте 1 мкл основания 0,23 M Tris для нейтрализации продуктов ДНК, чтобы избежать разрушения сайта AP путем длительного воздействия кислоты. Добавьте 13 мкл TE, чтобы увеличить объем смеси продукта для переноса матричного чипа , а затем поместите его на лед.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продукт AP химически нестабилен и должен быть проанализирован MALDI-TOF MS в течение 2 дней. После длительного хранения более недели накопление значительной части разрывов нитей происходит вследствие реакций β/δ элиминации продуктов АП (рис. 1D-G).
  7. Перенесите все 25 мкл реакционных продуктов UDG из микроцентрифужных трубок на 384-луночную микротитровую пластину.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Высокие концентрации катионов, таких как натрий или калий в буферах, создают помехи в анализе MALDI-TOF MS и, таким образом, требуют обессоливания. Поскольку реакционный буфер UDG E. coli содержит очень низкие концентрации катионов, обессоливание не требуется. Однако модифицируйте этот протокол для измерения других реакций ДНК-гликозилазы, содержащих катионы металлов, которые требуют обессоливания, как описано ранее35.

3. Перенос продуктов реакции UDG на матричную микросхему

  1. Откройте дверцу нанолитрового дозатора (см. Таблицу материалов) и загрузите 384-луночную микротитровую пластину со шага 2.7 на держатель пластины палубы.
  2. Вставьте матрицу чипа в соответствующее положение разведчика. Поместите загруженную скаутскую пластину на обрабатывающую палубу нанолитрового дозатора и закройте дверцу.
  3. Нажмите кнопку запуска на экране передачи и подождите, пока прибор начнет дозировать образцы с 384-луночной микротитровой пластины на матричную микросхему.
  4. Используйте опцию вкладки Vision , чтобы показать изображение чипа и объемы дозирования для каждого пятна во время дозирования. Убедитесь, что пятнистый объем на чипе находится в пределах 5-10 нл.

4. Настройка параметров анализа на масс-спектрометре

  1. С помощью прикладной программы (см. Таблицу материалов) для подготовки .xlsx файла, содержащего прогнозируемое значение сигнала m/z для импорта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки в ФАЙЛЕ I.xlsx (таблица 2) являются примерами настроек для анализа UDG субстрата G:U в разделе 2.
  2. Используйте прикладную программу для создания и определения нового анализа UDG, щелкнув правой кнопкой мыши опцию «Импортировать группу анализа в формате конструктора» и выбрав .xlsx файл из выпадающего списка (например, FILE I.xlsx из шага 4.1).
  3. Щелкните правой кнопкой мыши кнопку Customer:Project:Plate и щелкните верхнюю часть раскрывающегося списка , чтобы установить новую пробирную пластину. В диалоговом окне введите имя файла (например, CTT20210620 для кода лаборатории и даты анализа), а затем в раскрывающемся списке тип пластины выберите тип пластины на 384 скважины и нажмите OK. Найдите пустую пластину, которая появится в правой части экрана.
  4. Выберите опцию Анализ ; выберите анализ (например, ФАЙЛ I.xlsx) из выпадающего списка.
  5. Чтобы назначить выбранный анализ (например, FILE I.xlsx) каждой позиции пятна образца на пластине, переместите курсор в каждое положение пустой пластины, щелкните, чтобы выделить колодец, и щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать Добавить Plex.
  6. Используйте настольный или портативный компьютер для подготовки рабочего списка в формате .xlsx без заголовка (например, 0620.xlsx таблицы 3) для всех образцов на чипе из шага 2.7. Нажмите кнопку Добавить новый образец проекта ; выберите файл (например, 0620.xlsx) из выпадающего списка, чтобы импортировать рабочий список.
  7. Найдите все тестовые образцы кодов в рабочем списке (например, от 0620.xlsx) в левой части экрана. Щелкните пример кода в рабочем списке и щелкните правой кнопкой мыши соответствующую позицию пластины, чтобы связать тесты с каждой позицией.

