Сбор, расширение и дифференциация первичных моделей эпителиальных клеток носа человека для количественной оценки частоты биения ресничек

Katelin M. Allan; Sharon L. Wong; Laura K. Fawcett; Alexander Capraro; Adam Jaffe; Cristan Herbert; Elvis Pandzic; Shafagh A. Waters

doi:10.3791/63090

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Сбор, расширение и дифференциация первичных моделей эпителиальных клеток носа человека для количественной оценки частоты биения ресничек

4.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63090

⸱

10 ноября 2021 г.

Katelin M. Allan¹^,² , Sharon L. Wong¹^,² , Laura K. Fawcett¹^,²^,³ , Alexander Capraro¹^,² , Adam Jaffe¹^,²^,³ , Cristan Herbert⁴ , Elvis Pandzic⁵ , Shafagh A. Waters¹^,²^,³

¹School of Women's and Children's Health, Faculty of Medicine and Health, University of New South Wales, ²Molecular and Integrative Cystic Fibrosis Research Centre (miCF RC), Faculty of Medicine and Health, University of New South Wales, ³Department of Respiratory Medicine, Sydney Children's Hospital, ⁴Department of Pathology, School of Medical Sciences, University of New South Wales Australia, ⁵Katharina Gaus Light Microscopy Facility, Mark Wainwright Analytical Centre, University of New South Wales

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает сбор, расширение и дифференцировку эпителиальных клеток носа в органотипические модели эпителиальных клеток дыхательных путей и количественную оценку частоты биения ресничек с помощью визуализации живых клеток и специально разработанных сценариев.

Аннотация

Измерения функции ресничек (частота ударов, рисунок) были установлены в качестве диагностических инструментов для респираторных заболеваний, таких как первичная цилиарная дискинезия. Однако более широкое применение этих методов ограничено крайней восприимчивостью цилиарной функции к изменениям факторов окружающей среды, таких как температура, влажность и рН. В дыхательных путях пациентов с муковисцидозом (МВ) накопление слизи препятствует биению ресничек. Функция ресничек была исследована в моделях первичных клеток дыхательных путей в качестве индикатора активности канала трансмембранного регулятора проводимости CF (CFTR). Тем не менее, значительная вариабельность частоты биения ресничек была обнаружена в ответ на препараты, модулирующие CFTR, даже для пациентов с теми же мутациями CFTR . Кроме того, влияние дисфункциональной секреции хлоридов, регулируемой CFTR, на цилиарную функцию плохо изучено. В настоящее время не существует всеобъемлющего протокола, демонстрирующего пробоподготовку моделей дыхательных путей in vitro , получение изображений и анализ частоты биения ресничек (CBF). Стандартизированные условия культивирования и получение изображений, выполняемые в экологически контролируемых условиях, позволят обеспечить последовательную, воспроизводимую количественную оценку CBF между отдельными лицами и в ответ на препараты, модулирующие CFTR. Этот протокол описывает количественную оценку CBF в трех различных системах моделей эпителиальных клеток дыхательных путей: 1) нативные эпителиальные листы, 2) модели интерфейса воздух-жидкость, изображенные на проницаемых опорных вставках, и 3) внеклеточные матрикс-встроенные трехмерные органоиды. Последние два воспроизводят физиологию легких in vivo , с биением ресничек и выработкой слизи. Цилиарная функция захватывается с помощью высокоскоростной видеокамеры в камере, контролируемой окружающей средой. Для анализа CBF используются пользовательские скрипты. Предполагается, что перевод измерений CBF в клинику станет важным клиническим инструментом для прогнозирования ответа на CFTR-модулирующие препараты на основе каждого пациента.

Введение

Измерения частоты биения ресничек (CBF) и паттерна были установлены в качестве диагностических инструментов для респираторных заболеваний, таких как первичная цилиарная дискинезия (PCD)¹. При муковисцидозе (МВ) дисфункция хлоридного канала регулятора трансмембранной проводимости CF (CFTR) вызывает обезвоживание жидкости поверхности дыхательных путей и нарушение мукоцилиарного клиренса². Цилиарная функция была исследована in vitro в моделях первичных клеток дыхательных путей в качестве индикатора активности канала CFTR³. Тем не менее, значительная вариабельность между пациентами существует....