Здесь мы описываем протокол для создания органоидов сердца человека (hHO), имеющих отношение к развитию, эффективно используя плюрипотентные стволовые клетки человека путем самоорганизации. Протокол опирается на последовательную активацию сигналов развития и производит очень сложные, функционально значимые ткани сердца человека.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Создание самособирающихся органоидов человеческого сердца, полученных из плюрипотентных стволовых клеток
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Способность изучать развитие сердца человека в области здоровья и болезней сильно ограничена способностью моделировать сложность человеческого сердца in vitro. Разработка более эффективных органоподобных платформ, которые могут моделировать сложные фенотипы in vivo , такие как органоиды и органы на чипе, повысит способность изучать развитие сердца и болезни человека. В этой статье описывается протокол генерации очень сложных органоидов сердца человека (hHO) путем самоорганизации с использованием плюрипотентных стволовых клеток человека и ступенчатой активации путей развития с использованием ингибиторов малых молекул. Эмбриоидные тела (ЭБ) генерируются в 96-луночной пластине с круглодонными, сверхнизкими прикрепленными колодцами, что облегчает культуру суспензии индивидуализированных конструкций.
ЭБ подвергаются дифференцировке в hHO с помощью трехступенчатой стратегии модуляции сигналов Wnt, которая включает в себя начальную активацию пути Wnt, чтобы вызвать судьбу сердечной мезодермы, второй шаг ингибирования Wnt для создания окончательных сердечных линий и третий шаг активации Wnt для индуцирования тканей проэпикардиальных органов. Эти этапы, выполненные в формате 96 лунок, являются высокоэффективными, воспроизводимыми и производят большое количество органоидов за прогон. Анализ с помощью иммунофлуоресцентной визуализации с 3 по 11 день дифференцировки выявляет особенности первого и второго полей сердца и очень сложные ткани внутри hHO на 15-й день, включая ткань миокарда с областями предсердных и желудочковых кардиомиоцитов, а также внутренние камеры, выстланные тканью эндокарда. Органоиды также демонстрируют сложную сосудистую сеть по всей структуре и внешнюю оболочку эпикардиальной ткани. С функциональной точки зрения hHO уверенно бьются и представляют нормальную активность кальция, как определено с помощью живой визуализации Fluo-4. В целом, этот протокол представляет собой прочную платформу для исследований in vitro в органоподобных сердечных тканях человека.
Введение
Врожденные пороки сердца (ИБС) являются наиболее распространенным типом врожденных дефектов у людей и затрагивают примерно 1% всех живорождений1,2,3. В большинстве случаев причины ИБС остаются неизвестными. Способность создавать модели человеческого сердца в лаборатории, которые очень похожи на развивающееся человеческое сердце, представляет собой значительный шаг вперед для непосредственного изучения основных причин ИБС у людей, а не у суррогатных животных моделей.
Воплощением лабораторно выращенных моделей тканей являются органоиды, 3D-клеточные ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Культура и обслуживание hPSC
ПРИМЕЧАНИЕ: Индуцированные человеком PSC (hiPSCs) или эмбриональные стволовые клетки человека (hESCs) необходимо культивировать в течение по крайней мере 2 последовательных проходов после оттаивания, прежде чем их использовать для генерации ЭБ для дифференцировки или дальнейшей криоконсервации. hPSCs культивируют в среде PSC (см. Таблицу материалов) на 6-луночных культуральных пластинах с покрытием из 6 скважин с базальной мембраной-внеклеточным матриксом (BM-ECM). При выполнении изменений среды на гПСК в 6-луночных пластинах добавляйте среду непосредственно на внутреннюю сторону скважины, а не....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для достижения самоорганизующегося hHO in vitro мы модифицировали и комбинировали протоколы дифференцировки, ранее описанные для 2D-монослойной дифференцировки кардиомиоцитов21 и эпикардиальных клеток22 с использованием модуляторов пути Wnt и для 3D-прекардиальных органоидов16 с использованием факторов роста BMP4 и Activin A. Использование 96-луночной пластинки EB и протокола дифференцировки hHO, описанного здесь и показанного
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Последние достижения в области кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток человека, и других клеток сердечного происхождения были использованы для моделирования развития сердца человека22,24,25 и болезней26,27,28 и в качестве инструментов для скрининга терапевтических средств29,30.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.