5. Работа масс-спектрометра

  1. Используйте прикладную программу для связывания масс-спектрометра (см. Таблицу материалов) с образцом чипа (из раздела 3) для анализа.
  2. Нажмите на настройку по умолчанию. В диалоговом окне введите имя файла из шага 4.3 (например, CTT20210620); в поле Имя эксперимента введите идентификатор микросхемы в штрих-коде чипа и сохраните настройки.
  3. Запустите программу управления масс-спектрометром (см. Таблицу материалов).
  4. Нажмите кнопку In/Out масс-спектрометра и дайте палубе расшириться. Выньте держатель чипа и вставьте образец чипа из шага 3.4 в держатель чипа. Поместите загруженный держатель чипа на расширенную палубу и нажмите кнопку «Вход/выход», чтобы чип образца вошел в инструмент.
  5. Дважды щелкните значок Получить прикладную программу. В окне Получение щелкните вкладку автозапуск , чтобы запустить прибор и получить масс-спектры из образцов на чипе.

6. Просмотр масс-спектров и анализ данных

  1. Запустите программу анализа данных (см. Таблицу материалов).
  2. Просмотрите дерево базы данных и выберите идентификатор чипа из шага 5.2. Щелкните, чтобы выделить целевой колодец на чипе, и щелкните значок спектра , чтобы отобразить массовый спектр.
  3. Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать Диалоговое окно настройки , чтобы обрезать определенный диапазон спектра в новом окне. Нажмите на ось X , чтобы ввести верхнюю и нижнюю границы m/z, и нажмите OK , чтобы показать указанный спектр диапазона, включая интересующие сигналы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ДНК пропорционально пиковой интенсивности на каждой единице значения m/z.
  4. Измерьте пиковую высоту значений m/z сигналов, соответствующих U-подложке, AP-продукту и шаблону. Нажмите на пик и просмотрите высоту пика в левом верхнем углу экрана.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Спектр шириной 1 600 на 1 200 единиц является разумным размером для проверки на экране компьютера, а также для ведения учета.
  5. Чтобы сохранить спектр для ведения записей, щелкните правой кнопкой мыши Экспорт и выберите тип файла JPEG в раскрывающемся списке. Нажмите Пункт назначения и Обзор диска , чтобы выбрать запоминающее устройство в раскрывающемся списке (например, флэш-диск E:). Введите имя файла (например, 0620_1-2.jpg) и нажмите кнопку Экспорт.
  6. При необходимости распечатайте экспортированный файл JPEG и измерьте пиковую высоту вручную с помощью линейки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Шаблоны и подложки
Взяв в качестве примера синтетические олигонуклеотиды с U в центре (U+9) в паре с шаблоном G (рис. 1А), для контроля качества чистоты синтетических олигонуклеотидов может быть использован пустой контроль эквимолярных количеств шаблона и урацилсодержащей подложки (рис. 1В; сигналы соответствуют обозначенному m/z и низкому фоновому шуму). Для анализа данных MS были измерены пиковые высоты (рисунок 2

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этой статье представлена подробная процедура использования метода анализа UDG MALDI-TOF MS для непосредственного обнаружения ПРОДУКТОВ ДНК, содержащих AP. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что субстраты, содержащие урацил, не содержат этикеток, масштабируемы, просты в работе и обеспечивают большую гибкость в конструкции подложки.

Рекомендованная поставщиком UDG экстракция фенола/хлороформа позволяет инактивировать фермент для предотвращения деградации ДНК продукта. Однако...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Мы благодарим NCFPB Integrated Core Facility for Functional Genomics (Тайбэй, Тайвань) и NRPB Pharmacogenomics Lab (Тайбэй, Тайвань) за техническую поддержку. Эта работа была поддержана Министерством науки и технологий Тайваня, R.O.C. [номер гранта MOST109-2314-B-002 -186 для K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 для S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 для W.-h.F.]. H.-L.C. является получателем докторской стипендии от Национального университета Тайваня. Финансирование сбора за открытый доступ: Министерство науки и технологий, R.O.C.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-Амино-2-гидроксиметилпропан-1,3-диол (трис-основание)J.T BakerProtocol 1,2
Автоклавированная деионизированная водаMILLIPOREProtocol 1,2
EDTAJ.T BakerProtocol 1,2
ПерчаткиAQUAGLOVEProtocol 1,2,3
Соляная кислота (HCl)SIGMAProtocol 1,2
Ведро для льдаTaiwan.IncProtocol 2
Наконечники для пипеток с низким удержанием (0,5-10 &; L)экстра генПротокол 1,2
Наконечники для пипеток с низким удержанием (1,250 &; L)national scientific supply co, Inc.Протокол 1,2
Наконечники для пипеток с низким удержанием (200 и микро; L)national scientific supply co, Inc.Протокол 1,2
MassARRAY  Agena Bioscience, CAProtocol 4, 5
Программы управления масс-спектрометрией включают Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE и Start RT Process.
Нанодиспенсер MassARRAYAAT Bioquest, Inc.RS1000Protocol 3
МикроцентрифугаKubotaProtocol 2
МикроцентрифугаClubioProtocol 2
Микроцентрифужная пробирка (1,5 мл)National Scientific supply co, Inc.Протокол 2
Штатив для микроцентрифужных пробирокTaiwan.IncПротокол 1,2
Микропипетки  (Р1000)Микропипетка GilsonProtocol 1,2
  (П2)Микропипетка GilsonProtocol 1,2
(P10)Микропипетка GilsonProtocol 1,2
(P100)Микропипетка GilsonProtocol 1,2
(P200)Микропипетка GilsonProtocol 1,2
(SL2)RaininProtocol 1,2
OligonucleotidesIntegrated DNA Technologies (Сингапур)Протокол 1,2
Калькулятор Quest Graph IC50 (v.1)AAT Bioquest, Inc.Рис. 4
https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1
Массив гидроксида натрия (NaOH)WAKOProtocol 2
SpectroCHIP  Agena Bioscience, CA#01509Протокол 3, 5
ТаймерTaiwan.IncПротокол 2
Программное обеспечение Typer 4.0  Agena Bioscience, CA#10145Protocol 6
Typer 4.0 состоит из четырех программ, включая Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor и Typer Analyzer.
Реакционный буфер UDG (10x)New England Biolabs, MAB0280SProtocol 2
Ингибитор урацилгликозилазыEngland Biolabs, MAM0281SProtocol 2
Uracil-DNA Glycosylase NewEngland Biolabs, MAM0280LProtocol 2
UV-VISBLE спектрофотометр UV-1601SHIMADZUProtocol 1
Водяная баняZETA ZC-4000 ( Taiwan.Inc)Протокол 2
New