Благодарности
Эта работа была поддержана Национальным институтом сердца, легких и крови Национальных институтов здравоохранения под номерами K01HL135464 и R01HL151505 и Американской кардиологической ассоциацией под номером 19IPLOI34660342. Мы хотим поблагодарить MSU Advanced Microscopy Core и доктора Уильяма Джексона на кафедре фармакологии и токсикологии МГУ за доступ к конфокальным микроскопам, IQ Microscopy Core и MSU Genomics Core за услуги секвенирования. Мы также хотели бы поблагодарить всех членов Лаборатории Агирре за их ценные замечания и советы.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Антитела | |||
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse | Invitrogen | A-21202 | 1:200 |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-rabbit | Invitrogen | A-21206 | 1:200 |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse | Invitrogen | A-21203 | 1:200 |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit | Invitrogen | A-21207 | 1:200 |
| Alexa Fluor 647 Осел против козы | Invitrogen | A32849 | 1:200 |
| HAND1 | Abcam | ab196622 | Кролик; 1:200 |
| HAND2 | Abcam | ab200040 | Кролик; 1:200 |
| NFAT2 | Abcam | ab25916 | Кролик; 1:100 |
| PECAM1 | DSHB | P2B1 | Кролик; 1:50 |
| TNNT2 | Abcam | ab8295 | Мышь; 1:200 |
| THY1 | Abcam | ab133350 | Кролик; 1:200 |
| TJP1 | Invitrogen | PA5-19090 | Коза; 1:250 |
| VIM | Abcam | ab11256 | Коза; 1:250 |
| WT1 | Abcam | ab89901 | Кролик; 1:200 |
| Медиа и реагенты | |||
| Accutase | Innovative Cell Technologies | NC9464543 | реагент для диссоциации клеток |
| Activin A | R& D Systems | 338AC010 | |
| Добавка B-27 (за вычетом инсулина) | Gibco | A1895601 | безинсулиновая добавка для клеточных культур |
| B-27 Добавка | Gibco | 17504-044 | Добавка для клеточных культур |
| BMP-4 | Gibco | PHC9534 | |
| бычьей сыворотки Альбумин Bioworld | 50253966 | ||
| CHIR-99021 | Selleck | 442310 | |
| D-(-)-фруктоза | миллипоры Sigma | F0127 | |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | 1:1000 |
| Диметилсульфоксид | Миллипор Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10566016 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Gibco | A2858501 | среда плюрипотентных стволовых клеток (ПСК), содержащая 1% пенициллин-стрептомицин |
| Fluo4-AM | Invitrogen | F14201 | |
| Глицерин | Millipore Sigma | G5516 | |
| Глицин | Millipore Sigma | 410225 | |
| Matrigel GFR | Corning | CB40230 | Базальная мембрана внеклеточного матрикса (BM-ECM) |
| Нормальная ослиная сыворотка | Millipore Sigma | S30-100mL | |
| Параформальдегид | MP Biomedicals | IC15014601 | порошок, растворенный в буфере PBS – используйте в концентрации 4% |
| пенициллин-стрептомицин | Gibco | 15140122 | |
| раствор фосфатного буфера | Gibco | 10010049 | |
| фосфатный буферный раствор (10x) | Gibco | 70011044 | |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 73155 | 90 &микро; m |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | NC0729236 | диссоциационный реагент для hPSCs |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| тиазовивин | Millipore Sigma | SML1045 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 1525006 | |
| VECTASHIELD Vibrance Antifade Монтаж средних | векторных лабораторий | H170010 | |
| WNT-C59 | Selleck | NC0710557 | |
| других | |||
| микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл | Fisher Scientific | 02682002 | |
| пробирок Falcon 15 мл | Fisher Scientific | 1495970C | |
| 2 мл криогенных флаконов | Corning | 13-700-500 | |
| 50 мл Резервуары для реагентов | Fisherbrand | 13681502 | |
| 6-луночные планшеты для культивирования клеток с плоским дном | Corning | 0720083 | |
| 8 Хорошо камерное защитное стекло с #1.5 Высокоэффективное покровное стекло Cellvis | C8-1.5H-N | ||
| 96-луночный прозрачный ультра низкий уровень прикрепления Микропланшеты | Costar | 07201680 | |
| ImageJ | NIH | Изображение программное обеспечение для обработки | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666 | лабораторные салфетки |
| Micro Cover Glass | VWR | 48393-241 | 24 x 50 мм No1.5 |
| Предметные стекла для микроскопа | Fisherbrand | 1255015 | |
| Moxi Cell Counter | Orflo Technologies | MXZ001 | |
| Кассета для подсчета ячеек Moxi Z – Тип M | Orflo Технологии | MXC001 | |
| Многоканальные пипетки | Fisherbrand | FBE1200300 | 30-300 & микро; L |
| Olympus cellVivo | Olympus | For Caclium Imaging, анализ с помощью Imagej | |
| Sorvall Legend X1 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004261 | |
| Термомиксер | ThermoFisher Scientific | 13-687-717 | |
| Top Coat Nail Varish | Seche Vite | Можно приобрести в любом супермаркете |
Ссылки
- Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