Ссылки

  1. Frederico, L. A., Kunkel, T. A., Shaw, B. R. A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy. Biochemistry. 29 (10), 2532-2537 (1990).
  2. Kavli, B., Otterlei, M., Slupphaug, G., Krokan, H. E. Uracil in DNA-General mutagen, but normal intermediate in acquired immunity. DNA Repair. 6 (4), 505-516 (2007).
  3. Duncan, B. K., Miller, J. H. Mutagenic deamination of cytosine residues in DNA. Nature. 287 (5782), 560-561 (1980).
  4. Gros, L., Saparbaev, M. K., Laval, J. Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage. Oncogene. 21 (58), 8905-8925 (2002).
  5. Robertson, A. B., Klungland, A., Rognes, T., Leiros, I. Base excision repair: The long and short of it. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (6), 981-993 (2009).
  6. Lindahl, T. An N-glycosidase from Escherichia coli that releases free uracil from DNA containing deaminated cytosine residues. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3649-3653 (1974).
  7. Caradonna, S. J., Cheng, Y. C. Uracil DNA-glycosylase. Purification and properties of this enzyme isolated from blast cells of acute myelocytic leukemia patients. Journal of Biological Chemistry. 255 (6), 2293-2300 (1980).
  8. Krokan, H., Urs Wittwer, C. Uracil DNA-glycosylase from HeLa cells: general properties, substrate specificity and effect of uracil analogs. Nucleic Acids Research. 9 (11), 2599-2614 (1981).
  9. Tchou, J., et al. 8-oxoguanine (8-hydroxyguanine) DNA glycosylase and its substrate specificity. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (11), 4690-4694 (1991).
  10. Knævelsrud, I., et al. Excision of uracil from DNA by the hyperthermophilic Afung protein is dependent on the opposite base and stimulated by heat-induced transition to a more open structure. Mutation Research-DNA Repair. 487 (3-4), 173-190 (2001).
  11. Minko, I. G., et al. Recognition of DNA adducts by edited and unedited forms of DNA glycosylase NEIL1. DNA Repair. 85, 102741(2020).
  12. Bennett, S. E., Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Processivity of Escherichia coli and rat liver mitochondrial uracil-DNA glycosylase is affected by NaCl concentration. Biochemistry. 34 (18), 6109-6119 (1995).
  13. Xia, L., O'Connor, T. R. DNA glycosylase activity assay based on streptavidin paramagnetic bead substrate capture. Analytical Biochemistry. 298 (2), 322-326 (2001).
  14. Kreklau, E. L., et al. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O(6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Research. 29 (12), 2558-2566 (2001).
  15. Liu, B., et al. Real-time monitoring of uracil removal by uracil-DNA glycosylase using fluorescent resonance energy transfer probes. Analytical Biochemistry. 366 (2), 237-243 (2007).
  16. Zhang, L., Zhao, J., Jiang, J., Yu, R. A target-activated autocatalytic DNAzyme amplification strategy for the assay of base excision repair enzyme activity. Chemical Communications. 48 (70), 8820-8822 (2012).
  17. Zhou, D. M., et al. Graphene oxide-hairpin probe nanocomposite as a homogeneous assay platform for DNA base excision repair screening. Biosensors and Bioelectronics. 41, 359-365 (2013).
  18. Wang, X., Hou, T., Lu, T., Li, F. Autonomous exonuclease iii-assisted isothermal cycling signal amplification: A facile and highly sensitive fluorescence DNA glycosylase activity assay. Analytical Chemistry. 86 (19), 9626-9631 (2014).
  19. Wu, Y., Wang, L., Zhu, J., Jiang, W. A DNA machine-based fluorescence amplification strategy for sensitive detection of uracil-DNA glycosylase activity. Biosensors and Bioelectronics. 68, 654-659 (2015).
  20. Xi, Q., Li, J. J., Du, W. F., Yu, R. Q., Jiang, J. H. A highly sensitive strategy for base excision repair enzyme activity detection based on graphene oxide mediated fluorescence quenching and hybridization chain reaction. Analyst. 141 (1), 96-99 (2016).
  21. Liu, X., et al. A novel electrochemical biosensor for label-free detection of uracil DNA glycosylase activity based on enzyme-catalyzed removal of uracil bases inducing strand release. Electrochimica Acta. 113, 514-518 (2013).
  22. McWilliams, M. A., Anka, F. H., Balkus, K. J., Slinker, J. D. Sensitive and selective real-time electrochemical monitoring of DNA repair. Biosensors and Bioelectronics. 54, 541-546 (2014).
  23. Jiao, F., et al. A novel and label-free biosensors for uracil-DNA glycosylase activity based on the electrochemical oxidation of guanine bases at the graphene modified electrode. Talanta. 147, 98-102 (2016).
  24. Liu, X., et al. Label-free colorimetric assay for base excision repair enzyme activity based on nicking enzyme assisted signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 54, 598-602 (2014).
  25. Nie, H., Wang, W., Li, W., Nie, Z., Yao, S. A colorimetric and smartphone readable method for uracil-DNA glycosylase detection based on the target-triggered formation of G-quadruplex. Analyst. 140 (8), 2771-2777 (2015).
  26. Du, Y. C., Jiang, H. X., Huo, Y. F., Han, G. M., Kong, D. M. Optimization of strand displacement amplification-sensitized G-quadruplex DNAzyme-based sensing system and its application in activity detection of uracil-DNA glycosylase. Biosensors and Bioelectronics. 77, 971-977 (2016).
  27. Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
  28. Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), 155(2003).
  29. Cui, Z., Theruvathu, J. A., Farrel, A., Burdzy, A., Sowers, L. C. Characterization of synthetic oligonucleotides containing biologically important modified bases by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 379 (2), 196-207 (2008).
  30. Darwanto, A., Farrel, A., Rogstad, D. K., Sowers, L. C. Characterization of DNA glycosylase activity by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 394 (1), 13-23 (2009).
  31. Redrejo-Rodríguez, M., et al. New insights in the removal of the Hydantoins, oxidation product of pyrimidines, via the base excision and Nucleotide incision repair pathways. PLoS ONE. 6 (7), 21039(2011).
  32. Prorok, P., et al. Uracil in duplex DNA is a substrate for the nucleotide incision repair pathway in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 3695-3703 (2013).
  33. Alexeeva, M., et al. Excision of uracil from DNA by hSMUG1 includes strand incision and processing. Nucleic Acids Research. 47 (2), 779-793 (2019).
  34. Thapar, U., Demple, B. Deployment of DNA polymerases beta and lambda in single-nucleotide and multinucleotide pathways of mammalian base excision DNA repair. DNA Repair. 76, 11-19 (2019).
  35. Su, K. Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (136), e57862(2018).
  36. Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers. Analytical Chemistry. 63 (24), 1193-1202 (1991).
  37. Brammer, K. W., Jones, A. S., Mian, A. M., Walker, R. T. Study of the use of alkaline degradation of DNA derivative as a procedure for the determination of nucleotide distribution. Biochimica et Biophysica Acta. 166 (3), 732-734 (1968).
  38. Lindahl, T., Ljungquist, S., Siegert, W., Nyberg, B., Sperens, B. DNA N-glycosidases: properties of uracil-DNA glycosidase from Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 252 (10), 3286-3294 (1977).
  39. Rashtchian, A., Buchman, G. W., Schuster, D. M., Berninger, M. S. Uracil DNA glycosylase-mediated cloning of polymerasechain reaction-amplified DNA: Application to genomic and cDNA cloning. Analytical Biochemistry. 206 (1), 91-97 (1992).
  40. Varshney, U., van de Sande, J. H. Specificities and kinetics of uracil excision from uracil-containing DNA oligomers by Escherichia coli uracil DNA glycosylase. Biochemistry. 30 (16), 4055-4061 (1991).
  41. Delort, A. M., et al. Excision of uracil residues in DNA: Mechanism of action of Escherichia coli and Micrococcus luteus uracil-DNA glycosylases. Nucleic Acids Research. 13 (2), 319-335 (1985).
  42. Wang, Z. G., Smith, D. G., Mosbaugh, D. W. Overproduction and characterization of the uracil-DNA glycosylase inhibitor of bacteriophage PBS2. Gene. 99 (1), 31-37 (1991).
  43. Chang, H. L., et al. Measurement of uracil-DNA glycosylase activity by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry technique. DNA Repair. 97, 103028(2021).
  44. Minko, I. G., et al. Catalysts of DNA strand cleavage at apurinic/apyrimidinic sites. Scientific Reports. 6 (1), 28894(2016).
  45. Lindahl, T. Uracil-DNA glycosylase from Escherichia coli. Methods in Enzymology. 65, 284-290 (1980).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Масс-спектрометрия MALDI-TOFэксцизионная репарация основанийдетекция AP-сайтовмеханизмы репарации ДНКгидролиз урациласкрининг ингибиторов гликозилазсинтетический дуплекс ДНКанализ ферментативной активности
Анализ урацил-ДНК-гликозилазы с помощью матрицы лазерной десорбции/ионизации Масс-спектрометрии времени пролета
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.